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计的调查分析方法，使得村民感知和专家知识有效互补、村民
利益和各方利益合理均衡、村民诉求和设计成果有机衔接，有
效提高项目设计的实用性。通过沈家村景观设计项目的开
展，把村民参与意识最大化体现在项目方案编制的过程中，将
乡村原始要素融入现代旅游休闲产业，实现乡村景观文化性、
体验性、经济性的有机统一，可为将来乡村景观设计提供一定
参考和借鉴。
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doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2016． 06． 082
台湾泡桐体细胞同源四倍体的诱导及鉴定
张变莉1，王 杨2，刘荣宁1，范国强2
(1．河南农业职业学院，河南中牟 451450;2．河南农业大学泡桐研究所，河南郑州 450002)
摘要:将台湾泡桐叶片愈伤组织放置于含有不同质量浓度秋水仙素的液体培养基上进行四倍体植株的诱导，采用
根尖细胞染色体计数和叶片单细胞 DNA含量测定的方法进行倍性分析。结果表明，在 27 个试验组合中，用 30 mg /L
秋水仙素处理预培养 6 d的台湾泡桐叶片 48 h时，四倍体诱导率最高，为 5． 83%。根尖染色体压片结果也表明，台湾
泡桐二倍体染色体数为 2n = 2x = 40，四倍体为 2n = 4x = 80。此外，与二倍体相比，诱变出的四倍体植株，具有生长慢、
茎加粗、叶片增宽、单个气孔面积增大、气孔密度减少等特征。
关键词:台湾泡桐;叶片;秋水仙素;四倍体
中图分类号:S792． 430． 4 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2016)06 － 0290 － 04
收稿日期:2016 － 04 － 21
基金项目:河南省杰出人才创新基金(编号:321001700);河南省高校
杰出科研人才工程基金(编号:2002KYC － 003);河南省郑州市普
通科技攻关项目(编号:153PKJGG423)。
作者简介:张变莉(1982—)，女，河南通许人，硕士，讲师，主要从事园
林绿化及林木生物技术的教学和科研工作。E － mail:kfzbl @
163． com。
通信作者:范国强，博士，教授，主要从事泡桐丰产栽培理论与生物技
术研究。E － mail:gqfan@ henau． edu． cn。
植物多倍体具有抗逆性和适应性强等特点，能满足生产
上高产、优质、抗病虫害等要求，而且作为遗传桥梁，对开展目
的基因渐渗和转移研究具有重要意义。目前，人工诱导植物
多倍体已在杨树、桑树等林木树种［ 1 － 12］上取得突破。泡桐在
我国有着悠久的栽培历史，由于其生长快、用途广，广受栽培
者的欢迎。然而，泡桐丛枝病的频发及“久治不愈”严重影响
了其大面积栽植和应用。近年来，范国强等［13 － 18］成功诱导了
同源四倍体兰考、白花、南方、豫杂一号等植株，但目前有关台
湾泡桐四倍体诱导研究鲜见报道。本试验以台湾泡桐组培苗
叶片为材料，采用不同质量浓度秋水仙素对其进行了同源四
倍体诱导，为丰富泡桐四倍体种质资源奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
本试验所用材料为河南农业大学林业试验站的台湾泡桐
种子，采集后，先用 70%乙醇消毒 30 s，再用 0． 1% HgCl2消毒
5 min，取出后，无菌水冲洗 3 ～ 5 次，之后将种子晾干，置于装
有 40 mL MS 培养基 (含 3． 0 g /L琼脂粉、25 g /L蔗糖)的三
角瓶中，在培养箱［温度(25 ± 2)℃，光照时间为 16 h /d，光
照度为 130 μmol /(m2·s)］内培养。将生长 80 d 的同一株
台湾泡桐组培苗上部 2 片完全展开叶片置于其器官直接发生
的培养基［19］上增殖后，取其叶片待用。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 台湾泡桐叶片的预培养 取台湾泡桐组培苗自顶部
向下数的第 2 ～ 4 对叶片，剪成 1． 0 cm × 1． 0 cm小块，分别置
—092— 江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 6 期
于装有 40 mL的 MS +0． 1 mg /L NAA + 16． 0 mg /L 6 － BA 的
培养基［19］的三角瓶中，在 20 ℃的黑暗条件下进行不同时间
(表 1)的预培养。
1． 2． 2 秋水仙素诱导台湾泡桐四倍体植株 将上述预培养
不同时间的外植体(台湾泡桐叶块)分别接种于含有秋水仙
素液体培养基［19］的三角瓶中，并按照设计组合(表 1)置于
20 ℃ 的黑暗条件下进行四倍体诱导。诱导结束后，无菌水冲
洗叶片 3 ～ 5 次，再将叶片表面水分用无菌滤纸吸干，之后转
入不含秋水仙素的 MS + 0． 1 mg /L NAA + 16． 0 mg /L 6 － BA
的培养基上，于光照度为 130 μmol /(m2· s)、光照时间为
16 h /d、温度为 25 ℃的培养室内进行芽诱导，每处理 30 瓶，
每瓶 2 个叶块。15 d后，统计台湾泡桐外植体存活数，30 d后
统计外植体出芽数，并计算其存活率［(存活的外植体个数 /
接种外植体总数)× 100%］和芽诱导率［(诱导出芽外植体
数 /接种外植体总数)× 100%］。将诱导后长至 2 cm 的幼芽
剪下，接种于 1 /2 MS 培养基上诱导生根，每 30 d 继代培养 1
次，共继代 5 次。
第 5 次继代苗培养后，幼芽根长至 1． 5 ～ 2． 0 cm时，先剪
其根尖制成压片［20］用于观察染色体的加倍情况，再用流式细
胞仪［21］确认秋水仙素诱变的台湾泡桐幼苗的倍性，并计算其
四倍体诱导率(流式细胞仪检测四倍体幼芽数 /外植体诱导
出的总芽数)。每组试验重复 2 次，数据采用 SPSS 软件处
理，并进行 F检验。
1． 2． 3 台湾泡桐四倍体植株的鉴定 (1)幼苗根尖染色体
计数。台湾泡桐二倍体幼苗及秋水仙素诱导变异幼苗的根尖
细胞染色体观察参照舒寿兰等［ 20］的方法。在尼康 TS － 100
荧光倒置显微镜(2 000 ×)下，观察上述根尖临时压片中的染
色体条数并拍照。(2)叶片单细胞 DNA 相对含量测定。分
别将染色体加倍的及普通二倍体的台湾泡桐叶片各 50 mg 置
于 2 mL缓冲液Ⅰ(0． 5% T ween 和浓度为 0． 1 mol /L 的柠檬
酸)中，然后用剪刀或锋利的刀片将其切碎，用 300 目尼龙网
过滤至 BD专用试管中，重复过滤 2 次去除杂质。留取 1 mL
滤液置于转速为 1 500 r /min 的离心机中 4 ℃离心 5 min，弃
除上清液，并加入 1 mL鞘液轻微摇匀，然后再置入上述转速
离心机中 4 ℃ 离心 5 min。倒掉上清液，在沉淀中加入
0． 5 mL 仪器所带荧光染色液，轻微振荡摇匀后避光放置
30 min，以便充分染色。然后用 300 目滤网过滤 1 次至试管
中，用于测定叶片单细胞 DNA相对含量。
1． 2． 4 植株形态特征比较 观察并记录上面生长 30 d 第 5
次继代的四倍体和二倍体台湾泡桐幼苗叶形、叶色等差异。
每一指标测定 10 个样品，求其平均值。
1． 2． 5 表皮细胞气孔器的比较 取苗龄 60 d的四倍体和二
倍体台湾泡桐组培苗成熟叶片，放置于质量分数 5% 的 KOH
溶液中煮沸 3 ～ 5 min，然后置于冷水中。先在载玻片上滴一
滴清水，再用镊子挑取其表皮并展平放于载玻片的水滴上，用
滤纸吸去过多的水分。然后盖上盖玻片并用目镜中带有测微
尺镜头的显微镜观察，在 100 × 10 的油镜下观察测量每个气
孔器的长度、宽度和气孔器个数，计算气孔器密度，3 次重复，
取平均值。
2 结果与分析
2． 1 不同浓度秋水仙素处理对台湾泡桐四倍体诱导的影响
从表 1 试验数据及统计结果可以看出，不同预培养时间
及不同浓度、不同处理时间的秋水仙素诱导对台湾泡桐四倍
体诱导率、芽诱导率和外植体存活率均有不同影响。当秋水
仙素浓度是 10 mg /L 时，伴随预培养时间和秋水仙素诱导时
间的延长，四倍体诱导率、芽诱导率和外植体存活率均表现出
明显不同。其中，组合 11 的四倍体诱导率、芽诱导率和外植
体存活率分别为 6． 90%、20． 58%及 49． 11%。当秋水仙素浓
度为 20 mg /L 时，组合 13 的四倍体诱导率、芽诱导率及外植
体存活率均达到最高。当秋水仙素浓度为 30 mg /L 时，组合
16 的四倍体诱导率、芽诱导率和外植体存活率达到最大，分
别为 3. 45%、11． 94%及 32． 83%。综上所述，当秋水仙素浓
度不断增大，台湾泡桐叶片(外植体)的最高四倍体诱导率及
芽诱导率、存活率基本呈现下降趋势，并且秋水仙素浓度对四
倍体诱导率、芽诱导率及外植体存活率的影响均极显著;秋水
仙素处理外植体的时间对外植体存活率、芽诱导率的影响均
极显著;外植体的预培养时间对芽诱导率的影响显著，而对四
倍体诱导率的影响则不显著(表 2 )。这表明，台湾泡桐最高
四倍体诱导率的产生是外植体预培养时间、处理时间及秋水
仙素浓度共同作用的结果。因此，选择组合 11(6 d预培养 +
10 mg /L 秋水仙素 + 48 h处理)，作为台湾泡桐四倍体诱导的
最佳组合。
表 1 不同浓度秋水仙素处理对台湾泡桐四倍体诱导的影响
组合
预培
养时
间(h)
秋水仙
素浓度
(mg /L)
处理
时间
(h)
外植体
存活率
(%)
芽诱
导率
(%)
四倍体
诱导率
(%)
1 0 10 24 58． 33abc 16． 67bcdefg 3． 33ab
2 0 10 48 52． 02abcd 20． 35abcde 3． 38ab
3 0 10 72 46． 28cde 12． 40cdefgh 2． 49ab
4 0 20 24 47． 84bcde 15． 68bcdefg 1． 74ab
5 0 20 48 37． 50efgh 15． 00cdefgh 5． 00ab
6 0 20 72 20． 16jklmn 9． 25fghij 0． 85ab
7 0 30 24 31． 48ghij 10． 18efghij 0． 82ab
8 0 30 48 18． 33klmn 10． 00fghij 0． 83ab
9 0 30 72 11． 67mno 5． 00hij 0． 00b
10 6 10 24 62． 50a 27． 50a 4． 17ab
11 6 10 48 49． 11bcde 20． 58abcd 6． 90a
12 6 10 72 44． 17def 18． 33abcdef 5． 00ab
13 6 20 24 46． 82bcde 25． 74ab 6． 46ab
14 6 20 48 43． 06defg 20． 73abcd 5． 96ab
15 6 20 72 23． 33ijklm 10． 83defghi 0． 83ab
16 6 30 24 32． 83fghi 11． 94defgh 3． 45ab
17 6 30 48 14． 31lmno 7． 58ghij 2． 54ab
18 6 30 72 9． 60no 0． 81ij 0． 00b
19 12 10 24 63． 33a 27． 50a 1． 67ab
20 12 10 48 58． 60ab 22． 38abc 1． 73ab
21 12 10 72 45． 00de 14． 17cdefgh 0． 83ab
22 12 20 24 49． 23bcde 20． 83abcd 2． 56ab
23 12 20 48 41． 35defg 13． 22cdefgh 0． 82ab
24 12 20 72 29． 17hijk 6． 67ghij 0． 00b
25 12 30 24 24． 44ijkl 9． 80fghij 0． 79ab
26 12 30 48 14． 74lmno 5． 22hij 0． 88ab
27 12 30 72 4． 20o 0． 00j 0． 00b
注:表中所有数据为 2 次重复平均值;数据采用邓肯氏新复极差
测验法，同列不同字母表示在 α = 0． 05 水平上差异显著。
—192—江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 6 期
表 2 秋水仙素诱导台湾泡桐四倍体的方差分析
方差来源
外植体存活率 芽诱导率 四倍体诱导率
MS F MS F MS F
预培养时间 2． 4 0． 09 55． 01 3． 006* 38． 776 5． 489
秋水仙素浓度 5 633． 058 211． 021＊＊ 814． 759 44． 520＊＊ 24． 331 3． 444＊＊
处理时间 1 866． 310 69． 914＊＊ 447． 278 24． 440＊＊ 20． 772 2． 933*
注:* ，0． 01≤P ＜ 0． 05;＊＊，0． 001≤P ＜ 0． 01。
2． 2 四倍体台湾泡桐植株的鉴定
2． 2． 1 根尖染色体观察 观察显微镜下根尖临时压片显示，
变异的台湾泡桐幼苗根尖细胞染色体为 2n = 4x = 80，正常台
湾泡桐二倍体的根尖细胞染色体为 2n = 2x = 40(图 1)。染
色体观察结果显示，秋水仙素诱变的台湾桐幼苗细胞中，染色
体数均是正常二倍体的 2 倍。
2． 2． 2 叶片单细胞 DNA含量检测 流式细胞仪检测继代 5
次的台湾泡桐变异幼苗和二倍体幼苗叶片单细胞 DNA 相对
含量的检测结果(图 2)表明，台湾泡桐二倍体幼苗只在相对
荧光强度值为 50 的位置上出现 1 个单峰，而经秋水仙素处理
后也仅在接近 100 的位置上出现 1 个单峰，即变异幼苗叶片
单细胞 DNA含量为其二倍体叶片的 2 倍。综上所述，秋水仙
素诱导获得的台湾泡桐变异幼苗为其同源四倍体幼苗。
2． 3 台湾泡桐二倍体与同源四倍体幼苗的形态比较
由图 3 和表 3 可知，四倍体较二倍体幼苗叶色变深，叶片
变厚、增大，长宽比变小。另外，与二倍体相比，台湾泡桐四倍
体叶片的气孔变大，但其叶片的气孔器密度变小。
3 讨论
众所周知，当今植物多倍体诱导中效果最好、应用最广泛
的化学诱变剂是秋水仙素，它在植物多倍体诱导中具有非常
重要的作用［22 － 23］。本试验结果表明，组合 11 是台湾泡桐四
倍体诱导率最高的组合，即将台湾泡桐叶片预培养 6 d后，再
在浓度为 10 mg /L秋水仙素的液体培养基上诱导 48 h，四倍
体诱导率达到最高，为 6． 90%。这与在兰考泡桐、白花泡桐
和南方泡桐等叶片上得到的情况［13 － 18］有一定差异，台湾泡桐
四倍体诱导率有显著下降。这可能是将台湾泡桐叶片直接浸
泡于秋水仙素液体培养基中，造成其在较短时间内对外植体
产生毒害作用，降低了外植体的存活率和芽诱导率，因而造成
四倍体诱导率的显著下降。但是，与其他种类泡桐四倍体诱
导所采用的双层培养基法相比，上述方法减少了一定的工作
量，加快了诱导的速度，对于需要快速获得四倍体植株的植物
种类，液体浸泡的方法是比较好的选择。此外，在本试验中，
采用组合 11 处理后获得的诱变植株大部分为四倍体，并且这
些四倍体能够稳定地遗传，其原因可能是用 10 mg /L 秋水仙
素处理预培养 6 d的台湾泡桐叶片 48 h时，由于叶片较薄，细
胞分裂旺盛、分裂的同步性好，此时秋水仙素易抑制纺锤丝的
形成，从而导致大量的细胞染色体加倍，这样，获得变异植株
中出现嵌合体的概率就小。
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—292— 江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 6 期
表 3 台湾泡桐二倍体和四倍体叶片形态及气孔的变化
倍性
叶片长
(cm)
叶片宽
(cm) 叶片长 /宽
气孔器长
(μm)
气孔器宽
(μm)
气孔器
长 /宽
气孔密度
(个 /mm2)
气孔密
度比
2x 3． 48 ± 0． 19a 2． 58 ± 0． 15b 1． 35 ± 0． 05a 21． 92 ± 0． 04b 17． 02 ± 0． 03a 1． 29 ± 0． 19a 602． 04 ± 26． 35a 1． 79
4x 3． 67 ± 0． 49a 3． 12 ± 0． 36a 1． 18 ± 0． 14b 31． 61 ± 0． 05a 25． 73 ± 0． 04a 1． 23 ± 0． 07b 336． 73 ± 58． 91b
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