全 文 ：应用 ITS序列分析新疆濒危植物盐桦的系统发育
梅新娣 ,张富春＊
(新疆大学生命科学与技术学院 , 新疆生物资源基因工程国家重点实验室基地 , 新疆 乌鲁木齐 830046)
摘要:目的:依据 ITS 序列分析新疆濒危植物盐桦的系统发育。 方法:运用 PCR直接测序法 , 对珍稀濒危植物盐桦(Betula
halophila)的 nrDNA的 ITS 区(包括 ITS-l , 5.8SrDNA 和 ITS-2)进行序列测定 , 并与 GenBank 中提取的 17 种桦木科桦木属植物的
ITS 区序列进行了组合分析 。结果:盐桦的 ITS 序列和已公布的17种桦木科桦木属植物的 ITS 区序列差别不大 , 同源性在99.67%
～ 99.01%之间。采用 clustalx软件对盐桦和 17 种桦木属植物的 ITS 区序列进行系统发育分析 , 构建了桦木属植物的 ITS 分子系
统树 , 18种桦木科桦木属植物形成三个分支 ,盐桦与 Betula alnoides、Betula populifolia 、Betula pubescens同为一支。结论:盐桦在桦木
科桦木属内有独特的分类地位。
关键词:盐桦;桦木属;ITS;系统发育
中图分类号:S323　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2008)06-0004-03
Phylogeny of Endangered Plant Species-Betula halophila in Xinjiang
Inferred from ITS Sequence Data
MEI Xin-di ,ZHANG Fu-chun＊
(College of Life Science and Technology , Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering , Xinjiang University , Urumqi 830046, China)
Abstract:Objective:To investigate the phylogeny of endangered plant species-Betula halophila in Xinjiang inferred from Internal transcribed
spacer(ITS)sequence.Method:The sequences of nrDNA in ITS area(including ITS -1 , 5.8SrDNA and ITS - 2)of Betula halophila were
amplified with PCR and analyzed.Result:The difference of the sequence in ITS area between Betula halophila and other 17 Betula L.Plants was
not significant , the homology was from 99.67.0% to 99.01%.With clustalx analysis , the phylogenetic trees were constructed based on Betula
halophila ITS sequences.The data set of ITS sequences from 18 Betula L.Plants was divided into three classes , Betula halophila was belong to
the same class with Betula alnoides , Betula pendula , Betula populifolia , Betula alba , Betula nana.Conclusion:The results suggested that Betula
halophila had its own distinctive classification status.
Key words:Betula halophila;Betula L;ITS sequence;evolution system;classification status;phylogeny
收稿日期:2008-08-06;修回日期:2008-08-26
基金项目:国家自然科学基金项目资助(No.30460015)
作者简介:梅新娣 , 女 ,硕士 , Email:mxdxju@126.com;＊通讯作者:张
富春 ,男 ,教授 ,博士生导师 , Emai l:zfcxju@xju.edu.cn。
　　盐桦(Betula halophila)是由秦仁昌教授(1984)在新疆阿勒
泰巴里巴盖采集并命名。目前 , 盐桦被列为国家二级珍稀濒
危植物 , 载入中国濒危植物红皮书 , 据书内记载 , 盐桦在新疆
阿勒泰只有 1 株。1999 年被列为国家重点保护野生植物(二
级)[1] 。陶玲等以分布区 、分类学地位 、生物学特性和利用价
值四个指标对中国 50 种荒漠植物进行珍稀濒危程度的综合
定量评价 ,结果表明盐桦的综合评价值最高 , 被列为一级保护
种 ,可以定性描述为珍贵濒危植物 , 列为一级保护[ 2] 。我们前
期开展了盐桦组织培养方面的研究[ 3 , 4] 。盐桦植株划分的主
要依据为植株和种子的形态学 , 对盐桦的分类地位尚没有系
统的研究 ,而盐桦的分子系统发育数据尚未报道。
核糖体上的基因为多拷贝 、中度重复序列 ,一个重复单位
由 5.8S 、18S 、26S 编码区以及一些间隔区组成。 ITS(internal
transcribed spacer)区位于 18S 和 26S 基因之间 , 中部被 5.8S 一
分为二 ,即 ITS1区与 ITS2区。 5.8S 、18S 、26S 进化速率慢 , 常用
于探讨科级和科级以上等级的系统发育问题。而间隔区如
ITS 区进化速率较编码区快 ,且具有长度保守性和核苷酸序列
的高度变异性 ,该序列很容易在近缘类群间排序 , 而且丰富的
变异可在较低的分类阶元上 ,解决科内属间及属下种间关系 ,
包括近缘种关系 ,一般用于研究较低等级如属间 、种间甚至居
群间的系统关系[ 5 ,6] 。在本研究中 , 我们首次测定了盐桦的核
糖体 DNA(nrDNA)转录间隔区(ITS 区)序列 , 并结合已公布的
其它桦木科桦木属植物的 ITS 区序列 , 应用 clustalx软件分析
其系统发育。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
盐桦的落叶及枝条采自新疆阿勒泰地区阿拉哈克盐湖
边。
1.1.2　试剂
PCR产物回收试剂盒 、DNA maker、EXTaq 酶均为 Takara公
司产品 , 其它试剂均为国产分析纯试剂。
1.2　方法
1.2.1　盐桦组织 DNA提取
总 DNA提取方法采用文献报道的高盐 pH 法[ 7] 。主要步
骤如下:0.2g实验材料加液氮研磨至粉末 ,加入 3.5ml、65℃的
提取介质(100mmol L EDTA , 500mmol L NaCl , 2.5%PVP , 3%
SDS , 1%巯基乙醇 , pH 5.5)。 65℃摇床温育 30min;10 000g 离
心 10min , 取上清加入 2 3 体积 2.5mmol L 的 KAC 溶液
(pH 4.8), 4℃放置 15min;上清液用氯仿:异戊醇(24:1)抽提 2
次 ,上清液加入 1倍体积异丙醇 , -20℃放置 20min;15 000g 离
心 15min , 所得 沉淀用 70%酒精 洗 2 次 , 溶于 150μl TE
(pH 8.0)。
1.2.2　引物设计及选择
在 18SrDNA的 3′端设计引物 P1:5′-AGA AGTCGT AAC
AAG GTT TCC GTA GG-3′;在 26SrDNA的 3′端设计引物 P2:5′
-TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC-3′, 以上引物扩增的片段包
括 ITS-l 、5.8SrDNA 和 ITS-2 的序列 , 引物由 Takara公司合
成。
1.2.3　ITS 的扩增 、纯化及序列测定
以提取的盐桦组织 DNA 为模板 , 用引物 P1 和 P2 进行
PCR 扩增 , PCR 扩增参数为:94℃ 5min;94℃ 60s , 50℃ 30s ,
72℃ 50s , 35cycles;72℃ 7min。PCR扩增的产物用 0.8%的琼脂
糖凝胶电泳进行检测 , 用 PCR 片段回收试剂盒从琼脂糖凝胶
中回收 PCR产物。
1.2.4　ITS 序列测定
PCR产物送Takara 公司测序 ,用 P1和 P2 引物分别对正反
链进行测定并相互校正。
1.2.5　ITS 序列分析及系统发育分析
将获得的盐桦 ITS 序列在 GenBank 上进行 Blast , 获得已公
布的桦木科桦木属植物的 ITS 序列 , 用 clustalx 软件对桦木科
桦木属植物的 ITS 序列进行系统发育分析。
2　结果和分析
2.1　盐桦组织 DNA 提取
提取的盐桦组织 DNA用 0.7%的琼脂糖凝胶电泳进行检
测 , 结果见图 1。
4　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年 18(6)
图 1　盐桦基因组DNA电泳图
Fig.1　Electrophoresis of Genome form Betula halophila
1.DL 15000 DNA marker;2.Genome of Betula halophila.
2.2　PCR扩增 ITS
PCR扩增出约 600bp的片段(见图 2), 与预计相符。
图 2　ITS序列 PCR产物电泳图
Fig.2　Electrophoresis of ITS PCR products
1.DL 2000 DNA marker;2.ITS PCR products.
2.3　ITS 序列分析及系统发育分析
获得的盐桦 ITS 序列在GenBank上进行 Blast , 获得已公布
的 17种桦木科桦木属植物的 ITS 序列(见表 1)。
表 1　用于 ITS序列研究的桦木科桦木属植物类群 、GenBank 检索号及
同源性
Table 1　Taxa of Betula L.plants in this study , the GenBank accession num-
bers and homology of their ITS sequences
Breed variety Aceession No. Homology
Betula alba gi:17065874 99.67%
Betula alnoides gi:57335179 99.50%
Betula apoiensis gi:59724925 99.34%
Betula chinensis gi:59724928 99.34%
Betula fruticosa gi:59724932 99.50%
Betula grossa gi:59724936 99.50%
Betula humilis gi:59724937 99.67%
Betula maximowicziana gi:59724941 99.17%
Betula nana gi:38045368 99.50%
Betula occidentalis gi:59724948 99.34%
Betula papyrifera gi:59724949 99.34%
Betula pendula gi:5911768 99.50%
Betula platyphylla gi:59724951 99.67%
Betula populifolia gi:57335182 99.67%
Betula pubescens gi:59724953 99.67%
Betula pumila gi:57335180 99.50%
Betula raddeana gi:59724955 99.01%
2.3.1　ITS序列同源性分析
用 clustalx软件对盐桦和已公布的 35 种桦木科桦木属植
物的 ITS序列进行同源性分析 ,结果表明上述 ITS 序列差别不
大 , 与盐桦 ITS 序列同源性在 99.67%～ 99.01%之间(见表 1)。
2.3.2　桦木科桦木属植物的 ITS序列的系统发育分析
对上述 18 种桦木属植物的序列排列后 , 取其 606bp 的 ITS
序列(含5.8s)用 clustalx 软件进行系统发育分析 , 结果表明 , 18
种桦木属植物的 ITS 序列(含 5.8s)的同源性在之间亲缘关系
较近。对 606 个位点进行了分析 , 其中变异位点 20 个。构建
了桦木属植物的 ITS 分子系统树 , 有根分子系统树(见图 3)可
将 18 种桦木属植物分为三大支 , Betula alnoides 、Betula populifo-
lia 、Betula pubescens 与盐桦同为一亚分支 , 与盐桦遗传距离在
0.000 ～ 0.003 之间。
图 3　基于 ITS-1 、5.8SrDNA 和 ITS-2序列分析构建的桦木属植物有
根系统树
Fig.3　Phylogenetic rooted tree for Betula L.based on sequence analysis of
ITS-1 , 5.8S rDNA and ITS-2
3　讨论
3.1　ITS及 5.8SrDNA 序列分析在盐桦研究中的价值
盐桦是新疆阿勒泰地区特有的珍稀濒危植物 , 1997 年 , 阿
勒泰地区林科所与新疆农业大学林学院杨昌友教授通过调查
发现 , 在阿勒泰地区的阿拉哈克乡盐湖南北两岸有 400 株左右
的桦树分布 , 但不能确定就是盐桦。国家林业局于 1996 年始
在全国范围内组织了国家重点保护野生植物资源调查 , 历时 5
年 , 被调查的野生植物共 191 种(含变种), 盐桦 、金平桦 、秤锤
树三树种在此次调查未找到[ 8] 。新疆林科院植物调查队于
1998～ 2001 年 ,对分布在新疆境内的 62个县(市)的 14 种珍稀
濒危植物进行了野外实地调查 , 结果表明 ,盐桦为唯一一种原
生地已绝灭的类型 , 由于原生地巴尔巴盖被辟为农场而遭毁
灭 ,至今模式标本产地已难找到盐桦[9] 。盐桦仅存于中国新
疆阿勒泰地区 , 具有十分重要的科研价值和应用前景 , 一定要
重点保护和开发。 由于盐桦材料极为难得 , 原生地巴尔巴盖
被辟为农场而遭毁灭 , 很难获得盐桦的种子 ,而叶表皮 、花粉
和种子形态在桦木科植物的系统发育和分类上有重要的意
义[10] , 致使盐桦分类缺少系统的研究。
近年来 , ITS 序列分析已经广泛地应用于解决科内不同等
级的系统发育和分类问题[ 11-16] 。已有文献报道采用 ISSR(In-
ter Simple Sequence Repeat)标记技术和 RAPD标记技术对桦树
种间亲缘关系进行分析 , 对 8 种桦树(Betula)进行了亲缘关系
的分析[17 , 18] , 但未见盐桦分子系统发育方面的报道。为此 , 本
研究利用盐桦落叶枝条扦插萌发的芽尖及嫩叶为实验材料开
展系统发育和分类研究 , 对探讨盐桦在桦木属中的分类地位
及种间关系方面具有重要的参考价值。
52008 年 18(6)　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
3.2　ITS 区 PCR产物直接测序以避免 PCR扩增中的随机错误
在系统发育分析中 , ITS 区序列的测定可采用 PCR产物克
隆后测序或 PCR全部产物回收后直接测序 , 那种方法更好尚
无定论。由于 PCR扩增有一定的随机错误 , 如果所测克隆刚
好是误扩增的序列 ,就会影响结果的准确性 ,而 PCR产物直接
测序则可避免此问题 ,因为测序中所表现出的信号由处于主
导地位的产物所决定。基于以上分析 , 我们对两次 PCR 的回
收产物分别进行双向测序 , 四个测序反应的结果互相校准后
确定盐桦 ITS区序列 , 已确保其正确性。 另一方面 , PCR 全部
产物回收后直接测序也更为快捷 , 因 PCR产生的随机错误可
能使各克隆的序列出现差异 , 必须对多个克隆进行测序。因
此 ,从近几年发表的论文来看 , 无论所测 ITS 区的同步进化程
度如何 ,大家基本上都是对 PCR产物直接进行测序 ,这一方法
也取得了良好结果。
3.3　盐桦和其它桦木科桦木属植物的关系
对盐桦 ITS 序列进行序列同源性分析和系统发育分析 , 结
果表明盐桦 ITS 序列与其它桦木属植物的 ITS 序列差别不大 ,
同源性在 99.67%～ 99.01%之间。对605个位点进行了分析 ,
其中变异位点 20个 , 构建了桦木属植物的 ITS 分子系统树 , 盐
桦与 Betula alnoides 、Betula populifolia 、Betula pubescens同为一亚
分支 ,说明盐桦在桦木科桦木属内有独特的分类地位。 Betula
alnoides的 ITS 序列中 , 133 位 、407 位和 544 位的碱基为“ N”(既
碱基未确定),其中 133 位和 544 位的碱基在桦木属植物之间
即有变异 ,故盐桦和 Betula alnoides的 ITS 序列的同源性和遗
传距离尚有待于进一步确定。
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基于 ITS序列对引起中毒事故蘑菇的分子鉴定
李河
(中南林业科技大学 资源与环境学院 ,湖南 长沙 41004)
摘要:目的:对一起中毒事故的蘑菇进行分子鉴定。方法:测定菌株核糖体 DNA 的转录间隔区序列。结果:该序列与 Gen-
Bank 中已有的序列进行比较 ,得到一系列同源性较高的序列。 其中与接受号为 EF411081 的 Amanita phalloides同源性最高 , 达到
99%以上;利用所得序列构建分子系统发育树 ,发现所测定的序列以较高的置信度与 Amanita phalloides 聚为一支。结论:确定引
起中毒事故的蘑菇为毒性较高的 Amanita phalloide ,即条纹毒鹅膏菌。
关键词:毒蘑菇;ITS;分子鉴定
中图分类号:Q939　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2008)06-0006-03
Molecular Identification A Mushroom Caused Poisoning Accident
Based on ITS Sequence of rDNA
LI He
(College of Resource &Environment , Central South University of Forestry &Technology , Changsha 410004, China)
Abstract:Objective:Molecular identification the mushroom caused poisoning accident.Method:The internal transcribed spacers of ribosomal
DNA was sequenced.Result:The sequence in GenBank has been compared by a series of high sequence homology.The homology of the highest is
EF411081(Amanita phalloides), reaching more than 99%;Base on the ITS sequence , the molecular phylogenetic tree was constructed.The
CSUFT200705X Gathered in with Amanita phalloide.Conclusion:The mushroom caused poisoning accidents is Amanita phalloide.
Key words:mushroom poisoning;ITS;molecular identification
收稿日期:2008-10-08;修回日期:2008-10-27
基金项目:湖南省教育厅科研项目(No.08C930)资助
作者简介:李河(1979-),男 ,湖南永州人 ,博士 ,讲师 ,从事森林微生
物的教学研究 ,发表论文 12篇 ,参编专著 1部 、教材 1部 , Email:csuftli-
he@163.com。
　　普通公众难以鉴别野生蘑菇是否有毒 , 常有家庭误食有
毒的野生蘑菇而中毒死亡的悲剧发生。 2007 年 ,湖南永州 、桂
阳等地相继发生了村民误食野生蘑菇导致死亡的事故。 因
此 , 准确地识别出何种野生蘑菇能为医院及时采取相对应救
治措施提供重要依据。但是 , 在事故发生地点一般很难找到
完整的蘑菇子实体 , 根本不能依靠形态学的方法鉴定这些蘑
菇的属种名。本文拟利用现代生物技术手段对一起引起中毒
事故蘑菇残块进行鉴定 , 确定其分类地位。通过研究 , 最后确
定该蘑菇中毒事故是因为误食了剧毒的条纹毒鹅膏菌(Aman-
6　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年 18(6)