全 文 ：609※营养卫生 食品科学 2008, Vol. 29, No. 11
卵叶娃儿藤(Tylophora ovata (Lindl.) Hook.ex Steud.)
属于萝摩科(Asclepiadaceac)娃儿藤属(Tylophora)多年生
匍匐性藤状草本，是我国传统的有毒中草药，味辛，
性温，有小毒，其主要功效为祛风止痛、止咳定喘、
通经活血、散瘀止痛、解毒截疟，用于治疗如风湿关
节痛、消化不良、跌打损伤、毒蛇咬伤、肝炎及月
经不调等多种疾病[1-3]。近年来对娃儿藤属植物的研究主
要集中于其中所含的生物碱类成分。本实验以体外培养
的人宫颈癌 HeLa 细胞为研究对象，通过观察卵叶娃儿
藤总生物碱对人宫颈癌 HeLa 细胞的生长抑制作用，探
讨其可能的机制,为娃儿藤总生物碱进一步的开发与应用
提供实验依据。
1　材料与方法
1.1 试剂与仪器　
胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；
RPMI-1640 培养基 Gibco 公司；胰蛋白酶(BBI)、四
甲基偶氮唑蓝(MTT) 美国 Sigma 公司。
Annexin V/FITC 试剂盒 南京凯基生物科技发展有
限公司；倒置显微镜 日本 Olympus 公司；酶标仪
MULTISKAN MK3 Thermo electron 公司；流式细胞
仪 美国 Beckman-Coulter 公司。
1.2 细胞培养
HeLa 细胞株来源于人宫颈癌细胞，上海细胞所。
采用含 10% 灭活小牛血清的 RPMI-1640，并加入羟乙
基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)及青霉素(100U/ml)和链霉素
(100U/ml)的培养体系培养。培养环境为 37℃，含 5%CO2
卵叶娃儿藤生物碱对宫颈癌细胞株HeLa
的体外作用
王远兴 1，贾素花 1，曾雯瑜 1，刘志杏 1，方志杰 2
(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南京理工大学化工学院，江苏 南京 210094)
摘 　要：为了观察卵叶娃儿藤总生物碱[Tylophora ovata (Lindl.) Hook. ex Steud，alkaloids TOHa]体外抑制人宫颈癌
细胞株 HeLa 增殖、诱导细胞凋亡的作用，将不同浓度的 TOHa 与 HeLa 细胞在体外培养，用 MTT 法观察 TOHa 对
HeLa 细胞的生长抑制作用，测定其在 490nm 的 OD 值；用细胞形态学、Annexin V/PI 双标记检测细胞凋亡。结果
表明，TOHa能抑制HeLa细胞的增殖和活力，呈现作用时间和剂量的依赖关系。HeLa细胞经TOHa作用后，Annexin
V+/PI- 表达升高，Giemsa 染色后出现凋亡细胞的特征性改变。　
关键词：卵叶娃儿藤；生物碱；宫颈癌 H e L a 细胞；增殖；凋亡
Effects of Tylophora ovata (Lindl) Hook. ex Steud Alkaloids (TOHa) on Proliferation and Apoptosis
of HeLa Cells in vitro
WANG Yuan-xing1，JIA Su-hua1，ZENG Wen-yu1，LIU Zhi-xing1，FANG Zhi-jie2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. College of
Chemical Engineering, Nanjing University of Science and Technology, Nanjing 210094, China)
Abstract：This study aimed to explore the effect of Tylophora ovata (Lindl.) Hook.ex Steud (TOHa) alkaloids on proliferation
and apoptosis of HeLa cells in vitro. Different concentrations of TOHa were used to treat HeLa cells in vitro for different time.
The proliferation was determined by MTT assay, and the cell apoptosis was determined by cell morphology, Annexin V/PI and
Giemsa labeling method. It was found experimentally that the TOHa can inhibit the proliferation and activity of Hela cells, and
the inhibition effects depend on reaction time and TOHa dose. After being treated with TOHa, Annexin V+/PI- expression of
Hela cells rises, and their apoptosis features change accroding to the results of Giemsa staining.
Key words：Tylophora ovata (Lindl.)Hook.ex Steud；alkaloid；HeLa cell；proliferation；apoptosis
中图分类号：R979.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)11-0609-03
收稿日期：2008-06-28
基金项目：教育部“长江学者和创新团队发展计划”项目(IRT0540) ；南昌大学测试基金项目(2008029)
作者简介：王远兴(1964-)，男，副教授，研究方向为生物化工和食品化学。E-mail：yuanxingwang@ncu.edu.cn
2008, Vol. 29, No. 11 食品科学 ※营养卫生610
注：* .与空白对照比较，p ＜ 0 .0 5。
图1 TOHa 对 HeLa 作用 24、48、72h后的抑制率(n=5)
Fig. 1 Inhibition rates of TOHa on HeLa cells proliferation after
24, 48 and 72 h (n = 5)
表1 TOHa 对 HeLa 细胞增殖的影响（x± s,n=5）
Table 1 Effects of TOHa on proliferation of HeLa cells
( x±s, n=5)
培养箱。取对数生长期的细胞进行实验。
1.3 总生物碱的制备
卵叶娃儿藤(产地广西贵港，经江西中医学院赖学
文教授鉴定)→粉碎→酸性乙醇回流萃取 3 次→过滤→回
收乙醇→固体浸膏→ 4% 盐酸溶解→离心→上清液氨水调
pH 至 8～9 → 氯仿萃取→旋蒸除去氯仿→总生物碱→加
DMSO 溶解，过滤除菌后于 _20℃保存备用。
1.4 方法
1.4.1 MTT 法检测总生物碱对 HeLa 细胞增殖的影响
取对数生长期的 HeLa 细胞，制成单细胞悬液后，
按 1 × 105/ml 的细胞密度加入 96 孔培养板中，100μl/ 孔，
培养 24h，加入不同浓度的待测药物，使其终质量浓度
为 1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5μg /ml。每组设 5
个复孔。实验同时设置阴性对照组 ( 只加等体积的细
胞)，调零组(加入等体积的培养基)。培养 24、48、72h
后,加 MTT(5mg/ml)，继续培养 4h 后，离心终止培养，
小心吸去上清液。加入 D M S O 1 5 0μ l / 孔，低速振荡
10min，使结晶物完全溶解， MULTISKAN MK3 型酶联
免疫检测仪于 490nm 测定每孔 OD 值，实验重复 3 次。
计算细胞抑制率：
1.4.2 细胞形态观察
将处理过的盖玻片放入 6 孔板中，取对数生长期的
细胞，用 0.25% 的胰蛋白酶消化后，按每孔 1 × 104 个
数量接种于 6 孔板中，培养 24h，每孔加入不同量的总
生物碱，使其终质量浓度分别为 1.0、2.5、5.0、7.5、
10.0、12.5μg/ml，并设不加药物的阴性对照组。培养
24、48、72h，Giemsa 染色，在光镜下观察细胞形态
变 化 。
1.4.3 Annexin -V/PI 标记染色测定细胞的早期凋亡
取浓度为 1 × 105 个 /ml 的 HeLa 细胞悬液，接种于
6 孔板中，常规培养 24h，加入 TOHa，使终浓度分别
为 1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5μg/ml，继续培养
24h；收集 HeLa 细胞，经预冷的 PBS 洗两次，1000r/min
离心 5min，将细胞悬于PBS中，调整浓度为1×106 个 /ml，
吸取 1ml 细胞悬液至 1.5m1 离心管中，离心，去上清液，
细胞逐滴加入预冷 70% 乙醇 1.5ml 固定，4℃避光保存
24h，离心弃去固定液，经预冷等量 PBS 洗 2 次。重悬
于 500μl 结合缓冲液，加入 5μl Annexinv-FITC(20mg/ml)
和 5μl PI(50mg/ml)，轻轻混匀，室温避光处放置 15min，
l h 内上流式细胞仪检测。
1.5 统计学分析　
实验数据以 表示，显著性检验采用 t 检验，以
p ＜ 0.05 为统计学差异有显著性。
2　结果与分析
2.1 总生物碱体外对 A549 细胞增殖的影响
细胞抑制率(%)=(1－ )× 100OD 实验OD 对照
sx ±
OD490
80
70
60
50
40
30
20
10
0 1 2.5 5 7.5 10 12.5
抑
制
率
(%
)
TOHa浓度(μg/ml)
24h
48h
72h
MTT 法检测总生物碱对 A549 细胞作用不同时间的
生长抑制效应详见表 1 及图 1。从中可看出总生物碱对
A549 细胞有明显的生长抑制效应，其抑制作用呈浓度
和时间依赖性，其抑制率随药物浓度升高和作用时间延
长而增加，实验组与对照组间有显著性差异(p ＜ 0.05)。
2.2 细胞形态学观察　
倒置显微镜下观察，阴性对照组 HeLa 细胞贴壁生
长，形态均一，胞浆饱满，生长舒展，相邻细胞生
长融合成片；细胞核质比例大，核大、核仁多。总
生物碱处理 48h 后，细胞贴壁能力减弱，部分细胞形态
变圆，体积缩小，出现细胞碎裂。见图 2 A ～C 。经
Giemsa 染色后镜下观察，细胞形态出现核固缩、核边
聚、核碎裂，胞膜出泡，并可见典型的凋亡小体等。
见图 2 D～F。
2.3 Annex in V/PI 双标记测定 TOHa 对 HeLa 细胞凋亡
的影响
由图 3 可见，不同浓度的 TOHa 作用 24h 后，HeLa
细胞凋亡率随着剂量的增加而增大，分别为 1 3 . 5 %、
15.4%、17.0%、17.7%、20.2%。结果提示 TOHa 对
HeLa 细胞具有促凋亡作用。
24 h 48h 72h
0 0.4160±0.0133 0.6665±0.0197 0.9028±0.0032
1 0.3378±0.0150* 0.5183±0.0075* 0.5930±0.0367*
2.5 0.3357±0.0135* 0.4706±0.0102* 0.4915±0.0333*
5 0.3088±0.0099* 0.4510±0.0065* 0.3895±0.0343*
7.5 0.3068±0.0170* 0.4001±0.0116* 0.2017±0.0105*
10 0.3032±0.0240* 0.3716±0.0110* 0.1953±0.0143*
12.5 0.2953±0.0037* 0.2905±0.0063* 0.1958±0.0085*
TOHa 浓度 (μg/ml)
611※营养卫生 食品科学 2008, Vol. 29, No. 11
3 讨 论
娃儿藤生物碱是一种生理活性显著的化合物，目前
国外对其研究侧重在抗肿瘤、抗病毒、抗炎等方面[4-7]。
但由于这类化合物存在稳定性差及毒副作用等问题，合
成化学家对其化学合成及结构改造已经展开，许多全合
成工作业已完成[8-9]。
本实验所用娃儿藤生物碱是从我国广西产卵叶娃儿
藤中提取得到，目前国内外对此的研究报道较少。本
实验结果表明，TOHa 可抑制 HeLa 细胞增殖，其抑制
效应呈时间和剂量依赖性。Annexin V/PI 双标记染色发
现 HeLa 细胞经 TOHa 作用 24h 后，细胞早期凋亡率随
TOHa 浓度增加而升高。TOHa 与 HeLa 细胞作用 48h 后，
光镜下可见细胞形态出现核固缩、核边聚、核碎裂、
胞膜出泡等凋亡细胞的特征性改变；通过 Giemsa 染色观
测到 TOHa 作用 HeLa 细胞后，呈现出细胞缩小、核浓
缩、细胞质红染、及细胞质内空泡等典型的凋亡现象。
由此可见，TOHa 可诱导 HeLa 细胞凋亡，且诱导细胞
凋亡可能是其抑制 HeLa 细胞增殖的主要方式之一。具
体的作用机理尚待研究。
参考文献：
[1] 谢宗万. 全国中草药汇编[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1997.
[2] 李春霞, 冯世鑫, 钟仕强, 等. 圆叶娃儿藤栽培技术的研究[J]. 中国
中药杂志, 2001, 26(1): 26-27.
[3] 韦松基, 刘寿养. 有毒药用植物的生药学研究[J]. 广西中医药, 2001,
24(2): 54-58.
[4] ABE F, HIRKAWAM, YAM AUCH I, et al. Phenanthroindolizidine
alkoloids from Trlophora tanakae[J]. Phytochemistry, 1995, 39(5):
695-699.
[5] ALI M, BHUANI K K. Minor alkaloids of Tylophora hirsuta[J].
Phytochemistry, 1987, 26: 2089-2092.
[6] GAO W L, LAM W, ZHONG S B. Novel mode of tylophorine analogs
as antitumor compounds[J]. Cancer Research, 2004, 64: 678-688.
[7] ZHEN Y Y, HUANG X S, YU D Q, et al. Antitumor alkaloids isloated
from Tylophora ovata[J]. Acta Botanica Sinica, 2002, 44(3): 349-353.
[8] DANIEL L C, CHEN X H, LAWRENCE A M. Enantiopure N-
acyldihdropyridones as synthetic intermediates: Asymmetrix synthesis
of (-)- septicine and (-)- tylophrine[J]. J Org Chem, 1997, 62: 7435-
7438.
[9] 王远兴, 方志杰, 高军峰, 等. 由藜芦醛合成娃儿藤碱[J]. 应用化学,
2007, 24(2): 215-219.
图2 TOHa对 HeLa细胞形态的影响
Fig. 2 Effects of TOHa on morphology of HeLa cells　
A. 对照；B.5.0μg/ml TOHa；C. 10.0μg/ml TOHa(× 100)； D. 对
照； E. 5.0μg/ml TOHa；F. 10.0μg/ml TOHa Giemsa (×
40 0)。
1.对照；2～6. TOHa 2.5、5.0、7.5、10.0、12.5μg/ml。
图3 Annexin V/PI 双标记法检测药物作用24h的细胞凋亡
Fig.3 Detection results of cell apoptosis by Annexin V/PI double labeling
after treament with different concentrations of TOHa for 24 h
Annexin v FITC Annexin v FITC Annexin v FITC
100 101 102 103 10 4 100 101 102 103 10 4 100 101 102 103 10 4
100 101 102 103 10 4100 101 102 103 10 4100 101 102 103 10 4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
2 3
4 5 6
_ P
I
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
1
_ P
I
_ P
I
_ P
I
_ P
I
Annexin v FITC
_ P
I
Annexin v FITC Annexin v FITC