全 文 ：［收稿日期］ 20120914(012)
［基金项目］ 云南省教育厅自然科学研究重点项目(06Z333C)
［通讯作者］ * 何晓山，硕士，副教授，从事中药药理学研究，Tel:0871-5918142，E-mail:kmhexsh@ 126. com
滇黄芩总黄酮对豚鼠心肌细胞
电压依赖性钠通道电流的影响
何晓山1* ，彭林2，林青1，代蓉1，包照日格图1，周宁娜1
( 1. 云南中医学院，昆明 650500; 2. 解放军 77226 部队卫生队，昆明 650200)
［摘要］ 目的:研究滇黄芩总黄酮(totla flavonoid)对豚鼠心肌组织电压门控性钠通道的影响。方法:成年豚鼠，肝素抗凝
后，腹腔麻醉，断头处死，迅速取其心脏，进行 Langendorff灌流，先用无钙台式液灌流 10 min，再以Ⅰ型胶原酶溶液灌流心脏，待
心脏基本变软后剪取心室部分，制备单个心室肌细胞。分离出的豚鼠心肌单细胞，用全细胞电压钳技术记录电压依赖性钠电
流进行研究。结果:滇黄芩总黄酮能可逆性抑制钠电流，其半数抑制浓度(IC50)为 106 mg·L
－1(95%的可信限是 92 ～ 112 mg·
L －1)。滇黄芩总黄酮并不影响钠通道激活开放的刺激电位阈值、最大激活电位值和反转电位值，但能使可激活开放的钠通道
明显减少，钠离子电流明显衰减，可引出的钠电流在 － 40 mV 处较正常组减少 45. 6%。细胞外给予滇黄芩总黄酮不影响钠通
道激活曲线:对照组与 106 mg·L －1的滇黄芩总黄酮组的半激活电压(V1/2)分别为(－ 50. 4 ± 1. 7)mV 和(－ 50. 1 ± 3. 1)mV(n
= 6 差异无统计学意义)。细胞外给予滇黄芩总黄酮可影响钠通道失活曲线，106 mg·L －1的滇黄芩总黄酮对电压依赖性稳态
失活钠电流会引起一个大约 12 mV的负向漂移，延缓失活钠通道的恢复:对照组与 106 mg·L －1的滇黄芩总黄酮组的 V1/2分别
为(－ 69. 4 ± 1. 6)mV 和(－ 79. 3 ± 3. 2)mV(n = 7，P ＜ 0. 05) ，两者间的差异有显著性意义，斜率分别为(－ 8. 2 ± 0. 9)mV 和
(7. 1 ± 0. 7)mV。细胞外给予滇黄芩总黄酮也可影响失活钠通道的恢复，使钠通道的复活时间常数显著延长:对照组和 106
mg·L －1的滇黄芩总黄酮组的时间常数分别为(15. 6 ± 6. 3) ，(29. 8 ± 14. 8)ms(n = 6，P ＜ 0. 05) ，差异有显著性意义。结论:滇
黄芩总黄酮可阻滞豚鼠心肌细胞钠通道，是稳定的豚鼠心肌组织钠通道阻断剂。
［关键词］ 心律失常;钠通道;滇黄芩总黄酮;心肌;膜片钳技术
［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)06-0192-04
Effects of Total Flavonoid from Scutellaria amoena
on Voltage-dependent Na + Current in Guinea-pig Ventricular Myocytes
HE Xiao-shan1* ，PENG Lin2，LIN Qing1，DAI Rong1，BAO Zhao-rigetu1，ZHOU Ning-na1
(1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China;
2. 77226 Armed Forces Sanitary Corps，Kunming 650200，China)
［Abstract］ Objective:To study the effects of total flavonoid from Scutellaria amoena on voltage-gated
Na + channels in cardiac tissues． Method:Adult guinea-pigs were heparinized and then sacrificed by decapitation
after being anesthetized． The heart was removed immediately，and the aorta of the isolated heart was connected to
a Langendorff apparatus and perfused with Ca2 + -free Tyrodes solution for 10 min，and then with the same solution
containing collagenase I． After dissociation and collection， cells were mechanically dispersed and single
ventricular myocytes were enzymatically dissociated from adult guinea-pig heart． Voltage-dependent Na + current
was recorded using whole cell voltage-clamp technique． Result:Total flavonoid reversibly inhibited Na + current
with an IC50 value of 106 mg·L
－1 (95% confidence range:92-112 mg·L －1)． The inhibitory effects of total
flavonoid on Na + current exhibited use-dependence． Total flavonoid at 106 mg·L －1 caused a negative shift (about
12 mV) in the voltage-dependence of steady-state inactivation of Na + current，and retarded its recovery from
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第 19 卷第 6 期
2013 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 6
Mar．，2013
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2013.06.070
inactivation，but did not affect its activation curve． Conclusion:In addition to blocking other voltage-gated ion
channels，total flavonoid can block Na + channels in guinea-pig ventricular myocytes． Total flavonoid acts as
inactivation stabilizer of Na + channels in cardiac tissues．
［Key words］ arrhythmia;sodium channels;total flavonoid from Scutellaria amoena;myocardium;patch-
clamp techniques
滇黄芩(Scutellaria amoena C． H． Wright)为云南
道地中药材，在西南地区也作“黄芩”入药，本实验
中的总黄酮是我们从滇黄芩中提取和分离制备的黄
酮类有效部位，具有多种药理活性。整体试验表明，
滇黄 芩 总 黄 酮 (total flavonoid from Scutellaria
amoena)具有较强的抗实验性心律失常的作用［1-2］，
且具有毒性低，副作用少，安全度高，尚可明显降血
脂和抗凝等特点，因此用于治疗老年性心律失常有
多方面的优点。滇黄芩总黄酮的抗心律失常机制，
尤其是离子通道机制尚不明确，我们当前的研究主
要通过测定滇黄芩总黄酮对钠电流、瞬时外向钾电
流和 L 型钙电流的影响来说明其可能的抗心律失
常作用机制。以酶解法分离出豚鼠心肌细胞后，用
全细胞电压钳技术记录电流，我们最近的研究首先
测定了滇黄芩总黄酮对豚鼠心肌细胞电压依赖性钠
电流的影响，然后进一步深入研究了其阻滞心肌钠
通道的作用机制。
1 材料
1. 1 药物 滇黄芩总黄酮由课题级自行制备，提取
得率为 0. 96%，总黄酮含量 56. 7%，每 1 g总黄酮提
取物相当于滇黄芩原药材 104. 167 g，临用时以蒸馏
水配成所需各质量浓度。
1. 2 动物 雄性和雌性豚鼠，体重(260 ～ 340)g，
由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，动
物合格证号为 SCXK(鄂)2004-0007。
1. 3 试剂 胶原酶Ⅰ(collagenase Ⅰ，批号 232-
582-8)、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES，批号
111116)、CsCl(氯化銫)、谷氨酸、河豚毒素(TTX)、
腺苷三磷酸镁(Mg2 + ATP，批号 550427) ，乙二醇二
乙醚二胺四乙酸(EGTA，批号 101022)为 Sigma 公
司产品。其余为国产分析纯试剂。
1. 4 仪器 膜片钳放大器(EPC-10 系列以及软件
包，德国 HEKA 公司) ，倒置显微镜(日本 Olympus
公司) ，液压微电极推进器及微电极拉制仪(日本
NARISH IGE公司)。
2 方法
2. 1 心室肌细胞的制备 按法尔默等记述的方
法［3-4］，以酶解法制备成年豚鼠心室肌细胞。豚鼠
心脏固定到 Langendorff 装置上，从主动脉以无 Ca2 +
台氏液逆行灌流 10 min，然后再用含 0. 02%胶原酶
Ⅰ和 1% 小牛血清白蛋白的无 Ca2 +台氏液灌流 2 ～
4 min［所用溶液含溶质(mmol·L －1)NaCl 135，KCl
5. 4，MgCl2 1，NaH2P04 0. 33，HEPES 5，葡萄糖 5，
用 NaOH调 pH 7. 4，冲入 100% O2，饱和，温度保持
为 37 ℃］。冲去酶液后，心室肌轻轻剪碎，放入 KB
(Kraft-Bruhe)液中孵育 10 min［KB 液含溶质为
(mmol·L －1)L-谷氨酸 50，KOH 80，KCl 40，MgSO4
3，KH2PO4 25，HEPES 10，EGTA 1，葡萄糖 10，用
KOH 溶液调 pH 7. 4］。分离得到的细胞用 200 μm
的尼龙过滤网过滤后保存在 21 ～ 23 ℃的 KB 液中。
只有棒状、横纹清晰的细胞可用于实验。
2. 2 全细胞电压钳记录 参照文献方法［5-7］，把少
量心室肌细胞放入固定在显微镜载物台上的 3 mL
的浴槽中，并且用外液行表面灌流。灌流液含
(mmol·L －1) :氯化胆碱 100，NaCl 40，KCl 5. 4，
MgCl2 1，CaCl2 1，CdCl2 0. 1，NaH2PO4 0. 33，HEPES
10，葡萄糖 10，用 NaOH溶液调 pH 7. 4，使用 EPC-
10 放大器在 20 ～ 23 ℃进行单心肌全细胞记录，电
压指令由 pulse 软件包经生成。膜片用电极(尖端
电阻 1 ～ 3 MΩ)用 PC-10 微电极拉制仪制备，内灌
入电极液，含(mmol·L －1) :CsCl 120，MgCl2 5，
EGTA 11，HEPES 10，Na2ATP 5，用 CsOH 溶液调
pH 7. 3。所用细胞外液和电极液可使跨膜 Na +浓度
减少到 4∶ 1，能够大大改善钠通道激活期间的电压
钳制。形成吉欧姆封接(封接电阻 ＞ 1 GΩ)后，轻轻
抽吸细胞膜获得全细胞电压钳模式。按常规优化电
容补偿，串联电阻补偿 40% ～ 80%。线性漏接联机
扣减。信号经 5 kHz 过滤，存储于联想电脑中。细
胞平均电容为(86. 0 ± 4. 4)pF(n = 21，12 animals)。
滇黄芩总黄酮溶解外液中进行细胞外给药，当
膜片吸破后，可转入到记录细胞中。
2. 3 数据分析与统计 IC50 浓度-效应曲线由计算
机软件求出。激活和失活曲线用 Boltzmann 方程:
Y = 1 /{1 + exp［(Vc － V1 /2)/k］}进行曲线拟合确
定，式中 Vc 为膜电位;V1 /2为半激活电压或半失活
电压;k为斜率因子。钠通道复活时程由指数方程:
·391·
何晓山，等:滇黄芩总黄酮对豚鼠心肌细胞电压依赖性钠通道电流的影响
Y = A·exp(－ t / ι) ，确定，式中 A 为强度;ι 为时间
常数。数据以 珋x ± s 的形式表示，以配对和不配对双
尾 t检验统计分析，P ＜ 0. 05 为有统计学意义。
3 结果
3. 1 滇黄芩总黄酮细胞外给药对心室肌细胞 Na +
电流抑制作用 电压依从性 Ca2 +电流通过往细胞
外液中加 Cd2 +(浓度 100 μmol·L －1)加以阻滞，而电
压依从性 K +电流通过以 Cs +取代电极液中的 K +来
消除。在此条件下，通过阶跃去极引出的瞬时内向
电流可代表快钠电流，能够被 30 μmol·L －1的河豚
毒素(TTX)溶液阻滞。含滇黄芩总黄酮的溶液记录
细胞超灌可浓度依赖性降低钠通道电流峰值(表
1)。在 2 min内可观察到稳定的抑制作用，而冲洗
5 min后电流可部分恢复。由浓度-效应曲线求出其
半抑制浓度为 106 mg·L －1(95%的可信限 92 ～ 112
mg·L －1) (图 1) ，Hill 系数为 1. 08(95%的可信限
0. 97 ～ 1. 19)。滇黄芩总黄酮对钠通道电流-电压关
系的响见图 2。在对照组，INa的激活阈电压为
－ 60 ～ － 50 mV，在 － 40 mV时达到最大激活，而反
转电压为(18. 0 ± 2. 1)mV(n = 9)。滇黄芩总黄酮
不改变钠通道激活开放的刺激电位阈值、最大激活
电位值和反转电位值，但能使 I /V 曲线明显向上漂
移:在 － 40 mV 处可引出的最大钠电流较正常组减
少 45. 6%(n = 9，P ＜ 0. 01)。冲洗 5 min 后电流可
恢复到正常水平的 79% ±4%(n = 6)。
表 1 滇黄芩总黄酮对豚鼠心室肌细胞 INa的影响(珋x ± s)
总黄酮 /mg·L －1 n
INa /nA
给药前 给药后
12. 5 7 － 2. 39 ± 0. 23 － 2. 29 ± 0. 26
25 6 － 2. 45 ± 0. 23 － 2. 11 ± 0. 251)
50 6 － 2. 51 ± 0. 34 － 1. 87 ± 0. 311)
75 6 － 2. 65 ± 0. 37 － 1. 72 ± 0. 451)
100 6 － 2. 49 ± 0. 22 － 1. 26 ± 0. 111)
125 6 － 2. 53 ± 0. 36 － 0. 43 ± 0. 251)
150 6 － 2. 56 ± 0. 29 － 0. 31 ± 0. 161)
200 6 － 2. 35 ± 0. 31 － 0. 15 ± 0. 121)
250 6 － 2. 37 ± 0. 28 － 0. 029 ± 0. 071)
注:与给药前相比1)P ＜ 0. 001。
3. 2 细胞外给药对心室肌细胞 Na +电流动力学特
性的影响 细胞外给予滇黄芩总黄酮不影响钠通道
激活曲线(图 3) :对照组与 106 mg·L －1的滇黄芩总
黄酮组的半激活电压(V1 /2)分别为(－ 50. 4 ± 1. 7) ，
(－ 50. 1 ± 3. 1)mV(n = 8) ，斜率分别为(3. 0 ±
0. 4) ，(4. 1 ± 0. 3)mV差异无统计学意义。
心室肌细胞取自 8 只豚鼠，共 37 个细胞;
每个数据点相邻括号内的数字表示检测的心室肌细胞数
图 1 滇黄芩总黄酮对豚鼠心室肌
细胞钠电流抑制作用的浓度-效应曲线(珋x ± s)
与加药前相比，1)P ＜ 0. 05;2)P ＜ 0. 01。
图 2 滇黄芩总黄酮对 Na +通道电流 I /V 曲线的影响
图 3 滇黄芩总黄酮对 Na +通道电流激活曲线的影响
细胞外给予滇黄芩总黄酮可引起电压依从性钠
通道稳态活曲线向负向漂移(图 4) :对照组与 106
mg·L －1的滇黄芩总黄酮组的半失活电压分别为
(－ 69. 4 ± 1. 6) ，(－ 79. 3 ± 3. 2)mV(n = 7，P ＜
0. 05) ，而斜率分别为(－ 8. 2 ± 0. 9) ，(7. 1 ± 0. 7)
mV，两者间的斜率差异无显著性意义。
心室肌细胞由失活态激活的时程可用指数函数
确定(图 5)。对照组的时间常数(τ)为(15. 6 ±
6. 3)ms(n = 6) ，细胞外给予 106 mg·L －1的滇黄芩总
黄酮溶液可引起时间常数显著延长［τ = (29. 8 ±
14. 8)ms，P ＜ 0. 05］。
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第 19 卷第 6 期
2013 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 6
Mar．，2013
图 4 滇黄芩总黄酮对 Na +通道电流稳态失活曲线的影响(珋x ± s)
图 5 滇黄芩总黄酮对 Na +通道由失活向
激活态转变曲线的影响(珋x ± s)
4 讨论
我们前期在整体动物实验的研究中发现滇黄芩
总黄酮对豚鼠心室肌细胞有可逆性阻滞作用。细胞
外给予滇黄芩总黄酮如果能够阻滞 INa，则说明滇黄
芩总黄酮可经细胞膜扩散并结合到通道内部的某一
结合位点对钠通道产生阻滞作用。实验中发现了支
持这种推测的证据:滇黄芩总黄酮可引起电压依从
性钠通道稳态失活曲线向负向漂移而不影响激活曲
线，这种漂移意味着滇黄芩总黄酮对失活态心肌细
胞钠通道有较高的亲和力，从而引起强烈的阻滞作
用;滇黄芩总黄酮可明显延缓钠通道从失活态的恢
复过程，作用有使用依赖性。因此滇黄芩总黄酮可
作为心室肌细胞钠通道失活稳定剂。
滇黄芩总黄酮阻滞心肌细胞钠通道的 IC50为
106 mg·L －1(95%的可信限:92 ～ 112 mg·L －1)。滇
黄芩总黄酮对钠通道电流的阻滞作用具有使用依赖
性。106 mg·L －1的滇黄芩总黄酮溶液可引起电压依
从性钠通道稳态失活曲线负向漂移，延缓其从失活
态的恢复，但并不影响钠通道激活曲线。在整体动
物上，滇黄芩总黄酮有显著的心血管活性，滇黄芩总
黄酮的多通道阻滞效应可能有利于室颤的治疗。滇
黄芩总黄酮的抗心律失常作用可用缺血再灌注诱发
的大鼠心律失常模型研究证实，滇黄芩总黄酮能有
效抑制室颤。临床研究表明，dronedarone 等多通道
阻滞剂比现有的药物具有更多的抗心律失常优
点［8］。滇黄芩总黄酮如果能够进一步分离出其有
效单体成分，在抗心律失常药的设计中或许能提供
许多有用的结构线索。
［参考文献］
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［责任编辑 聂淑琴］
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何晓山，等:滇黄芩总黄酮对豚鼠心肌细胞电压依赖性钠通道电流的影响