全 文 ：[收稿日期] 2011- 11- 30
[基金项目]吉林省自然科学基金（201215147）；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究重点项目（吉教科合字[2012]第 217号）。
[作者简介]蔡 艳（1973-），女，辽宁铁岭人，长春师范学院化学学院实验师，硕士，从事物理化学实验教学与研究。
[通讯作者]陈瑞战（1967-），男，教授，博士，从事天然产物有效成分提取、分离及活性研究。
多糖广泛存在于动物、植物和微生物体内，是生命的物质基础，具有可与核酸或蛋白质相比拟的信息
功能，参与细胞间的识别、机体免疫功能的调节、细胞间物质的运输、细胞的转化、凋亡等过程，且大多
数无毒。研究发现多糖具有抗肿瘤和免疫调节[1]、抗菌、抗病毒[2]、抗氧化和抗衰老等多方面的药理活性[3- 4]，
已成为理想的药物和天然抗氧化剂来源。近来研究发现中药多糖能够清除物理的、化学的及生物来源的多
种自由基，减少脂质过氧化产物丙二醛的生成量，增加谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性，有效
的抑制肿瘤的发生、发展，甚至使肿瘤逆转。因此，为多糖的生产提供高效的生产工艺、评价多糖的生物
活性具有重要的研究意义。
虎眼万年青，属百合科、虎眼万年青属，原产于非洲南部，为多年生草本植物。作为常绿的宿根草本
花卉，己在中国各地广泛栽培，特别是在吉林长白山地区栽种十分广泛。从该属植物中分离鉴定的化学成
分有万年青苷 A，B、肥皂草苷、槲皮素 - 3- 氧 - 鼠李糖葡萄糖苷、铃兰毒苷、胆甾烷、强心甙、类黄酮、
半萜葡糖苷、葡萄糖果聚糖、降胆甾烷甙类(三糖)[5- 7]、酰基胆甾烷甙类(二糖)(OSW- 1)[8]等。其中槲皮素具有
一定的免疫调节作用；皂苷类化合物 OSW- 1对肺癌、乳腺癌有明显抗癌活性，对 P338有细胞毒作用，即
对 P338蛋白质合成前体的结合及核酸的合成有抑制作用，比常见抗癌药喜树碱、阿霉素、紫杉醇抗癌活性
还高 10倍以上[9]；虎眼万年青中的水溶性多糖成分，含量很高，约占虎眼万年青干重的 20%以上，具有很
高的抗肿瘤活性[10]。
本文在单因素试验的基础上，采用正交试验优化多糖最佳提取工艺，并采用 DPPH、·O2-、·OH自由基
清除实验评价其体外抗氧化活性，为天然多糖抗氧化剂的开发提供物质基础和理论依据。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
正交实验优化虎眼万年青多糖提取工艺及
抗氧化活性评价
[摘 要]本文对虎眼万年青粗多糖的提取工艺及体外抗氧化活性进行了研究。通过单因素试验考察了
溶剂原料比、提取温度、提取次数及提取时间对粗多糖提取得率的影响。采用正交试验（L9 (34)） 优化
得到最佳提取工艺参数：溶剂原料比 20 mL·g- 1，提取温度 90℃，提取时间 3h，提取 4次。并通过对
有机自由基、羟基自由基和超氧自由基的清除活性评价粗多糖体外抗氧化活性，结果显示得到的粗多
糖具有很高抗氧化活性，可以探索作为天然抗氧化剂应用于药品或功能食品。
[关键词]虎眼万年青；多糖；正交实验；提取；抗氧化活性
[中图分类号] Q946.3 [文献标识码] A [文章编号] 1008- 178X(2012)03- 0075- 06
（长春师范学院化学学院，吉林长春 130032）
第 31卷第 3期
Vol.31 No.3
长春师范学院学报（自然科学版）
Journal of Changchun Normal University(Natural Science)
2012年 3月
Mar.2012
蔡 艳，李 元，董 航，陈瑞战
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实验原料为虎眼万年青（鳞茎），由中科院长春应用化学研究所化学生物学实验室提供。样品经吉林省
药检所鉴定，确认为虎眼万年青的子实体。
1，1- 二苯基 - 2- 苦基肼基(DPPH，德国 Sigma- Aldrich Chemie GmbH公司)；番红花（国药集团化
学试剂有限公司）；95%乙醇、乙醚、丙酮、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、无水乙醇等试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器
UV－2401型紫外－可见分光光度计(日本岛津公司)；电子天平(德国 Sartorius)；EYEL4型旋转蒸发器
(日本，TOKYORIKAKIKAICO)；DZC－403型真空干燥箱(天津天宇机电仪器有限公司)；冷冻干燥机(德国
ALPHA2－4)；GSY－11型恒温水浴箱(北京市医疗设备厂)；SHB－B88循环水式多用真空泵(菏泽市生化仪
器厂)；LG- 2000高速中药粉碎机(瑞安百信药机器械厂)。
1.3 实验方法
1.3.1 样品预处理
新鲜虎眼万年青鳞茎清洗干净后，切碎烘干至质量恒定，粉碎，用乙醚脱脂、脱色至原料浸提液无色，
再用 95%乙醇回流提取 3h，减压过滤，上清液回收乙醇，残渣烘干用于多糖提取。
1.3.2 虎眼万年青鳞茎粗多糖提取
准确称取一定质量预处理样品粉末于圆底烧瓶中，在一定的溶剂原料比、提取时间、提取次数、提取
温度下水浴回流提取。残渣按一定的提取次数提取后减压过滤，合并滤液。滤液减压浓缩至一定体积，加
入乙醇至乙醇最终浓度 70%，于室温下沉化 24h，减压过滤，沉淀冷冻干燥，得粗多糖。准确称取 7.0mg
粗多糖，加水 50mL，在 80℃水浴中加热溶解 30min，趁热过滤，残渣用 5mL热水洗涤三次，洗液并入滤
液中，冷却后移至 100mL容量瓶中，稀释至刻度，用以测定多糖含量，计算粗多糖提取得率。
1.3.3 多糖含量测定
苯酚溶液的配制：取 100g苯酚，加 0.1g铝片和 0.05g氢氧化钠，加热蒸馏，收集 182℃的馏分，取此
馏分 5mL加水溶解并稀释至 100mL，摇匀，即得 5%的苯酚溶液，置棕色瓶内，备用。
葡萄糖标准溶液的配制：取适量葡萄糖于 105℃烘箱内烘干至质量恒重，精确称取 0.2676g，加蒸馏水
溶解，定容至 250mL，即得浓度为 1.0704mg·mL-1的葡萄糖标准溶液。
标准曲线的绘制：精确量取 0.00、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00mL浓度为 1.0704mg·mL-1的葡
萄糖标准液，分别置于 100mL的容量瓶，加水定容至 100mL，摇匀。精确量取上述各溶液 2mL，加入
1mL5%苯酚试液，再快速加入 5mL浓 H2SO4，室温静置 5min，于 40℃水浴上加热 30min，取出，迅速冷却
至室温。于波长 490nm（葡萄糖最大吸收波长） 测吸光度值。以吸光度值 A为纵坐标，浓度 C（mg·mL-1）
为横坐标，绘制标准曲线，并经分析得出回归曲线。回归曲线方程为：A=9.8414C- 0.0488；相关系数 R2=0.
9998；线性范围：0.0101~0.1308mg·mL-1。
粗多糖提取得率的计算：把所测试样的吸光值代入标准回归方程 A=9.8414C- 0.0488，计算葡萄糖浓
度，根据浓度计算粗多糖提取得率(%)，粗多糖提取得率(%)=100(W1×X)/(W0×W2)；X(mg·mL-1)：试样中多
糖含量(以葡萄糖计)；W1：称取浸膏的质量(本实验为 7.0mg)；W2：冻干后浸膏的质量；W0：称取样品的质
量(本实验为 10.0g)；
1.3.4 单因素试验
准确称取一定质量的预处理样品，固定其他条件，分别考察溶剂原料比(10、15、20、25、30mL·g-1)、
提取温度(60、70、80、90、100℃)、提取次数(1、2、3、4、5次)、提取时间(1、2、3、4、5d·h)4个单因素
对粗多糖提取得率的影响。
1.3.5 正交试验
在单因素试验的基础上，提取得率为指标，取影响多糖提取得率的主要因素：A溶剂原料比(10、15、
20mL·g-1)、B提取温度(80、90、100℃)、C提取次数(2、3、4次)、D提取时间(2、3、4h)进行正交试验 L9(34)，
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确定多糖最佳提取工艺参数。
1.3.6 抗氧化活性测定
清除 DPPH自由基活性：取不同浓度的粗多糖待测样品溶液 3.0mL，加入 1.0mL0.1mmol·L-1DPPH甲醇
溶液，立即混匀，静置 30min，于 517nm波长处测定吸光值 Ai。则多糖对 DPPH·的清除活性可表示为：清
除活性(%)=[1- (Ai- Aj)/Ac]×100;式中：Ai为 DPPH与样液反应后的吸光值；Aj为样品空白(3.0mL水 +1.0mL
甲醇)的吸光值；Ac为未加样的 DPPH溶液(1.0mLDPPH甲醇液 +3.0mL水)的吸光值；每一样品平行测 3次，
取其平均值。
清除·O2－自由基活性：取不同浓度的虎眼万年青粗多糖 0.1mL，分别加入多 5mL50mmol·L-1磷酸盐缓
冲溶液(pH8.2)和 4.7mL水，混匀后于 25℃水浴中恒温 20min，取出后立即加入 0.20mL3.0mmol·L-1邻苯三酚
(用 10mmol·L-1HCl配制)，摇匀后倒入比色皿测定吸光值。邻苯三酚自氧化时以 0.1mL水代替粗多糖溶液。
以 10mmol·L-1HCl溶液作为参比，在 325nm波长处每隔 30s测定吸光值。多糖对·O2－的清除活性表示为：
清除活性(%)=100(1-ΔA)/ΔA0; 式中:ΔA为加入虎眼万年青多糖溶液后邻苯三酚自氧化速率。ΔA0为邻苯
三酚自氧化速率。
清除·OH自由基活性：不同浓度的粗多糖样品溶液 1.0mL，分别加入 1.0mLpH值为 7.4的磷酸缓冲液，
0.2mL番红花(520μg·mL-1)，1.0mLEDTANa2- Fe(II)溶液，再加入 0.8mL6%的 H2O2，混匀后于 40℃水浴恒温
30min，在波长 514.9nm处测吸光值 A1。每个多糖浓度作三个平行样，取其平均值。空白组以等体积的蒸
馏水代替样品液；对照组以等体积的蒸馏代替样品溶液和 EDTANa2- Fe(II)溶液。清除率(%)＝[(A1- A0)/
(A2- A0)]×100;式中:A1多糖样品的吸光值，A0空白组的吸光值，A2对照组的吸光值。
2 结果与讨论
2.1 单因素实验结果及分析
2.1.1 溶剂原料比的影响
准确称取一定量预处理样品于圆底烧瓶中，水浴回流提取。选提取时间 3h、提取温度 90℃、提取 1
次，分别考察溶剂原料比 10、15、20、25、30mL·g-1对提取得率的影响。其余操作同 1.3.2，并用苯酚 -
硫酸法测定多糖含量。结果见图 1(A)所示。由图 1(A)可知，随着液料比的增加多糖的提取得率也逐渐增加，
这是因为增加溶剂原料比会使细胞内外多糖浓度差增大，从而增大多糖溶出的动力，使提取更快速、完
全。但从图 1(A)可以看出当溶剂原料比达到 15mL·g-1时，再增大溶剂原料比多糖得率增大幅度不大，同时
溶剂原料比太高会使提取液中多糖浓度降低，增加分离、纯化的工作量，增加能量消耗和生产成本，所以
溶剂原料比选择 15mL·g-1时较为适宜。
2.1.2 提取温度的影响
准确称取一定质量处理样品于圆底烧瓶中，水浴回流提取。选溶剂原料比为 15mL·g-1、提取时间为 3
h、提取次数 1次、提取温度分别为 60、70、80、90、100℃。其余操作同 1.3.2，并用苯 - 硫酸法测定多
糖含量。结果见图 1(B)所示。由 1(B)可知，在 60～90℃温度范围内，随温度的升高，多糖得率也逐渐升
高，这是因为多糖主要存在于细胞中，要提取水溶性多糖，首先要使细胞壁成分降解或分离，在一定的温
度范围内，温度的提升高能加快细胞壁的破碎，提高细胞壁的破碎率，从而有利于多糖的溶出，提高多糖
的提取得率；同时大多数植物多糖随温度的升高，溶解度增大，增加温度利于多糖的提取。但是，在 90℃
以后多糖得率又呈下降趋势，这可能是多糖在高温条件下水解而使多糖得率下降。可以确定多糖提取的最
佳温度为 90℃。
2.1.3 提取次数的影响
准确称取一定质量预处理样品于圆底烧瓶中，水浴回流提取。选取溶剂原料比 15mL·g-1、提取温度
90℃、提取时间 3h，考察提取次数分别为 1、2、3、4、5次对多糖提取得率的影响。其余操作同 1.3.2，
并用苯酚 - 硫酸法测定多糖含量。结果见图 1(C)所示。由图 1(C)可以看出随着提取次数的增加多糖的得率
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逐渐增大，这是因为多糖分子量较大，透过细胞壁向外扩散的传质阻力较大，一次提取不能使多糖成分提
取完全，在 1～3的提取次数范围内，随提取次数的增加，提取得率快速增加；同时增加提取次数，能够增
大组织细胞内外多糖的浓度梯度，有利于多糖成分的提取。但当提取次数超过 3次后，多糖提取接近完全，
再增加提取次数，提取得率增大的幅度不大，而且提取时间增大、工作量大幅增加，从经济等多方面综合
考虑，选择最佳提取次数为 3次。
2.1.4 提取时间的影响
准确称取一定质量预处理样品于圆底烧瓶中，水浴回流提取。选溶剂原料比 15mL·g-1、提取温度
90℃、提取次数 1次，分别考察提取时间 1、2、3、4、5h对多糖提取得率的影响。其余操作同 1.3.2，并
用苯酚 - 硫酸法测定多糖含量。结果见图 1(D)所示。很显然，在图 1(D)的 1～2h的提取时间范围内，随着
时间的增加，提取得率迅速增加，因为在该段时间内组织细胞内外多糖的浓度梯度最大，多糖由细胞内向
周围提取溶剂扩散的传质动力较大，细胞内的多糖成分能够快速地提取出来，因此提取得率随时间得增加
而快速提高；在 2～3h的时间范围内，植物细胞内和细胞周围提取溶剂中多糖的浓度逐渐趋于平衡，因此
提取得率随时间的增加缓慢增加，尔后逐渐达到溶解、扩散平衡，提取得率达到最大值。但是在提取时间
超过 3h时多糖提取得率随时间的延长而逐渐降低，这是由于提取时间过长会使多糖在较高温度下发生降解
等结构变化，降低多糖的提取得率。因此，选择最佳提取时间为 3h。
图 1 溶剂原料比(A)、提取温度(B)、(C)提取次数、(D)提取时间对多粗糖得率的影响
2.2 正交实验结果及分析
在单因素预实验的基础上，选择对多糖提取得率影响较大的溶剂原料比(A)、提取时间(B)、提取次数
(C)、提取温度(D)为因素，在各因素最佳值附近分别取三个水平，以多糖得率为指标，做 4因素 3水平正交
实验，依据 L9(34)正交试验表优化多糖提取的最佳工艺（表 1）。
直观分析表明，回流法提取虎眼万年青鳞茎多糖，选择水为溶剂，以多糖提取得率为评价指标，最佳
搭配方案为 A3B2C3D2，即溶剂原料比 20mL·g-1、提取温度 90℃、提取次数 4次、提取时间 3h、方差分析表
（表 2） 表明，各因素对提取效果的影响程度依次为提取次数＞提取时间＞溶剂原料比＞提取温度，其中提
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2.3 抗氧化活性
不同浓度粗多糖对 DPPH·、·O2- 和·OH自由基
清除活性（％） 如图 3所示。由图 3可看出，粗多糖
对 DPPH·、·O2- 和·OH自由基都有一定的清除活性，
其清除活性都随浓度的增加而逐渐增加，即都有一定
量效关系，特别是在高浓度时随浓度增加出现快速增
加的趋势。粗多糖对不同自由基清除活性不同，对?
OH自由基清除活性最高，对·O2- 自由基清除活性最
低。当粗多糖浓度为 7mg·mL-1时，对 DPPH·、·O2-
和·OH自由基清除率分别为：73%、60%、79%。
取次数对多糖得率的影响已具有显著性。分别称取 10g虎眼万年青预处理鳞茎粉末 3份，按最优工艺条件
提取，计算多糖提取得率为 32.83%。
序 号
A
（mL·g-1）
B
（℃）
C
（次）
D
（h）
Yi
（%）
1 1(10) 1(80) 1(2) 1(2) 14.51
2 1 2(90) 2(3) 2(3) 25.63
3 1 3(100) 3(4) 3(4) 27.65
4 2(15) 1 2 3 23.13
5 2 2 3 1 29.62
6 2 3 1 2 21.27
7 3(2) 1 3 2 32.58
8 3 2 1 3 19.16
9 3 3 2 1 23.57
K1 22.597 23.407 18.313 22.567
K2 24.673 24.803 24.110 26.493
K3 25.103 14.167 29.950 23.313
R 2.506 1.396 11.637 3.926
最优化参数 A3 B2 C3 D2
最优组合 A3B2C3D2
表 1 L9（34） 正交试验设计方案及结果
因 素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
溶剂原料比 10.781 2 0.178 3.110
提取时间 2.933 2 0.048 3.110
提取次数 203.119 2 3.345 3.110 *
提取温度 26.089 2 0.430 3.110
表 2 正交试验方差分析表
图 3 不同浓度多糖对自由基的清除活性
浓度（mg·ml-1）
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3 结论
通过正交试验，确定了热回流法提取虎眼万年青多糖的最佳提取条件：溶剂原料比 20mL·g-1、提取温
度 90℃、提取次数 4次、提取时间 3h，在此工艺条件下多糖的提取得率为 32.83%。4个因素对多糖提取
得率的影响程度不同，其中提取次数对提取得率影响最为显著，其次是提取时间、溶剂原料比，而提取温
度对提取得率影响不大。粗多糖对 DPPH·、·O2- 和·OH自由基都有一定的清除活性，有量效关系，清除·
OH自由基活性最高、清除·O2- 自由基活性最低，通过自由基清除活性试验证明该多糖具有较高的抗氧化
活性，可以探索作为天然抗氧化剂应用于药品或功能食品。
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Orthogonal Test Design for Optim ization of the Extraction Polysaccharides from Ornithogalum
Caudatum Ait and Evaluation of Its Antioxidant Activity
CAI Yan，LI Yuan，DONGHang，CHENRui- zhan
(Chemistry College of Changchun Normal University，Changchun 130032，China)
Abstract: The extraction process of crude polysaccharide (COCAP) from Ornithogalum Caudatum Ait and the
anti- oxidation activity in vitro of the crude polysaccharide were studied in this paper. The effects of four factors
including ratio of water to rawmaterial，extraction temperature，extraction number and extraction time were researched
by single factor tests. The optimal extraction process obtained by an orthogonal experiment ((L9 (3)4) are as follows: 20
mL·g-1，90℃，4times and 3h，respectively.The antioxidant activities were evaluated by 1，1- diphenyl- 2- picrylhydrazyl
radical (DPPH·)，superoxide radical (O2-)，hydroxyl radical (·OH) scavenging assay in vitro. The results indicate that
COCAP had significantly higher antioxidant activities. COCAP might explore as a natural antioxidant agent for use in
medicine or functional foods.
Key words: OrnithogalumCaudatumAit；polysaccharide；orthogonal experiment；extraction；antioxidant activity
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