全 文 ：收稿日期:2007-07-10基金项目:江西省农业科技攻关资助项目(赣科发计字 [ 2004] 65号)作者简介:王　燕(1982-), 女 ,硕士生;＊通讯作者:王曼莹(1944-), 女 ,教授 .E-mail:wmy8888@sohu.com
　　文章编号:1006-0464(2008)01-0062-04
羊踯躅花瓣总 RNA提取方法的比较与改进
王　燕 1 ,王曼莹2＊ ,李思光 1
(1.南昌大学 生命科学学院 ,江西 南昌　330031;2.江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室 , 江西 南昌　330022)
摘　要:不同组织的 RNA提取难点各异 , 适宜方法也不尽相同。分析 、比较了热酸性酚抽提法 、热硼酸法 、异硫氰
酸胍法和改良的异硫氰酸胍法从羊踯躅花瓣中提取总 RNA的效果 , 经过多次反复实验发现采用改良的异硫氰酸
胍法所得的总 RNA质量好 ,纯度高 , 完整性很好 , 适用于 cDNA文库的构建 、Northern印迹与 mRNA差异显示等后
续研究工作。
关键词:羊踯躅花瓣;RNA提取;异硫氰酸胍法;改良
中图分类号:Q949.772.3　　　　文献标识码:A
　　羊踯躅(RhododendronmoleG.Don)是杜鹃花
科杜鹃花属羊踯躅亚属植物 ,落叶灌木 ,俗称闹羊
花 。我国的羊踯躅仅有一个原生种 ,原本广泛分布 ,
但由于人为与自然等综合因素的影响 ,现存量锐减 。
羊踯躅除含有多种活性物质并具有药用价值外 ,花
色桔黄 、金黄 、淡红 、深红 、雪白等 ,还有较高的观赏
价值 ,有巨大的开发潜力和应用前景 。此外 ,羊踯躅
也是研究花色调控的理想材料 。
创新花卉品种一直是花卉育种者追求的目标 ,
分子育种技术的发展使得定向改良性状逐步成为可
能 。目前对羊踯躅的研究除组培 、化学成分分析及
其药用价值等方面外 ,在分子水平上的研究也日益
受到重视。
花是体现花卉观赏价值最重要的部位 ,花瓣是
研究花发育 、花色调控与花生理生化的必需实验材
料 。因此 ,提取高质量花瓣 RNA是开展花卉研究分
子生物学实验的第一步 。总 RNA的提取是进行基
因表达分析等研究的基础。 RNase活性很强 , RNA
很容易被 RNase降解 ,所以要得到无降解的 RNA一
直是一个较难的问题 ,尤其是植物总 RNA的提取 。
植物细胞具有坚硬的细胞壁 ,含较多的多糖 、蛋白质
及一些不明次级代谢物[ 1-2] 。植物缺少富含单一的
mRNA的组织和器官 [ 3] ,植物 mRNA含量较低 ,而
RNase含量丰富 、活性又很强 ,很容易将 RNA降解 ,
故无降解的总 RNA的提取更显得困难 。
实验室常用的提取植物总 RNA的方法如热酸
性酚抽提法 、热硼酸法 、异硫氰酸胍法都不能有效提
取羊踯躅花瓣的总 RNA,经过多次改进 、反复实验 ,
我们建立了异硫氰酸胍改良法 ,获得了高质量的羊
踯躅花瓣总 RNA。为下一步 RT-PCR、cDNA文库
构建 、mRNA差异显示分析和 Northern印迹等分子
生物学操作提供了必要保证 。
1　材料和方法
1.1　实验材料的采集
从庐山植物园采摘羊踯躅的新鲜花朵 ,取花瓣 ,
液氮冷冻后 -70℃保存备用 。
1.2　羊踯躅花瓣总 RNA的提取
本研究采用了热酸性酚抽提法 、热硼酸法 、异硫
氰酸胍法与改良的异硫氰酸胍法四种方法进行羊踯
躅花瓣总 RNA的提取与效果比较。
1.2.1　提取液的配制
1)热硼酸法 RNA提取液:200 mmol/L硼酸钠
(pH9.0)、30 mmol/LEGTA、10 mmol/LDTT、 1%
SDS、1%DOC、2%PVP,用灭菌的三蒸水配制。
2)异硫氰酸胍法 RNA提取液:4 mol/L异硫氰
酸胍 、25 mmol/L柠檬酸钠(pH7.0)、0.5%十二烷
基肌氨酸钠 ,用灭菌的三蒸水溶解 ,使用前加 1%的
β -巯基乙醇 。
1.2.2　实验步骤
1)热酸性酚抽提法
称取 0.2g新鲜或 -70 ℃保存的杜鹃花花瓣以
液氮充分研磨至粉末状 ,将研磨好的粉末迅速转移
至离心管后用 700μLTES溶液重悬沉淀 ,再加 700
μL酸性酚 ,剧烈振荡混匀 , 在 65 ℃温浴 30 ～ 60
min,并不时用旋涡振荡器短暂振荡 。冰浴放置 5
第 32卷第 1期
2008年 2月 　　　 　　　
南昌大学学报(理科版)
JournalofNanchangUniversity(NaturalScience)
Vol.32 No.1
Feb.2008 　
min, 4 ℃, 12 000 r/min离心 10 min,上清转移到一
干净的 1.5mL离心管中 ,加等体积的酸性酚 ,剧烈
振荡 , 4℃, 12 000 r/min离心 10 min。重复酸性酚
抽提 ,直至酚相与水相之间无明显的蛋白质 。取出
上清 ,加等体积的氯仿 , 振荡混匀 , 4 ℃, 12 000 r/
min离心 10 min,取出上清 ,加 1/10体积的 3 mol/L
乙酸钠(pH5.3)及 2.5倍体积的冰冷的无水乙醇 ,
冰上放置 15 ～ 20 min, 4 ℃, 12 000 r/min离心 10
min,弃上清 ,用冰冷的 70%乙醇洗涤沉淀 ,用 50μL
DEPC水重溶沉淀 ,保存于 -70 ℃备用。
2)热硼酸法
称取 5g新鲜或 -70 ℃保存的杜鹃花花瓣以液
氮充分研磨至粉末 , 将粉末加入装有预热过的 25
mL提取缓冲液的匀浆器中 ,匀浆 2 min。然后加 1
mL蛋白酶 K(20 mg/mL)后混匀;42 ℃,在摇床上
100 r/min温浴 1.5 hr,加 2 mol/LNaCl至终浓度
160mmol/L,冰上放置 1 h, 4 ℃, 12 000 r/min离心
30 min后 ,将上清液移入新离心管 ,加入 1 /4体积的
10 mol/LLiCl至终浓度 2 mol/L, 4 ℃沉淀过夜 。 4
℃, 12 000 r/min离心 30 min,弃上清 ,用 4 ℃预冷
的 2 mol/LLiCl洗涤 2 ～ 3次 ,每次洗涤后 4℃,
12000 r/min离心 20 min, 用 DEPC水溶解沉淀 , 4
℃, 12 000 r/min离心 10 min, 取上清加 2 mol/L
NaAc至终浓度 200mmol/L,冰上放置 15 min后 ,然
后 4 ℃, 12 000r/min离心 10min,取上清加 2.5倍
体积的无水乙醇 ,混匀后放入 -70 ℃沉淀 1 ～ 2 h, 4
℃, 12 000 r/min离心 30min,用预冷的 70%乙醇洗
2次 ,自然风干 ,溶于适当 DEPC水中于 -70℃保存
备用[ 4] 。
3)异硫氰酸胍法
称取 1g新鲜或 -70 ℃保存的羊踯躅花瓣以液
氮充分研磨至粉末状 ,研磨中不断缓慢倒入液氮防
止材料解冻 。加入 5 mLRNA提取液 , 0.5mL醋酸
钠(2mol/L, pH4.0),继续研磨 ,转移入离心管后加
等体积的水饱和酚 , 1 /10体积的氯仿:异戊醇(49：
1),盖紧盖子后 ,振荡混匀 ,冰上放置 10 min。然后
4 ℃, 12 000 r/min离心 15min,小心取出上清 ,再加
入等体积的水饱和酚:氯仿:异戊醇(50：49：1),
上下颠倒混匀后 ,冰上放置 10 min。 4℃, 12 000 r/
min离心 15 min,取出上清液 ,若蛋白质过多 ,则再
重复一次 ,后在上清中加入约 1体积的异丙醇 , -20
℃放置 1 h以上 。 4 ℃, 12 000 r/min离心 15 min,
弃上清 ,沉淀用 1 mLDEPC水回溶 ,加入等体积的
水饱和酚:氯仿:异戊醇(50：49：1),混匀。 4 ℃,
12 000 r/min离心 15 min,上清用氯仿:异戊醇(49
：1)抽提 1 ～ 2次 。取出上清 ,加入 1/10体积的 3
mol/L乙酸钠(pH5.2)和 3体积的无水乙醇 ,混匀 ,
-20 ℃放置过夜。 4 ℃, 12 000 r/min离心 15 min,
弃上清 , 70%乙醇洗两次 。弃去上清液 ,然后室温干
燥 5 ～ 10min,注意不要干燥过分 ,否则会降低 RNA
的溶解度 。然后将 RNA溶于 50 μLDEPC水中 ,必
要时可 55 ～ 60℃水浴 10min。RNA保存于 -70℃
备用 5。
4)改良的异硫氰酸胍法
称取 1g新鲜或 -70℃保存的羊踯躅花瓣用液
氮充分研磨至粉末状 ,研磨中不断缓慢倒入液氮。
加入 5 mL2 ×异硫氰酸胍法 RNA提取液 ,继续研
磨 ,转移到离心管后加入等体积的水饱和酚:氯仿:
异戊醇(50：49：1), 1/10体积的醋酸钠(2 mol/L,
pH4.0),盖紧盖子后 ,振荡混匀 ,冰上放置 10 min。
(后操作同异硫氰酸胍法)
2　结　果
2.1　RNA样品的质量检测
取 5 μLRNA样品进行非变性凝胶电泳分析。
结果表明用热酸性酚抽提法提取的总 RNA降解非
常严重 , 28 S和 18 S两条主带不能分辨 ,甚至完全
降解(附图 a)。用热硼酸法看不到三条主带 ,可见
这种方法更加不适合羊踯躅花瓣总 RNA的提取
(附图 b)。异硫氰酸胍法虽然可以较完整的提取花
瓣 RNA,但含有较多的杂质和 DNA且 RNA有一定
的降解(附图 c)用改良的异硫氰酸胍法 28S、18S和
5SrRNA带型清晰 , 28S和 18SrRNA与 EB结合量
比值约为 2：1。且两条带之间无弥散现象 ,说明提
取的总 RNA质量好 、基本无降解现象(附图 d)。
·63·第 1期　　　　　 王　燕等:羊踯躅花瓣总 RNA提取方法的比较与改进
附图　RNA的电泳检测图谱
(a)　热酸性酚抽提法;(b)　热硼酸法;
(c)　异硫氰酸胍法;(d)　改良的异硫氰酸胍法
1:羊踯躅黄花　2:羊踯躅红花
2.2　RNA样品的纯度和得率
取 5μLRNA样品用 DEPC水稀释 100倍后 ,用
721分光光度计测其 OD260和 OD280,每个样品每
个波长重复测量 3次 ,取平均值(表 1)。用改良的
异硫氰酸胍法提取的 RNA,其 OD260 /OD280比值
在 2.0左右 ,说明用此法提取的 RNA受多糖 、多酚
类 、蛋白质物质污染程度小 ,纯度较高 。
表 1　不同方法提取羊踯躅花瓣总 RNA的结果
方法 OD260 /OD280 电泳结果
热硼酸法 1.3-1.4 无条带
热酸性酚抽
提法 1.6-1.8
有降解的条带 , 有弥
散现象
异硫氰酸胍
法 1.8-1.9
有较明显的条带 , 稍
降解 ,含杂质或 DNA
改良的异硫
氰酸胍法 1.9-2.1
有明显的三条主带 ,
无降解 、弥散现象
3　讨　论
不同植物不同组织 RNA提取的适宜方法各不
相同。本研究表明常规 RNA提取方法 ,如热酸性酚
抽提法 、热硼酸法 、异硫氰酸胍法均无法得到较高纯
度的羊踯躅花瓣总 RNA,甚至根本得不到 RNA。通
过多次实验发现改良的异硫氰酸胍法(附图 d)得到
的羊踯躅花瓣总 RNA条带完整 、分明 、清晰 , OD260 /
OD280的值在 1.9-2.1之间 ,说明提取的总 RNA质
量较好 ,纯度很高 ,完整性很好 ,既未被降解也没有
被多糖及蛋白质污染 。
原异硫氰酸胍法(附图 c)虽然可以比较完整地
提取羊踯躅花瓣 RNA,但所得 RNA中混有较多杂
质。加样孔内有较多杂质 ,同时泳道内弥散有较多
基因组 DNA和粘多糖样物质 。实验中可发现所得
RNA异常粘稠 ,吹干后很难溶解 。方法改进后可增
加用水饱和酚进行抽提的次数 ,可尽量从水相中除
去基因组 DNA。改良的异硫氰酸胍法在研磨时加
大了提取液的浓度使细胞能有效的裂解 ,充分的释
放出 RNA。同时由于增大了高浓度的巯基乙醇使
整个提取过程在较强的还原性环境中完成 ,避免残
存的多酚及其它物质发生氧化而与核酸结合 。第一
步抽提时增加氯仿:异戊醇(49：1)的用量可以去
除剩余的蛋白质使 RNA充分溶解在上清中 ,增加了
RNA的有效提取量。
对植物材料进行 mRNA差异显示 (mRNA
DDRT-PCR), cDNA文库的构建 、蛋白质的体外翻
译及基因表达的 Northern印迹研究等均需提取高质
量的 RNA[ 6] ,所以羊踯躅花瓣总 RNA的质量包括
完整性和纯度是相当重要的 ,制备高质量的 RNA是
试验的一个关键 。影响总 RNA提取质量的因素是
多方面的 ,如组织的破碎程度 、RNase的活性 、多糖
和蛋白质等大分子物质的存在 [ 7] ,这些物质的存在
不仅影响到总 RNA的提取效率而且还干扰以后的
反转录 、酶切和体外扩增[ 8] 。本研究将所取羊踯躅
花瓣尽快液氮研磨成粉末 ,尽最大可能使组织破碎;
RNA酶是影响 RNA完整性的最大因素 ,内源 RNA
酶无法去除 ,只能用 RNA酶抑制剂抑制它的活性;
而外源 RNA酶分布极其广泛 ,在空气 、水 、唾液 、汗
水中都存在 RNA酶 ,并且 RNA酶不易失活。因此
试验在提取 RNA前的准备工作做的很充分 ,在羊踯
躅花瓣总 RNA提取过程中 ,所用到的所有器皿及相
关药品 ,都进行了灭菌和灭活 RNA酶的处理;提取
的全过程必须在清洁无尘的环境中进行 ,操作时使
用一次性手套 ,并且要减少走动 。另外样品最好新
鲜 ,且研磨彻底 ,因为试验的过程中发现样品虽然存
放在 -70 ℃的冷冻冰箱里 ,但是往往时间较长 ,提
取的 RNA效果经过电泳检测以后 ,发现条带不清晰
或者有降解的情况出现;提取过程中取上清时 ,动作
要轻 ,一定不要取到中间层 ,这也关系到 RNA提取
的质量。本试验采用了改良的异硫氰酸胍法成功地
获得了高质量的 RNA,其纯度较高 ,完整性也较好。
参考文献:
[ 1] 　MeijerA.H, ScarpellaE, VanDijkEL, eta1.Transcrip-
tionalRepressionbyOshoxl, AnovelHomeodomainLeu-
cineZipperProteinFromRice[ J] .PlantJ, ll, 1997:263
·64· 南昌大学学报(理科版) 2008年　
-276.
[ 2] 　VicientCM, DelsenyM.IsolationofTotalRNAfromAra-
bidopsis, ThaliansSeeds[ J] .AnaBiochem, 1999, 268:4l2
-413.
[ 3] 　李　宏 , 王新力.植物组织 RNA提取的难点及对策
[ J] .生物技术通报 , 1999, 15(1);36-39.
[ 4] 　WanCY, WilkinsTAA.ModifiedHotBorateMethod
SignificantlyEnhancestheYieldofHigh-QualityRNA
fromCoton(GossypiumhirsutumL.)[ J] .Analytical
Biocem, 1994, 223:7-12.
[ 5] 　顾红雅 , 瞿礼嘉 , 明小天 , 等.植物基因与分子操作
[ M] .北京:北京大学出版社 , 1995:74-92.
[ 6] 　SambrooLJ, ManiatisT, FritschEF.MolecularClonglng
EM.Alaboratorymanual(2nd)[ M] .NewYork:Cold
SpringHarborLaboratorypress, 1989, 39:343-361.
[ 7] 　赵双宜 ,吴耀荣 , 夏光敏.介绍一种简单高效的植物总
RNA提取方法 [ J] .遗传 HEREDITAS, 2002, 24(3):
337-338.
[ 8] 　WalCY, WilkinsTA.Amodifiedhotboratemethodsig-
nificantlyenhancestheyieldsofhighqualityRNAfrom
coton[ J] .AnalBiochem, 1994, 223:7-12
ComparisonandImprovementoftheMethodsforTotalRNA
IsolationfromthePetalsofRhododendronmole
WANGYan, WANGMan-ying, LISi-guang
(1.CollegeofLifeSciences, NanchangUniversity, Nanchang330031, China;
2.KeyLaboratoryofJiangxiSubtropicalPlantResourcesProtectionandUtilization, Nanchang330022, China)
Abstract:TheappropriatemethodsarenotalwayssamebecauseofthediferenceinisolatingRNAfromdiverse
plantsandtissues.Inthispaper, fourmethodsoftotalRNAisolationfromthepetalsofRhododendronmolewere
discussed, includingmethodofhotphenol, hotborate, guanidiniumthiocyanateandmodifiedguanidiniumthiocya-
nate.TheRNAsisolatedwithmethodofmodifiedguanidiniumthiocyanatewereprovedtohavegoodquality, purity
andintegrity, andcanbeusedincDNAlibraryconstruction, northernbloting, mRNADDRT-PCRandsoon.
Keywords:RNAIsolation;thepetalsofRhododendronmole;methodofguanidiniumthiocyanate;modification
(上接第 61页)
InVitroPropagationofVirus-freeby
Soot-tipofDaphneOdoravar.naginataMak
JIANGHong-ru, YUFa-xin, LIUTeng-yun, ZHUQi, GAOZhu, WANGBi-qin, ZHOUHua, WANGXiao-ling
(JiangxiAcademyofSciences, Nanchang330029, China)
Abstract:Thefolowingexperimentalresultshavebeenobtained:theterminalbudsofDaphneodoravar.naginata
MakwerefiresculturedonMS+0.05mg/L6-BA+0.1mg/LNAAfor20daysthenintheconditionofdayand
nightwith34 ℃(11 h)+23 ℃(13 h)For30 days.Thesurviralradiowithshoot-tipof0.2 ～ 0.3 mmwas
80.0% onMS+0.1mg/L6-BA+0.1mgLNAA.Thevirus-freeseedlingswereobtained.Theterminalbudsdif-
fevertiatedanumbersofyoungbudsonMSmediumcontaining6-BA0.5 ～ 1.0mg/LandNAA0.1 mg/L.Onthis
mediumshootmultiplicationoccuredata4.1-foldrate.Theaverageratioofrootingofthehigh-qualityseeding
was82.6%inthesuitableconditionofculture.Thesurvivalratiooftransplantingreached96.5% inthemedium
(pearlite:peatysoil=2：1).
Keywords:Daphneodoravar.naginataMak;virus-freebyshoot-tip;invitropropagation;tissueculture
·65·第 1期　　　　　 王　燕等:羊踯躅花瓣总 RNA提取方法的比较与改进