全 文 ：虎眼万年青多糖对小鼠免疫功能的调节作用
石　磊①　谭　岩②　刘志强　刘淑莹　(中国科学院长春应用化学研究所新药研究室 ,长春 130022)
　　中国图书分类号　R392.12　　文献标识码　A　　文章编号　1000-484X(2002)11-0799-05
摘　要　目的:依据虎眼万年青组分中多糖对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 ,筛选并优化出 60%醇浓度中性多糖活性组
分S3 , 进而研究其对体液免疫 、细胞免疫及细胞因子变化的影响 ,并从细胞和分子水平探讨其作用的机理。方法:采用溶血素
测定方法 ,测定 S3 对小鼠脾细胞溶血素抗体的诱导作用;采用3H-TdR渗入法 ,测定 S3 对 ConA 诱导小鼠脾淋巴细胞的增殖作
用;采用3H-TdR后标记法 , 测定S3对 NK细胞细胞毒活性的影响;以 ELISA 法测定 S3 对小鼠脾细胞 IL-2 产生的影响;利用流
式细胞术 ,检测 S3 对 T淋巴细胞亚群 CD3、CD4、CD8 、CD4 CD8 阳性细胞百分率的影响;采用 RT-PCR方法检测 IL-2 mRNA 的表
达水平。结果:S3 高 、中剂量组能明显增强小鼠脾细胞溶血素抗体的形成(P <0.05);各剂量组均能明显增强 ConA 诱导的淋
巴细胞增殖能力(P <0.001);各剂量组均能增强 NK细胞的细胞毒活性并促进 IL-2 的产生(P <0.001 , P <0.01);高 、中剂
量组 CD8 阳性细胞百分率明显降低(P <0.001),各剂量组均能显著地提高 CD4 CD8阳性细胞百分率(P <0.001);高剂量组
可明显促进脾细胞中细胞因子 IL-2 的 mRNA 表达 ,使表达量增加(P <0.05)。结论:S3 具有较强的增强机体多种免疫功能的
作用 ,可利用开发为一种免疫增强药物。
关键词　虎眼万年青多糖　体液免疫　细胞免疫　白细胞表面分化抗原　RT-PCR
Effects of immunomodulatory activity of polyssacharide from Ornithogalum Cauda-
tum Ait
SHI Lei , TAN Yan , LIU Zhi-Qiang et al.Changchum Institute of Applied Chemistry , Chinese Academy of Sciences ,
Changchun 130022
Abstract　Objective:To sutdy the effects of the polysaccharide(S3)separated out in 60% alcohol aqueous from OCA on their immuno-
modulatory functions in mice.Methods:After screening the most effective component of S3 by phagocytic function of macrophage , further tests
about the effects both on the humoral immunity and the cellular immunity of S3 in mice were studied.Results:S3 simulated the production of
the antibody on the haemolysin test , selectively enhanced ConA induced murine proliferation of lymphocytes(P <0.001)and the cytotoxic ac-
tivity of splenic NK cell , and promoted IL-2 production of ConA stiumulate splenocytes in mice significantly(P <0.001 , P <0.01 , respec-
tively).In the mean while , it promoted the positive proliferation of CD3 , CD4 , CD4 CD8 and made CD8 declined among the T cell lines.RT-
PCR analyses also showed that mRNA expression of IL-2 could in some extend be promoted.Conclusion:S3 possessed potent immunomodulat-
ing effects in mice and it would be one of the important effective fractions of OCA ,which deserved further studies on the bioactive activity to de-
velop it into an active BRM.
Key words　Poly saccharide from OCA　Humoral immunity　Cellular immunity　CD　RT-PCR
　　近年来研究表明 ,广泛存在于动物细胞膜 、植物
和微生物细胞壁中的多糖类物质能提高机体免疫功
能 ,它不仅能促进T 细胞 、B细胞 、MΥ细胞等免疫细
胞的功能 ,还能促进细胞因子的生成[ 1] 。虎眼万年
青(Ornithogalum caudatum Ait ,OCA),俗称珍珠草 ,为
百合科 、虎眼万年青属[ 2] 、有尾种多年生草本植
物[ 3] 。从同属虎眼万年青中分离出的皂甙 OSW-1
①吉林大学公共卫生学院 ,长春 130021
②吉林大学第一临床医院中心实验室 ,长春 130021
作者简介:石　磊 ,女 , 34岁 ,医学硕士 ,在读博士;
指导教师:刘淑莹 ,女 , 59岁 ,博士生导师 ,主要从事药物质谱及免疫
质谱方面的研究。
对肺癌 、乳腺癌有明显的抗癌活性。体外抗 P338淋
巴细胞白血病活性结果表明 ,OSW-1是常见抗癌药
物喜树碱 、阿霉素 、紫杉醇抗癌活性的 10 ～ 100
倍[ 4] ,并已由 Deng等人首次合成[ 5] 。我们对虎眼万
年青不同成分进行了体外抑瘤实验 ,发现总生物碱 、
总皂甙 、总多糖对多种瘤株均显示出不同程度的抑
制作用。为了进一步了解多糖抑瘤的作用机理 ,我
们首先通过非特异性免疫功能试验 ,筛选出具有显
著提高小鼠巨噬细胞吞噬功能的活性组分 ———60%
醇浓度的中性多糖(S3)[ 6] 。本文进一步对 S3在小
鼠体液免疫 、细胞免疫的调节作用进行了研究 ,同
时 ,通过流式细胞术客观地对 T 淋巴细胞亚群的变
·799·石　磊等　虎眼万年青多糖对小鼠免疫功能的调节作用　第 11 期
化进行了检测 ,并利用 RT-PCR方法检测了 S3对脾
细胞中细胞因子 IL-2 mRNA表达水平的影响 ,从细
胞和分子水平对其免疫调节作用机制进行了研究 。
1　材料与方法
1.1　S3的制备　虎眼万年青全草经 80%乙醇回馏
脱脂后 ,用热水反复提取 ,提取液浓缩至一定体积
后 ,离心除去杂质 ,醇沉 ,使乙醇终浓度达 60%,沉
淀反复用水无乙醇 、乙醚 、丙酮处理 ,得淡黄色粉末 ,
真空干燥后即得 S3。
1.2　实验动物　BALB c小鼠 , 6 ～ 8周龄 ,雄性 ,体
重18 ～ 20g ,购自吉林大学动物实验部 。NK敏感细
胞株 Yac-1细胞 ,由吉林大学第一临床医院中心实
验室提供 。
1.3　主要试剂　3H-TdR ,中国科学院原子能研究院
同位素研究所。Con A ,Sigma 公司 。补体 ,新鲜补体
血清 ,吉林中医中药研究院药理生化室。小鼠 IL-2
ELISA试剂盒 ,晶美生物工程有限公司 。双色荧光
抗体FITC标记的CD3 和PE标记的CD4 、CD8 小鼠单
克隆抗体 ,购自深圳达科为生物技术有限公司 。
IL-2及HPRT 引物均由宝泰克公司合成。
1.4　约药方案　每天 ig 给药一次 ,剂量为蒸馏水
对照组 20 ml kg体重 ,S3高 、中 、低三个剂量组分别
配成 5%的悬浊液 ,30 ml (kg·d)体重 ,每天 0.4 ml ,
连续给药 10 d。
1.5　体液免疫试验方法　参照一种改进的体液免
疫功能测定方法 ———溶血素测定方法[ 7] ,提取上述
保存的绵羊红细胞 ,使红细胞浓度为每毫升约 20亿
个。按每只鼠 0.2 ml腹腔注射 ,免疫 4 d后 ,将小鼠
处死 ,摘除小鼠眼球 ,将每只小鼠血分别滴至小试管
内 ,室温放置1 h ,使血清充分渗出后离心 ,上层血清
用生理盐水稀释后取 1 ml ,再加入 0.5 ml绵羊红细
胞。置于冰浴水中冷却 ,加入 1 ml补体 ,离心 ,取上
清液 1 ml及 3 ml都氏度剂 ,振荡均匀 ,放置 10 min
后 ,于 540 nm波长下比色 ,测定样品及绵羊红细胞
半数溶血时的OD值。
1.6　淋巴细胞转化试验　将小白鼠颈椎脱臼处死 ,
无菌取脾 ,制备脾细胞悬液 ,细胞浓度为 1×106个
ml ,重量。取小鼠脾脏 , 夹碎 , 研磨 , 过滤后用含
10%小牛血清的 IMDM 培养液配制成 1×106 个 ml
浓度的单细胞悬液。取 100μl于 96孔培养板中 ,加
入有丝分裂原 10.0 μg ml ConA ,每孔终体积为 200
μl。37℃培养 48 h后加入3H-TdR 2 μCi 孔 ,继续培
养12 h后收获 。用多头细胞收集器将细胞收集于
纤维素滤膜上 ,用蒸馏水反复冲洗 ,再滴加 50.0 g L
三氯醋酸 2 ml ,使样品固定 ,无水乙醇 2 ml流洗脱
色后 ,置于 80℃烘箱内干燥 30 min。将烘干的内滤
膜放入盛有 5 ml闪烁液的测量杯中 ,置于液体闪烁
仪中测 cpm值 。每份样品测 3个复孔 。
1.7　NK 细胞活性测定试验 　参照3H-TdR后标记
法[ 8] ,取Yac-1细胞和效应细胞悬液各 50μl(效靶比
为 100∶1),加入 96孔培养板中 ,再加入 0.1 ml培养
液 ,同时设效应细胞和靶细胞对照 ,置于 37℃, 5%
CO2 箱中培养6 h。渗入 0.5μCi 20 ml的3H-TdR ,培
养 6 h后收获 。用多头细胞收集器将细胞收集于纤
维素滤膜上 ,用蒸馏水反复冲洗 ,再滴加 50.0 g L三
氯醋酸 2 ml ,使样品固定 ,无水乙醇 2 ml流洗脱色
后 ,置于 80℃烘箱内干燥 30 min。将烘干的滤膜放
入盛有 5 ml闪烁液的测量杯中 ,置于液体闪烁仪中
测 cpm 。每份样品测 3个复孔 。
1.8　白细胞介素 2(IL-2)活性测定试验　取 1×106
个 ml浓度的小鼠脾细胞单细胞悬液 100μl于 96孔
培养板中 ,加入有丝分裂原 10.0μg ml ConA ,每孔终
体积为 200 μl。取上清冻存于 -20℃。参照小鼠
IL-2 ELISA试剂盒 ,测量OD450值。
1.9　流式细胞术测定试验　取 1×107个 ml浓度的
小鼠脾细胞单细胞悬液 100 μl于小离心管中 ,分别
加入FITC 标记的 CD3 ,PE标记的 CD4 、CD8 抗体 10
μl ,振荡混匀 ,室温 、避光放置 30 min ,用 PBS洗涤 2
遍 ,再加入 500 μl的 PBS混匀 ,10 min后用流式细胞
仪 FACS Calibur(美国 BECTON DICKINSON公司)检
测 CD3 、CD4 、CD8 、CD4 CD8 阳性表达率。
1.10　RT-PCR方法检测 IL-2的 mRNA表达试验　
参照 Chomczynski法提取培养小鼠组织总 RNA[ 9] ,利
用 RT-PCR法扩增小鼠脾组织 IL-2 mRNA , IL-2引物
1(5 -TCCACTTCAAGCTCTACAG-3 ), 引物 2(5 -
GAGTCAAATCCAGAACATGCC-3 ),HPRT 引物 1(5 -
GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTGGTT-3 ), 引物 2
(5 -GAGGGTAGGCTGGCCTATGGCT-3 )。取 dNTP 2
μl ,10×RT buffer 1 μl , RP 引物 1 μl ,酶混合液 1 μl ,
每份样品加入 1 μl RNA , 42℃作用 30 min。分别加
入 dNTP 2μl ,10×PCR buffer 1.5μl , IL-2引物 1+2 ,
HRPT 引物 1+2各 1 μl ,TaqDNA聚合酶 1 U ,上机循
环 。循环温度为:94℃变性 1 min , 58℃1 min ,72℃2
min ,72℃2min ,共35个PCR扩增循环 ,72℃延伸 10
min ,扩增产物在 1.5%琼脂糖凝胶电泳观察 DNA带
的强弱 。紫外分析仪进行电泳图象分析 ,以评价 IL-
2 mRNA的相对表达水平 。
·800· 中国免疫学杂志 2002 年第 18卷
2　结果
2.1　S3对小鼠溶血素抗体形成的影响　图 1中 ,
Rg1为阳性对照人参皂苷 ,与对照组相比 ,S3高 、中
剂量组有增强小鼠体液免疫功能的作用(P <
0.05),首先在肯定 S3对小鼠巨噬细胞吞噬功能的
非特异性免疫功能的基础上 ,又进一步证明了它在
特异性免疫功能方面的潜力。接下来 ,我们对S3在
细胞免疫功能方面的作用进行了深入的研究 。
2.2　S3对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响　由表
1可见 ,将不同浓度 S3 处理后的小鼠淋巴细胞与
ConA共同培养 48 h ,结果低 、中 、高剂量组均能明显
增强有 ConA诱导的淋巴细胞增殖能力 ,与对照组
比较 ,有极显著性差异。
2.3　S3对NK细胞活性的影响　NK细胞是细胞免
疫中非特异部分 ,本实验检测了 S3 对小鼠脾细胞
NK细胞的细胞毒活性的变化 ,结果如表 2。
　　由表 2可见 ,将不同浓度S3处理后的效应细胞
与靶细胞共同培养 6 h ,结果中 、低 、剂量组均能明显
增强NK细胞的细胞毒活性 ,与对照组比较有显著
性差异。
2.4　S3对 IL-2活性的影响　在细胞免疫结果基础
上 ,我们利用小鼠 IL-2 ELISA 试剂盒观察了 S3 对
IL-2生成的影响 ,探讨了其对小鼠生成 IL-2蛋白水
平的变化 。
　　由表 3可见 ,不同浓度 S3处理后的小鼠脾淋巴
细胞在 ConA 刺激下产生 IL-2 的能力 ,与对照组比
较 ,高 、中 、低剂量组均有显著性差异 ,可见 S3对小
鼠产生 IL-2蛋白水平的变化 ,作用非常显著 。
2.5　S3对 T淋巴细胞亚群的影响　IL-2是 T 淋巴
细胞产生的细胞因子 , IL-2含量的增高与 T 淋巴细
胞密切相关 。在上述实验基础上 ,我们用流式细胞
术检测了 S3对小鼠T 淋巴细胞亚群变化的影响 ,探
讨了不同浓度 S3对白细胞表面分化抗原 CD 分子
变化的影响。
　　由表 4可见 ,不同浓度 S3处理后的小鼠脾淋巴
细胞能使 CD3 、CD4 、CD4 CD8有不同程度升高 ,CD8
有下降趋势 ,高 、中剂量组与对照组比较有显著性差
异(P <0.001),各剂量组 S3均能使 CD4 CD8显著
升高 。
　　图2为对照组与高剂量组一样品 T 淋巴细胞变
化的散点图 ,清晰地说明了 CD3 、CD4 、CD8 、CD4 CD8
的变化情况。
图 1　S3对小鼠溶血素抗体形成的影响
Fig.1　Effects of S3 on the haemolysin production in mice
Note:n =10 , ＊P <0.05 , ＊＊P <0.01 compared with control.
表 1　S3对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响(x±s)
Tab.1　Effects of S3 on the ConA stimulated lymphocytes pro-
liferation in mice(x ±s)
Groups Dose〔WB (g·kg)〕 SI
Cont rol — 5.26±0.48
High dose of S3 1.0 10.30±0.381)
Middle dose of S3 0.5 16.13±1.161)
Low dose of S3 0.25 11.96±0.451)
Note:n =10 ,1)P <0.001 compared with control.
表 2　S3对 NK细胞活性的影响(x±s)
Tab.2　Effects of S3 on cytotoxic activity of splenic NK in mice
(x±s)
Groups Dose〔(WB (g·kg)〕 NK cytotoxic
activity(%)
Cont rol — 28.75±11.34
High dose of S3 1.0 34.93±7.14
Middle dose of S3 0.5 69.93±10.822)
Low dose of S3 0.25 46.05±6.201)
Note:n =10 ,1)P <0.01, 2)P <0.001 compared with control.
表 3　S3对 IL-2 活性的影响(x±s)
Tab.3　Effects of S3 on IL-2 production by mice splenocytes
(x±s)
Groups Dose〔WB (g·kg)〕 IL-2 activity(pg ml)
Cont rol — 35.6±28.46
High dose of S3 1.0 113.5±31.842)
Middle dose of S3 0.5 246.1±54.852)
Low dose of S3 0.25 101.3±35.441)
Note:n =10 ,1)P <0.01, 2)P <0.001 compared with control.
·801·石　磊等　虎眼万年青多糖对小鼠免疫功能的调节作用　第 11 期
表 4　S3 对 T淋巴细胞亚群的影响(x ±s)
Tab.4　Effect of S3 on CD3、CD4 、CD8 cells counts by mice splenocytes(x±s)
Groups
Dose
〔WB (g·kg)〕 CD3 CD4 CD8 CD4 CD8
Control — 37.12±4.69 29.17±4.41 14.68±2.78 2.09±0.66
High dose of S3 1.0 38.73±6.77 30.28±5.72 9.05±1.682) 3.44±0.841)
Middle dose of S3 0.5 39.09±7.93 29.72±5.71 9.43±1.672) 3.17±0.451)
Low dose of S3 0.25 39.10±9.14 35.76±7.53 12.64±4.62 3.13±0.661)
Note:n =10 , 1)P <0.01 , 2)P <0.001 , compared with cont rol.
图 2　S3 中高剂量组某一样品与对照组对小鼠 T淋巴细胞亚群变化的比较
Fig.2　Contrast of high dose S3 to the control on T cells counts by mice splenocytes
Note:115 , 116 represent the control , 413 ,414 represent the high dose.
表 5　S3 对 IL-2 mRNA表达的影响(x±s)
Tab.5　Effects of S3 on the IL-2 mRNA of mice splenocytes by
RT-PCR analysis(x±s)
Groups Dose〔(WB (g·kg)〕 Rate of IL-2 mRNA
by RT-PCR analysis
Control — 2.23±0.89
High dose of S3 1.0 1.44±0.561)
Middle dose of S3 0.5 1.86±0.25
Low dose of S3 0.25 ———
Note:n =10 , 1)P <0.05 , compared with control.
图 3　RT-PCR 法检测高剂量 S3对小鼠 IL-2 mRNA的表达
Fig.3　Message expression on IL-2 mRNA of the high dose S3
by RT-PCR
Note:The fi rst lane.HRPT;the second lane IL-2.
2.6　S3对 IL-2 mRNA表达的影响　由于不同浓度
S3处理后的小鼠脾淋巴细胞在 ConA 刺激下产生
IL-2的能力有明显增高 ,我们进一步从基因水平研
究了S3对 IL-2 mRNA表达的变化情况 ,探讨了其对
小鼠生成 IL-2基因水平的变化 。
　　由表 5可见 ,不同浓度S3处理后的小鼠脾淋巴
细胞能促进脾细胞中细胞因子 IL-2的 mRNA表达 ,
使表达量增加 ,高剂量组与对照组比较 ,有明显差异
(P <0.05),图 3为高剂量组 10 个样品小鼠 IL-2
mRNA的 PCR扩增产物电泳结果 ,实验结果进一步
从基因水平验证了 S3对 IL-2生成的影响。
3　讨论
多糖类化合物主要是依赖于对免疫功能具有较
强的调节作用 ,从而表现出具有一定的抗衰老 、抗病
毒和抗肿瘤的作用 。本项研究首次表明 ,60%醇浓
度的虎眼万年青中性多糖活性组分 S3在促进巨噬
细胞吞噬功能的非特异性免疫活性的基础上 ,使巨
噬细胞处理和传递抗原的能力增强 ,提高了抗体的
水平 。同时 ,还能增强小鼠 T 、B 淋巴细胞的转化 、
提高NK细胞细胞毒活性 、促进小鼠脾细胞产生白
细胞介素2(IL-2)。 IL-2是促进细胞毒 T 细胞(CTL)
和自然杀伤细胞(NK)细胞的增殖与分化的重要调
控因子。S3促进 T细胞的增殖反应和 IL-2的分泌 ,
·802· 中国免疫学杂志 2002 年第 18卷
有利于增强细胞毒 T 细胞和 NK细胞的杀瘤效应 。
T 淋巴细胞亚群是构成机体免疫防御系统的重要因
素。T 淋巴细胞中辅助性 T 细胞 CD4和抑制性T 细
胞CD8两个主要亚群 ,这两类细胞相互变化 、调整
可以维持机体内的免疫平衡。CD4具有调节免疫反
应的活性 ,辅助 B细胞产生抗体 ,分泌细胞因子的
作用 ,而CD8则有免疫抑制和细胞毒性的作用。S3
能不同程度地使 CD3 、CD4 、CD4 CD8升高 ,而使 CD8
下降 ,进一步证实了 S3对辅助性 T 细胞(Th)的增强
作用及对抑制性 T 细胞(Ts)的降低作用 ,推测辅助
性T 细胞(Th)可能是其主要的原发刺激细胞 。不同
浓度S3能在一定程度上促进 IL-2的mRNA表达量 ,
从基因水平上又进一步证实了 S3对 IL-2生成的影
响 ,推断S3有促进小鼠免疫功能的作用。
本研究结果从非特异性免疫 、体液免疫和细胞
免疫的角度 ,较全面地研究了 S3对机体的免疫增强
作用和对免疫应答的调节作用。同时 ,从分子及基
因水平较全面地研究了S3的免疫增强作用 ,结合对
该组分的分离鉴定工作 ,对其作用机制进行更加深
入的研究 ,不仅有助于进一步说明 S3的免疫调节作
用机制 ,而且对进一步开发利用这一天然药物也具
有实验意义。
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[收稿 2002-07-22]
(编辑　许四平)
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·803·石　磊等　虎眼万年青多糖对小鼠免疫功能的调节作用　第 11 期