全 文 ：华重楼(Paris Linnaeus)属百合科多年生草本
植物， 又名灯台七、 七叶一枝花等， 具有清热解
毒、 消肿止痛、 凉肝定惊等功效， 此外还有止血、
抗肿瘤、 免疫调节及保护心血管等多方面的生理活
华重楼根际土芽胞杆菌多样性研究①
陈倩倩 1,2)② 刘 波 1)③ 刘国红 1) 车建美 1) 龚海艳 1)
(1 福建省农业科学院农业生物资源研究所 福建福州 350003；
2 福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室 福建福州 350002)
摘 要 为了解华重楼根际芽胞杆菌种群多样性信息， 本研究采用稀释平板法分离福建省光泽县华重楼品种根
际的芽胞杆菌， 并对其进行16S rRNA序列分析。 结果表明： 从华重楼根际共分离到 17个形态差异的芽胞杆菌
菌株； 16SrRNA序列分析表明， 17个菌株鉴定为 8个种， 归属于 4个属， 芽胞杆菌属(Bacillus)、 赖氨酸芽胞
杆菌属(Lysinibacillus)、 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和绿芽胞杆菌属(Viridibacillus)， 其中芽胞杆菌属的种类和
数量最多。 经抑菌试验分析， 芽孢杆菌属的特基拉芽孢杆菌 FJAT-43012对尖孢镰刀菌具有抑制作用。 本研究结
果表明， 华重楼根际芽胞杆菌种群多样性较为丰富。 本研究对芽胞杆菌资源的开发和利用提供良好的实验材料
和理论基础。
关键词 芽胞杆菌 ； 华重楼 ； 根际土壤 ； 多样性
分类号 Q938.1
Diversity of Culturable Bacillus Species from Paris Linnaeus
Rhizosphere Soil
CHEN Qianqian LIU Bo LIU Guohong CHE Jianmei GONG Haiyang
(1 Agrobiological Resource Research Institute,
Fujian Academy of Agriculture Sciences, Fuzhou, Fujian 350003
2 Ministry of Education Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology,
Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)
Abstract The aim of this study was to determine the diversity of the cultivable Bacillus species
population in the rhizosphere of Paris Linnaeus. Bacillus species were isolated from the soil samples from
Guangze, Fujian Province by using dilution plating technique on Nutrient-Agar medium. 17 isolates were
obtained through morphological difference, andidentified by 16S rRNA. Phylogenetic analysis based on
16S rRNA gene sequencing showed that the 17 isolates were grouped into 4 genera (Bacillus,
Lysinibacillus, Paenibacillus and Viridibacillus) with 9 distinct species. All of these species were owned to
the genus Bacillus. B.tequilensis FJAT-43012 possessed significantly inhibitory activities against Fusarium
oxysporum. In conclusion, the result of this study showed that the population diversity of the cultivable
bacteria was abundant andvarious. The findings providean important scientific base for the development
and utilization of Bacillus resources.
Keywords Bacillus ; Paris Linnaeus ; rhizosphere soil ； diversity
Vol．35, No．12
2015年12月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第35卷第12期
Dec． 2015
① 基金项目： 农业科技成果转化资金项目(No.2013GB2C400236)； 福建省公益项目(No.2014R1102)。
收稿日期： 2015-09-16； 责任编辑/凌青根； 编辑部 E-mail:rdnk@163.com。
② 陈倩倩(1983～)， 女， 博士， 研究方向为微生物学， E-mail:chenqqkib@163.com。
③ 通讯作者： 刘 波(1957～)， 男， 博士， 研究员， 研究方向为微生物生物技术与农业生物药物，
E-mail:liubofaas@163.com。
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2015年12月 第35卷第12期热带农业科学
性， 是一些重要中成药和新药如云南白药、 宫血宁
等主要成分之一[1-2]， 开发和利用这一自然资源有
十分重要的意义。 我国为该属植物的分布中心之
一， 共有19种， 种类多， 广泛分布于福建、 云南、
四川、 江苏、 安徽、 浙江、 江西等省区[3]， 福建是
华重楼的主要分布区。 华重楼根茎多年生， 茎叶当
年倒苗， 繁殖率低， 从发芽到药用， 一般需5年以
上， 种子存在二次休眠， 资源再生慢[4]。 药用植物多
与微生物共生， 根际微生物通过产生各种代谢产物
影响植物生长和营养物质的吸收、 固氮或植物激素
的产生[5-7]。 植物根际是土壤-植物生态系统物质交换
的环境， 土壤细菌既是土壤微生物区系的重要组成
部分， 也是土壤物质流和能量流的主要推动者[8]。
芽孢杆菌是土壤和植物微生态的优势微生物种
群， 其特征是能够产生抗逆性强的芽孢， 这对菌体
的生存、 产品加工及其在环境中的存活和定殖都十
分有利， 是一种理想的生防菌， 许多性状优良的拮
抗菌株已成功地应用于植物病害的生物防治中[9]。
分离、 筛选各种不同的芽胞杆菌为生物农药的开发
等提供了基础资源[10]， 具有重要意义。 土壤是芽胞
杆菌主要的来源， 对华重楼根系土芽胞杆菌的研
究， 可揭示微生物种群构成， 推动促生菌的发掘，
有效解决资源保护和开发利用的矛盾问题。 本次试
验从采集自福建省南平市光泽县的华重楼根系土中
分离芽胞杆菌， 对其进行系统分类， 探究该土壤是
否含有促进华重楼生长的特殊功能芽孢杆菌。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1供试土样
本次试验所用土样为苏海兰于 2015年 4月采
集。 采集地点为福建省南平市光泽县用刮刀轻轻刮
取附着在华重楼根表面的土壤， 视为根际土壤。 土
壤样品采集后放入无菌袋内， 置于4℃冰箱备用。
1.1.2培养基
NA培养基： 牛肉浸膏 0.3%， 酵母浸膏 0.1%，
蛋白胨0.5%， 葡萄糖1%， 琼脂1.7%， pH7.0～7.2。
LB培养基： 胰蛋白胨 1%， 酵母浸粉 0.5%， NaCl
0.5%， 琼脂 1.7%， pH7.0～7.2。
发酵液体培养基： 葡萄糖0.5%， 牛肉膏0.3%，
蛋白胨1%， MgSO4·7H2O0.02%， pH7.0～7.2。
1.2方法
1.2.1菌株分离纯化
将采自于福建省南平市光泽县华重楼根系土，
进行系列10倍梯度稀释后， 置到80℃的水浴中加
热10min， 然后涂布于LB培养基， 30℃培养3～5d
后， 挑取平板上的单菌落进行连续划线纯化保存菌株。
16SrRNA扩增： DNA提取按照DNA提取试剂盒
(generaybitehch)操作。 以芽胞杆菌基因组为模板，
16SrRNA扩增采用细菌通用 16SrRNA引物[11]27F
(5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492R(5′- CGGC-
TACCTTGTTACGACTT-3′)， 由上海博尚生工生物工程
技术服务有限公司合成 。 PCR反应试剂 ： 10×
Buffer， dNTP(10mM/each)， Taq酶(2.5U/μL， 上海博尚
生工生物工程技术服务有限公司)， 100bpMarker(上海英骏
生物技术有限公司)。 扩增条件为94℃， 预变性4min；
94℃变性1min， 50℃退火1min， 72℃延伸1min，
进行 35个循环； 72℃延伸 10min。 PCR产物的检
测： 取各模板的全部PCR产物， 加入相应量的6×
LoadingBuffer， 点样于1.0%的琼脂糖凝胶中， 以
100bplusMarker作为标准分子量， 100V电压，
电泳40min， 核酸染料染色。
测序由上海博尚公司完成， 序列同源性比对在
EzTaxon[12](http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)
进行。
1.2.2芽胞杆菌的系统发育分析
根据对分离得到的芽胞杆菌 16S rRNA基因序
列鉴定的结果， 利用 ClustalX1.81软件进行序
列比对分析[13]， 采用软件 Mega6.0对芽胞杆菌的
16SrRNA基因序列构建聚类[14-15]。 使用邻接法 (Neigh-
bor Joining)进行序列分析和系统发育树的建立。
1.2.3FJAT-43012 对尖孢镰刀菌 FJAT-30512 的
抑制实验
将 FJAT-43012和 FJAT-30512在 30℃、 170
r/min下分别培养2和3d。 吸取尖孢镰刀菌FJAT-
30512菌悬液 1.0mL， 加入到熔化并冷却到 50℃的
100mL0.9%PDA培养基中， 混匀后作为上层培养
基， 倾覆在已凝固的PDA培养基上。 待上层培养基
凝固后， 待平板冷却后在平板中间打直径 6mm孔，
注入 FJAT-43012发酵液上清 100μL， 以加无菌水
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陈倩倩 等 华重楼根际土芽胞杆菌多样性研究
利用细菌 16SrRNA通用引物 27F和 1492R进
行PCR扩增， 在1500bp处有特异性条带。 测序结
果与 Ez-Taxon数据库中 16SrRNA序列比对分析。
17株芽胞杆菌与 GenBank数据库中已报道菌株具
为对照， 每个处理 3次重复， 30℃培养 2d， 测抑
菌圈直径。
2 结果与分析
2.1华重楼根际土壤中芽胞杆菌的分离鉴定
从福建省南平市光泽县华重楼的根际土中分离
到17株芽胞杆菌， 菌落形态见图1。 根据菌落形态
特征， 包括菌落颜色、 表面干湿度、 是否光滑、 是
否有光泽、 边缘是否整齐等， 对 17株分离芽胞杆
菌进行分析， 可分为 10大类。 其中 FJAT-42999、
FJAT-43004、 FJAT-43006： 菌落湿润， 呈白色， 表面
光滑、 圆形扁平、 边缘波形、 不透明； FJAT-43002、
FJAT-43003、 FJAT-43010： 菌落淡黄色 ， 圆形扁
平、 湿润、 边缘整齐、 不透明； FJAT-43001： 菌落
点状， 呈淡黄色， 光滑而粘稠、 圆形凸起、 边缘整
齐、 透明； FJAT-43004： 菌落湿润， 呈黄色， 湿
润、 圆形隆起、 边缘整齐、 不透明； FJAT-43000
和 FJAT-43009： 菌落呈黄色， 粗糙、 扁平、 边缘
波 形 、 不 透 明 ； FJAT-43005、 FJAT-43007和
FJAT-43008： 菌落粗糙， 呈淡黄色， 有褶皱、 边缘
波形、 不透明； FJAT-43011： 菌落呈黄色， 粗糙、
根状、 扁平、 不透明； FJAT-43012： 菌落干燥， 呈
黄色 ， 有褶皱 、 圆形扁平 、 边缘整齐 、 透明 ；
FJAT-43013： 菌落湿润， 呈黄色， 粗糙、 圆形扁平、
边缘整齐 、 不透明 ； FJAT-43014和 FJAT-43015：
菌落干燥， 有褶皱、 圆形扁平、 边缘裂片、 不透明。
图1 芽胞杆菌的菌落形态
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2015年12月 第35卷第12期热带农业科学
图3 FJAT-14262a发酵上清对FJAT-30512的抑菌圈
有较高的相似性(≥98%)， 17株芽胞杆菌鉴定为 4
属 9个种， 分别为芽胞杆菌属(Bacillus)的简单芽
胞杆菌(B. simplex)、 食丁酸芽胞杆菌(B. butano-
livorans)、 惠州芽胞杆菌(B. huizhouensis)、 炭疽芽
胞杆菌(B. anthracis)、 特基拉芽胞杆菌(B. tequi-
lensis)和图瓦永芽胞杆菌(B. toyonensis)； 赖氨酸
芽胞杆菌属(Lysinibacillus)的解木糖赖氨酸芽胞杆
菌(L. xylanilyticus)； 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)
的土地类芽胞杆菌(P. terrigena)； 绿
芽胞杆菌属(Viridibacillus)的内德绿
芽胞杆菌(V. arenosi)， 均属于芽胞
杆菌科(Bacillaceae)。
2.2华重楼根际芽胞杆菌数量分析
通过表1数据可以得出， 在华重
楼的根基土壤中， 芽胞杆菌属的含量
为3.7×105cfu/g， 绿芽胞杆菌属含
量为4×104cfu/g， 赖氨酸芽胞杆菌
属的含量为 3×105cfu/g， 类芽胞杆
菌属的含量为 5×104cfu/g。 芽孢杆
菌属的含量最高， 种类也最丰富， 其
次为赖氨酸芽孢杆菌属。
2.3华重楼根际芽胞杆菌系统发育学分析
根据系统进化树(图2)， 可见所鉴定的9种芽胞
杆菌主要分布于5个分支上， 为此可将其可归结为5
小类： B.simplex、 B. butanolivorans 或 B. butanolivo-
rans： FJAT-42999、 FJAT-43000、 FJAT-43003； B.
toyonensis或 B. anthracis： FJAT-43005、 FJAT-43007；
B. tequilensis： FJAT-43012； Paenibacillus terrige-
na： FJAT-43001； Viridibacillus arenosi 或 Lysini-
bacillus xylanilyticus： FJAT-43002、 FJAT-43010。
2.4特基拉芽孢杆菌 FJAT-43012生防功能分析
FJAT-43012的发酵液对尖孢镰刀菌FJAT-30512
具有明显的抑菌活性， 培养2d后的抑菌圈直径为
1.8cm， 说明 FJAT-43012发酵培养所产生的抑菌
物质对尖孢镰刀菌具有很好的生物防治作用(图3)。
3 讨论
表1 分离自华重楼根际土壤的芽胞杆菌
菌株
编号
比对
结果
相似度
/%
含量
/(cfu·g-1)
FJAT-42999
简单芽胞杆菌(Bacillus
simplex NBRC 15720T) 99.23 1× 0
4
FJAT-43000
食丁酸芽胞杆菌
(B. butanolivorans K9T) 98.70 1× 0
4
FJAT-43001
土地类芽胞杆菌
(Paenibacillus terrigena A35T)99.72 5×10
4
FJAT-43002
绿芽胞杆菌(Viridibacillus
arenosi LMG 22166T) 99.93 4×10
4
FJAT-43003
惠州芽胞杆菌
(B. huizhouensis GSS03T) 99.93 1× 0
4
FJAT-43005
炭疽芽胞杆菌
(B. anthracis ATCC 14578T) 99.77 6×10
4
FJAT-43007
图瓦永芽胞杆菌
(B. toyonensis BCT 7112T) 100.00 8×10
4
FJAT-43010
解木糖赖氨酸芽胞杆菌
(Lysinibacillus xylanilyticus
XDB9T)
100.00 3×105
FJAT-43012
特基拉芽胞杆菌
(B. tequilensis KCTC 13622T)99.93 2×10
5
Bacillus simplex NBRC 15720(T)
Paenibacillus terrigena A35(T)
FJAT-43001
Lysinibacillus xylanilyticus XDB9(T)
FJAT-43010
Viridibacillus arenosi LMG 22166(T)
FJAT-43002
FJAT-43012
B. tequilensis KCTC 13622(T)
FJAT-43007
FJAT-43005
B. toyonensis BCT-7112(T)
B. anthracis ATCC 14578(T)
FJAT-43003
B. huizhouensis GSS03(T)
FJAT-43000
B. butanolivorans K9(T)
FJAT-42999
100
100
100
100
100
100
91
75
53
6992
9999
54
0.005
图2 基于16SrDNA序列同源性的华重楼根际土壤芽胞杆菌系统发育树
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陈倩倩 等 华重楼根际土芽胞杆菌多样性研究
自然界中的植物与微生物共生， 而根际是微生
物与植物相互作用的微环境。 微生物利用植物根系
分泌的代谢产物及脱落物中的物质， 如糖类、 氨基
酸和酶等为营养微生物自身生长和繁殖[16]。 在这种
营养较为丰富的环境中， 微生物的数量和群落远高
于散土， 其中细菌对根际物质的利用率和敏感性高
于放线菌、 真菌、 藻类和原生动物等， 从而在根际
中最为活跃并占主导地位， 并能在植物根系定殖和
共生。 据伯杰细菌鉴定手册描述， 芽胞杆菌属是一
类产生芽胞的革兰氏阳性细菌， 菌体呈杆状， 能够形
成内生芽胞， 营好氧或兼性厌氧生活。 Pisa等[17]发
现， 芽胞杆菌和假单胞菌(Pseudomonas)是典型的土
壤微生物， 它们能够利用植物根系的分泌物和脱落物
进行快速生长繁殖， 可以从植物根际中分离获得。
在华重楼根际土中分离得到4属9个种的芽胞
杆菌， 其中的优势种群为解木糖赖氨酸芽胞杆菌和
特基拉芽胞杆菌， 菌落含量分别为 3×105和 2×
105cfu/g。 Lee等[18]由森林的腐殖土中分离出解木
糖赖氨酸芽胞杆菌， 这种芽胞杆菌能够降解木聚
糖。 木聚糖是植物细胞中半纤维素的主要成分， 占
植物细胞干重的 35%， 是一种丰富的生物质资源，
是自然界中除纤维素之外含量最丰富的多糖[19]， 可
替代石油作为新能源。 野生华重楼多生于山地林下
或路旁草从的阴湿处， 土壤中植物枯枝败叶多， 与
上文Lee等的分离环境类似， 因而能够分离到解木
糖赖氨酸芽胞杆菌。 自然界中很大一部分木聚糖未
被有效利用， 造成很大的资源浪费， 此种芽胞杆菌
具有转化这种难降解吸收资源的应用前景。 特基拉
芽胞杆菌具抑制细菌， 如大肠杆菌生物膜形成的作
用 [20]， 华重楼根际土分离的特基拉芽胞杆菌
FJAT-43012发酵液对尖孢镰刀菌 FJAT-30512具有
明显的抑菌活性， 可能帮助华重楼抵御真菌病害。
此外， 绿芽胞杆菌属含量为4×104cfu/g， 这种芽
胞杆菌首次 于 2005年在荷兰 农业研究 基地
DrentseA分离[21]， 目前对这类芽胞杆菌的研究较
少， 功能还未明确。 在华重楼的根际土壤中， 共分
离到四个属的可培养的芽胞杆菌， 种类丰富。 其中
的解木糖赖氨酸芽胞杆菌 FJAT-43010可作为新能
源的开发利用的潜力菌株 ； 特基拉芽胞杆菌
FJAT-43012可作为农业上的生防菌。 本研究对芽
胞杆菌资源的开发和利用提供良好的实验材料和理
论基础。
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