全 文 ：收稿日期:2004-12-30
＊通讯作者
文章编号:　0490-6756(2005)04-0827-04
四种华重楼内生细菌的初步研究
陈小静 ,冯定胜 ,赵 明 ,张小洁 ,王一丁＊
(四川师范大学生命科学学院 , 成都 610068)
摘要:从华重楼(Paris polyphy lla var Chinensis)的新鲜块茎中分离得到 107株内生菌.对这
107株菌进行了液体培养 ,经初步检测鉴定 ,有 6株菌产生薯蓣皂甙或其类似物等甾体皂甙.
对其中 4株菌的形态学和理化特征进行了研究 ,确定这 4株菌分别属于德克斯氏菌属(Derxia
sp)、芽孢杆菌属(Baci llus sp)、动性球菌属(Planococcus sp)、肠杆菌属(Enterobacter sp).
关键词:华重楼;内生细菌;薯蓣皂甙
中图分类号:Q93　　　文献标识码:A
重楼(Paris polyphylla Smith)是延龄草科(Trilliaceae)重楼属植物 ,其主要化学成分为薯蓣皂甙等甾
体皂甙 ,具有祛痰 、抗菌 、镇痛 、镇静活性;具有抗早孕和杀精活性;具有抗癌和止血等活性 ,是云南白药 、宫
血宁等多种中成药和新药的主要原料.由于重楼的自然年生产量远远低于制药业的年消耗量 ,这种药物正
面临着资源枯竭的危险.内生菌(Endophy te)主要指存在于健康植物组织和器官内部 ,并可以从经过表面
消毒的植物内部分离得到的真菌或细菌[ 1] .国内外大量研究表明 ,内生菌能产生与宿主相同或相似的具
有生理活性的代谢产物.分离出含有药用植物有效药用成分的植物内生菌 ,已成为一个新的研究热点.我
们对重楼产甾体皂甙内生细菌进行了研究 ,现将研究结果报道如下.
1　材料与方法
1.1　材料
华重楼采自四川省彭州市;华重楼粉由四川光大药材公司提供.
1.2　方法
1.2.1　培养基的配制　按照文[ 2]的方法配制.
1.2.2　薄层层析板的制备　自制薄层层析板(每 30g 硅胶 G 加入 0.5%的 CMC75mL ,并加入 25 mL 左
右的蒸馏水 ,研磨均匀);其余试剂为国产分析纯.
1.2.3　内生菌的分离培养　按常规无菌操作处理重楼块茎 ,用灭菌解剖刀削去表皮 ,在超净台条件下切
割成约 0.5cm×0.5cm 的小片(取韧皮部),然后将小片种植于牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯培养基内 ,每
个平板放置 4 ～ 5块 ,分别于 37℃和 28℃培养箱中培养.培养 3 ～ 7d后 ,即可见样品切割过的边缘有菌丝
长出 ,多次经平板划线纯化 ,直至得到单菌落 ,斜面保存每种菌株备用.
1.2.4　内生菌的液体培养　分别将用牛肉膏蛋白胨和马铃薯培养基平板分离的菌 ,接入装有 10mL 液态
牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯培养基的 100mL 三角瓶内.牛肉膏蛋白胨培养基于 37℃,马铃薯培养基
28℃,150r/min振荡培养 ,培养 48h和 96h后各取样一次.1000r/min离心 5min ,上清液作为发酵产物待
检测鉴定.
1.2.5　总皂甙的制备　称重楼粉 30g ,加入甲醇60mL加热回流 2h后过滤 ,滤渣再加入甲醇 30mL加热回流
2005年 8月
第 42卷第 4期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan Universi ty (Natural Science Edition)
Aug.2005
Vol.42　No.4
2h后过滤.合并滤液 ,置水浴蒸干 ,残渣中加入40mL双蒸水溶解后加入80mL正丁醇进行萃取2次.合并正丁醇
层 ,于水浴中蒸干.残渣用 1mL丙酮溶解 ,作为对照品.对内生菌发酵液进行同样的处理 ,作为待测液.
1.2.6　薄层层析检测鉴定　用微量移液器取 10μL 上述待测液和对照品 ,同时以未接种的培养基为空白
对照 ,进行薄层层析 ,展开液氯仿∶甲醇为 100∶1 ,10%磷钼酸乙醇显色 ,置于 105℃恒温箱中烘 3 ～ 5min ,
至药品对照显出清晰蓝色斑点为止.
1.2.7　甾体皂甙的鉴定 　按照文[ 3 、4]的方法进行 Erich s(对二甲基苯甲醛-盐酸)试剂反应 、泡沫反应
进一步检验发酵液中薯蓣皂甙等甾体皂甙的存在.
1.2.8　形态特征观察　个体形态:将已部分活化的菌株转接到肉汤蛋白胨琼脂培养基中 37℃,培养 18 ～
24h.进行吕氏美蓝单染和革兰氏染色(革兰氏染色按照三点平行法 ,酒精脱色分别以 4s和 6s 、脱色为对
照.在同一玻片上用已知革兰氏阳性菌和阴性菌比较染色.如果为阳性则重复实验 ,但略去碘液媒染的一
步 ,真革兰氏阳性细胞会褪掉初染料的颜色)然后在光学显微镜下观察细菌细胞的形状 ,测量菌体大小(测
量10个以上取平均值).菌落形态:将菌株用平板划线法转接到肉汤蛋白胨平板上 ,倒置于 37℃恒温箱中
培养 48h 观察菌落形态 ,并测量菌落大小 ,测多个取平均值.芽孢染色采用两种方法进行:取在淡薄培养
基上培养了 24h以上的菌进行染色 ,采用改良法进行时 , 100℃水浴 5min后 ,取各菌液再涂平板 37℃培
养 ,观察生长情况.
1.2.9　生理生化特性测定　按照文[ 2 ,5 ,6]的方法进行.
2　结果
附图　正丁醇提取液薄层层析
Fig.　The TLC of endophy tesis metabolites tha t
　　　purified by buty l alcohol
(从左往右依次为 1～ 4号菌;培养基对照;重楼粉对照品)
2.1　分离纯化及初步检测
在新鲜重楼块茎中分离 ,纯化得到 107 株内生
菌.用重楼粉提液做对照 ,内生菌发酵液经 PLC 法
检测 ,对其中能产生薯蓣皂甙等甾体皂甙的 4 株菌
分别按 1 ～ 4对其进行编号.其结果见附图.
在分离内生菌的过程中 ,为了检查表面消毒是
否彻底 , 保证我们分离到的全部是植物内生菌 ,做
了对照实验.将无菌操作处理过的茎段不作切割直
接置于肉膏蛋白胨培养基和马铃薯培养基上 ,相同
条件下培养 ,结果对照用的茎段周围无任何菌长出 ,
多次重复均如此 ,证明所分到的菌是韧皮部内的 ,而
不是表面的附生菌.同时 ,通过对消毒时冲洗植物材
料的无菌水接种培养 ,48h内没有产生菌落 ,也说明
接种材料表面的菌消毒彻底 ,分离到的菌均为内生
菌.
2.2　甾体皂甙的检测
用 Erich s(对二甲基苯甲醛-盐酸)试剂反应 、泡沫反应以检验发酵液中薯蓣皂甙等甾体皂甙的存在 ,
结果见表 1.在 Erich s反应中 ,所有的菌株均成阳性 ,其中 3号菌红色最深;4号略浅;1 、2号最浅;培养基
对照与空白对照均为阴性.在泡沫反应中 ,1 、3 、4号及重楼粉提液反应呈阳性 ,2 号 、培养基对照及空白对
照反应呈阴性.由以上两种检测方法综合来看 ,4株菌都含有甾体皂甙(表 1).
在检验甾体皂甙的泡沫实验中 ,2号菌没有产生泡沫 ,但我们不因此排除其发酵液中含有薯蓣皂甙等
甾体皂甙的可能性 ,因为某些皂甙没有或仅有微弱的泡沫反应.
828 四川大学学报(自然科学版) 第 42卷
表 1　甾体皂甙的检测结果＊
Table 1　The examination results of steroid saponins
内生菌株 Erich s 反应 泡沫反应
1 + 泡沫产生不消失
2 + 不产生泡沫
3 ++++ 泡沫产生不消失
4 +++ 泡沫产生不消失
培养基对照 - 不产生泡沫
空白对照 - 不产生泡沫
重楼粉提液 ++++ 泡沫产生不消失
　　　　　　＊:(1 、2 、3 、4分别代表经薄层层析初步检测产薯蓣皂甙或其类似物的内生菌的编号;Erich s反应中“+“代表显红色 ,
　　　　　“ +”的数目代表红色的深浅程度 , “ -”代表不显红色)
2.3　形态学及理化特征分类鉴定
从野生重楼的地下块茎中分离出 4株产薯蓣皂甙的菌株 , 对这 4株菌株进行形态特征以及一些生理
生化特性进行了研究 ,结果见表 2 ～ 5 ,并进行微生物学的初步分类鉴定:芽孢杆菌属(Derxia sp)菌株一株
(第 1株);德克斯氏菌属(Bacil lus sp)菌株一株(第 2 株);动性球菌属(Planococcus sp)菌株一株(第 3
株);肠杆菌属(Enterobacter sp)菌株一株(第 4株).
表 2　菌落形态特征
Table 2　The morpholog y characteristics of the colony
编号 形状 大小 颜色 干湿 高度 透明度 边缘
1 不规则 较小 乳白色 中间湿润 中间较厚 不透明 无色 ,较中间澄清
2 圆形 较小 乳白色 湿润 稍突起 不透明 光滑
3 圆形 d=1μm 白色 湿润 稍突起 不透明 光滑
4 圆形 较小 白色 湿润 稍突起 不透明 光滑
表 3　革兰氏染色的结果及菌株形态特征
Table 3　The g ram stain results and the morphology characteristics of strains
编号 染色结果 菌株形态特征
1 G+ 杆状 单个分散　　长:3～ 3.5μm; 宽:0.5 ～ 0.75μm
2 G- 杆状 单个分散　　长:0.75 ～ 1μm; 宽:0.25μm
3 G+ 球状或近球状 单个分散　　d =0.5～ 0.75μm
4 G+ 球状 单个分散　　d =0.75 ～ 1μm
表 4　芽孢染色反应
Table 4　The spore stain reaction
　菌株编号 芽孢染色的结果
1 芽孢中生 , 芽孢囊不庞大或庞大 ,长:2μm 宽:1 ～ 1.25μm;菌株
2 芽孢中生或近中生 , 椭球状 ,芽孢囊不庞大 , 长:1.5μm 宽:1μm;菌株
3 无芽孢结构
4 无芽孢结构
829第 4期 陈小静等:四种华重楼内生细菌的初步研究
表 5　生理生化鉴定及结果
Table 5　The physiological biochemical identification
1 2 3 4
氧化酶实验 - - - -
接触酶实验 - + + +
葡萄糖发酵 不氧化发酵 发酵型 氧化型 发酵型
实验 葡萄糖 产酸 产酸 产酸
产生吲哚实验 + + + +
酪素水解实验 + - + -
明胶水解实验 + + - -
硝酸盐还原实验 + + + +
甲基红实验 + + - -
V.P 实验 + + + +
pH 6.0～ 6.5 pH 5.0～ 5.5 pH 7.5 ～ 8.0 pH 7.5
淀粉水解实验 + - - -
从甘油产生二
羟基丙酮实验 - - - -
通过重楼内生菌的筛选和分离鉴定 ,我们找到了多株产与宿主相同或相似药用活性成分的内生菌 ,这
对于植物药的新的生产途径及药用植物的保护具有十分重要的经济及生态效益.在农业或医药业中具有
重要的应用潜力.也为进一步研究内生菌发酵液中活性物质的成分 、产量 、以及药理学机制提供了基础和
依据.
参考文献:
[ 1] 　Hallmann J A , Quadt-Hallmann W F.J.Microbiol , 1997 , 43:895-914.
[ 2] 　张纪忠 .微生物分类学[ M] .上海:复旦大学出版社 , 1990.
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[ 4] 　娆腊初.湖南医学高等专科学校学报 , 2002 , 4(2):30-32.
[ 5] 　范秀荣 , 李广武 ,沈平.微生物实验(第二版)[ M] .北京:人民教育出版社 , 1980.
[ 6] 　周德庆.微生物实验手册[ M] .上海:上海科学技术出版社 , 1986.
Preliminary Studies on 4 Edophytic Bacteria of Paris
Polyphylla Var.Chineseis
CHEN Xiao-jing , FENG Ding-sheng , ZHAO Ming , ZHANG X iao-jie , WANG Y i-ding
(College of Life sciences , Sichuan Normal University , Chengdu 610068 ,China)
Abstract:One hundred and seven endophy tic bacteria w ere isolated and purified from the fresh hypogeal stems
of Paris polyphy lla var Chinensis .The steroid saponins w ere examined in the fermentation cultures of these
bacteria.It w as found that six bacteria cound produce steroid saponins and four bacteria have been studied.
The 4 steroid saponins-producing bacteria were identified as Derxia sp , Baci llus sp , Planococcus sp and En-
terobacter sp.
Key words:Paris polyphy lla var Chinensis;endophyt ic bacteria;steroid saponins
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