全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2014 年
收稿日期：2013－10－14
基金项目：国家“十二五”科技支撑计划项目（2011BAI13B02－6）；四川省科技支撑计划项目
作者简介：王跃华 （1963－），女 ，山东青岛人 ，教授 ，硕士生导师 ，主要从事药用植物栽培与生药学研究 ，（电话 ）13980021790（电子信箱 ）
1961689636＠qq．com；通迅作者，田孟良。
重楼（Rhizoma paridis）是名贵中药材之一，全
世界共有 24 种，我国拥有 19 种，其中以西南地区
各省的种类和资源尤为丰富［1］。 重楼为百合科植物
华重楼 （七叶一枝花）［Paris polyphylla Smith var．
chinensis （Franch．）Hara］和滇重楼 ［P． polyphylla
Smith var． yunnanensis（Franch．） Hand-Mazz］的干
燥根茎［2］。重楼主要有效成分是甾体皂苷，其苷元主
要为异螺甾烷醇类的薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元 ［3］。
现代药理研究表明，重楼具有抗肿瘤、止血、止咳平
喘、抗菌、抗病毒、避孕等作用，其良好的疗效使其
已被众多的制药工业用于药剂的生产中，是云南白
药、宫血宁、热毒清等重要中成药的主要成分，用途
极广泛［4－8］。
随着中医药产业的快速发展，重楼药材的需求
华重楼愈伤组织培养及薯蓣皂苷含量测定
王跃华 1，陈 燕 2，张 珏 1，张红玉 1，游亚莉 1，田孟良 3
（1．成都大学生物产业学院，成都 610106；2．四川金土地中药材种植集团有限公司，成都 611130；
3．四川农业大学新农村发展研究院，四川 雅安 625014）
摘要：以华重楼［Paris polyphylla Smith var． chinensis （Franch．）Hara］植物多种器官为外植体，经不同消
毒处理和培养基诱导培养后，观察其愈伤组织的诱导生长情况；并以 TTC 法检测诱导产生的愈伤组织中
的薯蓣皂苷含量。 结果表明，华重楼的隐芽、内层芽鞘、根茎、预处理后根茎和子房外植体经诱导培养后，
均可不同程度地产生愈伤组织；其中以预处理后根茎外植体产生的愈伤组织生长速度最快，诱导率也最
高，为 33．5％。经检测结果显示，多次继代培养的华重楼愈伤组织中含有与华重楼对照药材和薯蓣皂苷对
照品相同的薯蓣皂苷或其类似物。
关键词：华重楼［Paris polyphylla Smith var． chinensis （Franch．）Hara］；外植体；诱导；愈伤组织
中图分类号：Q815 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2014）08－1936-05
Callus Induction and Determination of Steroidal Saponin Content of Paris polyphylla
Smith var． Chinensis （Franch.） Hara
WANG Yue－hua1， CHEN Yan2， ZHANG Jue1， ZHANG Hong－yu1， YOU Ya－li1， TIAN Meng-liang3
（1．Department of Biological Engineering， Chengdu University， Chengdu 610106， China；
2． Sichuan Jintudi Cultivation of Chinese Herbal Medicines Group Co．， Ltd．， Chengdu 611130，China；
3．The New Rural Development Institute，Sichuan Agricultural University， Ya’An 625014， Sichuan，China）
Abstract：The multiple organs of Paris polyphylla Smith var． chinensis（Franch．）Hara were used as explants and were disinfect-
ed in different way and induced in serious culture medium. The dioscin of subcultural callus was detected by TTC． The re-
sults showed that the explants of cryptophytes， inner coleoptile， rhizome， pretreated rhizome and ovary could produce differ-
ent levels of callus after inducing and subculturing. Among them ，the growth speed of callus by pretreated rhizome was fast，
and the induction rate was highest to 33．5％． The several subcultured callus showed that the same dioscin or its analogue
with rhizome and dioscin through detecting． The suitable explant and culture medium was screened out. Callus could be ac-
quired after inducing culture. The several subcultured showed the same dioscin or its analogue with rhizome after detecting. It
will provide an important way for building effective components in medicinal material by the use of biotechnology．
Key words： Paris polyphylla Smith var． chinensis （Franch．）Hara； explants； induction； callus
第 53卷第 8期
2014年 4月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 53 No.8
Apr．，2014
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.08.038
第 8 期
量正以每年 20％的幅度递增，而当前重楼主要靠采
挖野生资源。 由于长期过度采挖，致使野生重楼资
源遭到了毁灭性的破坏，重楼已被列为国家重点保
护野生药材濒危物种， 也是云南省 30 个重要濒危
药用植物之一 ［9，10］。 利用组织培养技术生产药用植
物具有生长周期短、繁殖率高等优点，还能降低灾
害性气候对植物生长的不利影响。 因此积极开展对
重楼植物的组织培养研究是解决当前重楼药材严
重短缺和更好地保护其野生植物资源的有效方法。
然而到目前为止，重楼植物的组织培养研究都还未
取得实质性进展 ［11－13］，也未获得含有重楼有效成分
皂苷的愈伤组织。
本研究针对当前重楼植物在组织培养研究过
程中存在的诸多问题，以华重楼的多种器官为外植
体，开展了大量有针对性的研究工作，以期利用组
织培养技术有效解决重楼植物快速无性繁育的瓶
颈问题以及为生产重楼植物次生代谢产物提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 样品 重楼药材采自四川省都江堰市，经四
川大学张浩教授鉴定为百合科 （Liliaceae） 重楼属
（Paris Linnaeus）植物华重楼的根茎；薯蓣皂苷对照
品（批号：111707－200501），由中国药品生物制品鉴
定所提供。
1．1．2 药品与试剂 甲醇（批号：20070830）、三氯
甲烷（批号：20110524）、硫酸均由成都科龙化工试
剂厂提供（批号：20080721）；纯净水，蓝光饮用纯净
水；其他试剂均为分析纯。
1．1．3 仪器 硅胶 G 板， 由上海信谊仪器厂提供；
紫外灯，由无锡科达仪器厂提供。
1．2 方法
1．2．1 华重楼各营养器官外植体消毒和愈伤组织
诱导 选取华重楼生长健康的隐芽，从隐芽上剥离
的内层芽鞘、根、幼叶、地上茎、根茎和预处理后根
茎（切取倒苗后重楼带芽的前两节根茎，移栽到土
壤中待其有新根长出时，挖出移栽体，再切去前端
的芽体和后面一节根茎，只保留靠近芽体部分的第
一节根茎，即为预处理后根茎）等为外植体。 在超净
工作台上先将各外植体经 70％乙醇消毒 30 s， 再用
0．1％升汞溶液消毒，其中隐芽、内层芽鞘和幼叶消
毒 6 min，地上茎消毒 8 min，根、根茎及预处理后根
茎消毒 12 min，最后用无菌水冲洗 5 次，并用吸水
纸吸干各外植体水分；将消毒完成的外植体切成适
当大小后接种于 MS＋2．0 mg ／ L 6－BA ＋2．0 mg ／ L
IAA 培养基中，在温度（20±2） ℃，光照时间 12 h ／ d，
光照度 1 000～1 500 lx 的培养条件下诱导培养 65
d，统计各外植体愈伤组织诱导情况。
1．2．2 华重楼花各组织外植体消毒和愈伤组织
诱导 选取华重楼植物花的花萼、花瓣、花药、花
丝 、子房和花亭为外植体 ，在超净工作台上先用
0．1％升汞消毒处理 ，其中花萼 、花亭和子房消毒
8 min，花瓣、花丝和花药消毒 3 min，再用无菌水冲
洗 3 次， 并用吸水纸吸干材料表面水分后将花萼、
花瓣、花丝和花药直接接入培养基中，花亭和子房
纵切成两半后再接入培养基中，培养基配方和培养
条件与“1．2．1”相同。
1．2．3 华重楼愈伤组织增殖 选取经预处理后根
茎外植体产生的白色和浅黄白色生长状况良好的
愈伤组织接入增殖培养基中， 分别取培养生长 5、
10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和 60 d的愈伤组
织并称重，绘制愈伤组织的增殖生长曲线。
1．2．4 细胞存活率检测 试验培养材料的细胞存
活率检测采用氯化三苯基四氨唑还原法， 简称 TTC
法［14］。
1．2．5 愈伤组织中薯蓣皂苷含量测定 对照品溶
液的制备：取薯蓣皂苷对照品（使用前于五氧化二
磷干燥器中干燥 12 h以上）适量，准确称取 1 mg，加
甲醇配制成 1 mg ／mL的对照品溶液。
华重楼对照药材溶液的制备： 取华重楼药材于
55 ℃烘干后粉碎过 40目筛制得粉末。 取粉末 0．5 g，
加 85％乙醇 10 mL，加热回流 30 min 后滤过，滤液
作为对照药材溶液。
供试品 1 的制备：选取继代培养 5 代的华重楼
愈伤组织按对照药材溶液的制备方法进行制备。
供试品 2 的制备：选取继代培养 2 代的华重楼
愈伤组织按对照药材溶液的制备方法进行制备。
空白对照品的制备：取 85％乙醇溶液作为空白
对照品溶液。
1．2．6 数据统计 数据计算结果以 x±s 表示， 采用
SPSS 19．0 软件进行方差分析， 新复极差法进行多
重比较， 其中 P＜0．05为差异显著，P＜0．01 为差异极
显著。
2 结果与分析
2．1 华重楼各营养器官外植体愈伤组织诱导
本试验选取华重楼 7个不同部位的营养器官经
消毒处理后接入 MS＋2．0 mg ／ L 6－BA＋2．0 mg ／ L IAA
培养基中，在培养 65 d 后统计其外植体愈伤组织诱
导情况结果见表 1。
王跃华等：华重楼愈伤组织培养及薯蓣皂苷含量测定 1937
湖 北 农 业 科 学 2014 年
图 1 预处理根茎愈伤组织
图 2 未预处理根茎愈伤组织
图 3 隐芽抽苗
图 4 隐芽愈伤组织
从表 1可以看出， 华重楼植物的隐芽、 内层芽
鞘、 未预处理根茎和预处理后根茎 4个部位的外植
体都能不同程度地诱导出愈伤组织， 其中经预处理
后根茎外植体愈伤组织诱导率极显著高于其他外植
体，为（33．5±1．6）％（P＜0．01）。 经预处理后根茎外植
体在接入培养基后 30～40 d 就出现明显的启动现
象，根茎横切面的颜色由最初的白色变为浅棕黄色，
并且其器官内的基本组织会产生明显地体积膨大，
常将根茎的皮部组织胀破， 最终使得基本组织向外
膨出， 随后在膨出的基本组织表面产生大量的白色
愈伤组织，形如花菜状、质地较紧密（图 1）；未预处
理根茎在培养过程中，组织膨出不明显，其愈伤组织
的诱导率也较低为（19．6±1．3）％，产生的愈伤组织颜
色为白色和黄色，其产生数量也较少（图 2）；隐芽外
植体在接入培养基的初期，主要表现为芽体的整体
膨大，但随着培养时间的延长，有部分隐芽出现了
抽苗现象，但始终未见有愈伤组织产生（图 3）；而另
一部分隐芽在体积膨大的基础上， 逐渐愈伤化 （图
4），培养 65 d后统计愈伤组织诱导率为（12．8±1．3）％。
内层芽鞘外植体在接入培养基 25 d左右，芽鞘体积膨
大而呈肥厚肉质，并在接下来的培养过程中，可观察
到膨大芽鞘的内表面和边缘逐渐长出质地较紧密、颜
色为白色的团块状愈伤组织（图 5）。
而华重楼的幼叶、地上茎和根外植体在培养 65 d
后都未观察到有愈伤组织的产生； 尽管幼叶和地上
茎也能在培养基中保持较长时间的活力， 而且幼叶
膨大也非常明显（图 6），但随着培养时间的延长，幼
叶会逐渐枯萎死亡，而地上茎则会因褐化而死亡；根
外植体在接入培养基后，一直未发生形态上的变化，
并且染菌率也低，这与 Cheung 等 ［7］的研究结果相
似，在培养 80 d后用 TTC法检测培养的根细胞存活
率仅为（4．5±0．2）％。
2．2 华重楼花各器官外植体的愈伤组织诱导
华重楼花各器官外植体也接种在愈伤组织诱导
培养基上，在培养 60 d 后统计各外植体的情况结果
见表 2。 从表 2可以看出，6种不同外植体在接入培
养基中培养 60 d 后，只观察到子房外植体有少量愈
表 1 华重楼营养器官外植体愈伤组织诱导情况（n=3）
染菌率//%
17.9±2.8 cC
11.7±0.8 dD
6.0±0.2 eE
23.3±1.4 bB
16.2±0.7 cC
36.9±0.1 aA
38.7±1.6 aA
接种外植体数//株
38
35
45
38
37
35
37
外植体种类
隐芽
内层芽鞘
根
幼叶
地上茎
未预处理根茎
预处理后根茎
愈伤组织诱导率//%
12.8±1.3 dC
22.9±2.4 bB
0.0 eD
0.0 eD
0.0 eD
19.6±1.3 cB
33.5±1.6 aA
注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写
字母表示差异极显著（P<0.01），下表同。
1938
第 8 期
图 5 内层芽鞘愈伤组织
图 6 膨大的幼叶
图 7 子房愈伤组织
伤组织的产生。 子房产生愈伤组织的部位主要在子
房切面的子房壁伤口处有少量颜色为黄色和黄褐色
零星颗粒状愈伤组织产生（图 7）；子房产生的愈伤
组织生长时间很短也就停止了， 其原因主要是因为
子房壁伤口在培养过程中产生褐变较严重的缘故。
花萼和花丝外植体在接入培养基后大多会出
现膨大，但随着培养时间的延长，最终都出现枯萎
死亡；而花瓣和花药外植体在接入培养基后，形态
不发生变化，在培养 80 d后用 TTC法检测其细胞均
已死亡；花亭外植体在接入培养基后，部分可在节
处可产生一定的膨大， 但随着培养时间的延长，外
植体会产生褐变而死亡。
2．3 华重楼愈伤组织的增殖
选经预处理后根茎外植体产生的白色和浅黄白
色愈伤组织 2 g ／ L接入 MS＋0．5 mg ／ L 6－BA＋1．0 mg ／ L
NAA的增殖培养基中， 每隔 5 d取样称重并观察其
生长情况，绘制出愈伤组织增殖生长曲线见图 8。 从
图 8可以看出， 在华重楼愈伤组织的增殖生长过程
中，延迟期时间较长为 15～20 d 左右；此后愈伤组织
生长进入对数生长期，并开始迅速增殖生长。对数生
长期持续时间为 20～25 d 左右，在此时间段愈伤组
织细胞可增殖 2倍多；此后，愈伤组织增殖生长进入
平稳期，其增殖速度也明显减慢。
2．4 薯蓣皂苷含量的测定结果
按照 《中华人民共和国药典》2010 版薄层色谱
法（附录 VIB）试验，吸取供试品溶液和对照药材溶
液各 5 μL 以及对照品溶液 10 μL，分别点于同一硅
胶 G 薄层板上， 以三氯甲烷－甲醇－水 （体积比
15∶5∶1）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷
10％硫酸乙醇溶液在 105 ℃加热至斑点显色清晰，
分别至日光灯和紫外光灯（365 nm）下检视。
由图 9、表 3可以看出，供试品 1（继代培养 5代
的华重楼愈伤组织） 与对照药材和对照品都有颜色
相同、 迁移率相当的显色斑点， 表明继代培养 5代
的华重楼愈伤组织中具有薯蓣皂苷或其类似物；供
试品 2（继代培养 2 代华重楼愈伤组织）不含与对照
品相同的斑点，但在 Rf＝0．611 处的斑点与对照药材
和供试品 1相当， 表明继代培养 2代华重楼愈伤组
织不含有薯蓣皂苷，但含有华重楼的其他成分；试验
结果显示空白对照品无干扰。
表 2 华重楼花各器官外植体的愈伤组织诱导（n=3）
染菌率//%
21.0±0.5 aA
0.0 cB
0.0 cB
0.0 cB
0.0 cB
17.6±1.9 bA
接种外植体数//株
38
40
48
48
20
17
外植体种类
花萼
花瓣
花药
花丝
子房
花亭
愈伤组织诱导率//%
0.0 bB
0.0 bB
0.0 bB
0.0 bB
15.0±1.7 aA
0.0 bB
图 8 不同培养时间愈伤组织增殖生长曲线
6
5
4
3
2
1
0
愈
伤
组
织
增
殖
量
//g
0 10 20 30 40 50 60
培养时间//d
王跃华等：华重楼愈伤组织培养及薯蓣皂苷含量测定 1939
湖 北 农 业 科 学 2014 年
表 3 薄层色谱相对迁移率的比较
0.361
0.361
0.361
-
-
斑点数
1
4
3
1
0
样品
对照品
对照药材
供试品 1
供试品 2
空白对照品
-
0.486
-
-
-
编号
1
2
3
4
5
-
0.569
-
-
-
-
0.611
0.611
0.611
-
-
-
0.764
-
-
Rf
1．对照品；2．对照药材；3．供试品1；4．供试品 2；5．空白对照品
图 9 薄层色谱图
1 2 3 4 5
3 小结与讨论
在对华重楼愈伤组织的诱导过程中，笔者发现
在适宜的时期选择有效的外植体部位是非常重要
的。 本研究中所采用的两种根茎外植体都是除去了
芽体后保留的第一节的根茎，结果表明，经预处理
后的根茎外植体不仅愈伤组织诱导率更高，而且产
生的愈伤组织数量也更多，愈伤组织的生长质量也
更好， 因而也确保了后继愈伤组织的成功增殖；本
研究也曾采用了除第一节根茎以外的其他根茎作
为外植体进行愈伤组织诱导，但最终都未获得愈伤
组织，这也与延龄草 （Trillium tschonoskii Maxim.）
不同部位根茎诱导愈伤组织的情况相似 ［15］；因此，
华重楼植物顶芽后的第一节根茎细胞保持有较强
的潜在分裂能力，细胞经诱导培养后较易脱分化产
生愈伤组织。
薯蓣皂苷作为华重楼植物中的重要有效成分，
是属于植物的次生代谢产物。 经多次继代培养的华
重楼愈伤组织，是可以在产生大量初生代谢产物的
基础上，进一步产生薯蓣皂苷次生代谢物；因此，在
重楼植物以后的组织培养研究过程中，可有效地通
过改变培养基中各成分的种类、比例以及积极开展
前体饲喂技术和利用发根农杆菌的遗传转化技术，
最终实现利用生物技术生产重楼植物有效成分薯
蓣皂苷的目的。
本研究研究了华重楼各部位外植体诱导产生
愈伤组织的情况，筛选出了经预处理后的根茎是产
生愈伤组织的最佳外植体，并成功地建立了华重楼
愈伤组织增殖培养体系，为开展华重楼组培苗的生
产和筛选出次生代谢产物含量高的细胞株进行扩
大培养奠定了工作基础。
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（责任编辑 屠 晶）
1940