全 文 ：茖葱中含硫化合物对培养心肌细胞的作用
赵怀清＊ , 王学娅1 , 难波恒雄2
(沈阳药科大学基础部 , 沈阳 110015;1 辽宁省基础医学研究所 , 沈阳 110005;
2 日本富山医科药科大学和汉药研究所 , 日本)
摘要　目的:考察茖葱(Allium victorialis L.)中的 5 种化合物对小鼠培养心肌细胞的作用。方法:制备小鼠的
培养心肌细胞 ,利用微机控制的图像分析监视系统 ,考察茖葱中分离出的 5 种挥发性成分对培养心肌细胞的心率及
振幅的作用。结果:其中二甲基二硫 、甲基烯丙基三硫 、甲基烯丙基硫醚和二烯丙基二硫对培养心肌细胞的心率和振
幅均有明显的增强作用 ,并对 Ca2+-ATP 酶有明显的抑制作用 , 而不含硫的 2-戊酮对心率 、振幅 、Na+ , K +-ATP酶及
Ca2+-ATP酶均无影响。结论:含硫化合物引起的正性肌力作用可能与它的酶抑制作用有关。
关键词　培养心肌细胞;自发性心率;正性肌力作用;茖葱;含硫化合物
　　茖葱(All ium victorialis L .)是百合科葱属植
物 ,主要分布于日本的北海道等地 。研究表明 ,它不
仅有抗血栓 、对过剩的胆固醇有抑制作用 ,而且对血
小板凝聚也有强烈的抑制作用 。这些药理作用主要
来自于含硫挥发油成分。为了寻找其新的药理作
用 ,本文用培养的小鼠心肌细胞 ,对其挥发油成分做
了研究。
实 验 部 分
　　材料与动物 　Eag le MEM (M inimal essential
medium), 日本日水制药株式会社 。FBS(Fetal
bovine serum), Whit taker M .A.Bioprofucts Inc.。
HEPES ,日本同仁化学研究所 ,ATP ,Na+ , K+-ATP
酶和 A23187 , Sigma Co.(St.Louis , USA),其他化学
试剂均为优级试剂从和光纯药株式会社 ,半井株式
会社购入 。茖葱新鲜叶是由日本北海道バイオ技术
研究所提供。其挥发油提取物中分离的 5种化合物
分别为:2-戊酮(2-pentanone , 2-PT),二甲基二硫
(dimethyl disulfide , DMDS), 甲基烯丙基 三硫
(methy l allyl t risulfide , MATS),甲基烯丙基硫醚
(methyl ally l sulfide , MAS), 二烯丙基二硫(diallyl
disulf ide , DADS)。实验动物为妊娠约 14 ～ 16 d 的
ICR小白鼠 ,日本静冈县实验动物农业协同组提供。
收稿日期:1999-05-17
＊Tel:(024)23845019 , Fax:(024)83890024
　　心肌细胞培养 　根据五岛等[ 1]的方法制备了
心肌细胞。将妊娠 14 ～ 16 d的 ICR小白鼠的胎儿
心脏取出 ,将其放入0.125%胰蛋白酶-0.025%胶
原酶的混合液中 ,切碎 ,在 37℃的恒温水浴中振荡
10 min ,加入含有10%牛胎儿血清的 Eagle MEM 的
培养液 ,离心(4℃,2 000 r·min-1 ,10 min)。去除上
清液 ,按照 Polinger[ 2]方法除去纤维芽细胞 ,然后将
其分散于涂有纤维连接素的载玻片上 ,放入 35 mm
塑料培养皿中 ,置于 37℃,95%空气-5%CO2 的饱
和水蒸汽的培养箱中 ,经 48 h培养 ,待测定 。
心肌细胞心率和振幅的测定　心肌细胞的心率
和振幅的测定是根据黄圣伦等[ 3] 的方法进行的 ,将
附着心肌细胞的载玻片 ,细胞面向下 ,置于带有洞穴
的丙烯酸脂板上(洞穴中充满含有 FBS 的 HEPES
溶液)。使其静止 5 min后开始测定。首先测定空
白溶液(含有 1% DMSO 的标准培养基)的心率 ,在
相同条件下测定对照品及样品的心率。测定时 ,在
37℃恒温倒立位相差式显微镜(OLympus IMT-2)
下 ,由内藏摄像机成像后又转变成电信号而检出的 ,
其数值通过计算机(NEC PC-9801 VM)处理。
由显微镜观察到的心率情况 ,经内藏摄像机
(Olympus FCD-10)摄像后直接转录到录放机
(National AC-6300)上 ,将其画面显示于图像监视器
(NECPC-KD 854)。通过连有计算机(N EC PC-
9801)的图像分析器(PIAS LA-500)进行画像解析。
选择细胞群的录相画面中高亮度的 3个点 ,记录各
点的周期性(0.07 s间隔)跳动情况 。一定时间内的
振幅是根据测定波形图的峰高度计算的。
·4· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2000 , 35(1)∶4～ 6
DOI :10.16438/j.0513-4870.2000.01.002
投药后相对的心率或振幅按下式计算:
投药后一定时间内心率或振幅
投药前的心率或振幅 ×100%
结 果
1　含硫化合物对培养心肌细胞的作用
对挥发油中的 5种化合物作用于培养心肌细胞
的情况进行了考察 。结果含硫化合物均对培养心肌
细胞的心率和振幅有不同程度的增强作用 ,而不含
硫的化合物则对两者均无影响。见表 1 。
Tab 1　Effect of compounds from Allium victorialis extract on the beating of myocardial cel l sheet in culture
Compound
5 min
BR% BA%
10 min
BR% BA%
15 min
BR% BA%
20 min
BR% BA%
Cont rol(1%DMSO) 99.8±2.6 100.2±3.0 98.2±1.8 98.7±2.5 98.5±1.5 99.5±2.7 98.6±2.7 101.3±1.9
2-PT 100.1±1.5 99.2±3.0 97.3±2.6 96.8±3.2 99.2±2.6 98.5±1.5 102.5±3.1 98.9±1.8
DMDS 117.9±1.5＊＊ 115.6±2.0＊＊ 119.2±3.2＊＊ 117.2±1.8＊ 115.4±2.6＊ 115.9±3.0＊ 100.2±2.8 100.2±2.9
MATS 116.5±4.2＊＊ 114.3±2.6＊＊ 116.6±3.8＊＊ 117.5±1.5＊＊ 118.5±1.3＊＊＊119.2±3.7＊＊ 116.6±3.6＊＊＊ 118.8±3.4＊＊
MAS 109.5±5.5＊ 102.5±3.5 113.8±2.4＊ 104.8±2.7 117.2±3.7＊＊ 118.4±3.2＊ 115.8±3.5＊＊ 114.7±3.6＊
DADS 113.8±2.1＊ 108.5±3.1 115.2±3.9＊ 110.0±5.2 118.5±1.9＊＊ 117.4±3.5＊ 112.6±2.4 116.0±2.8＊
The BR was measured 10 min after replacing the medium w ith a new medium containing each test sample , and indicated as
percentag e of an initial BR value that w as measured just before replacing the medium.Concentration of each compound was 0.1
mmol·L-1. x ±s , n =5.＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 , ＊＊＊P <0.001 vs control(1% DMSO).BR:beating rate;BA:beating
amplitude.
2　生药浸膏中的 Na+ , K+ ,Ca2+含量测定
1.0 mg 挥发油提取物中加入 2.0 mL 的浓
HNO3 ,湿法灰化 ,用原子吸收光谱仪(Shimadzu AA-
640-13)测得的 Na+ , K+ , Ca2+的含量分别为 14.2
×10-5 , 85.6×10-5和 10.2×10-5 mol·L-1 。
结果表明 ,浸膏中这些离子含量远低于标准培
养液中的离子含量(2.1 mmol·L -1),所以 ,对心肌
细胞的心率不会带来影响 。
3　Na+ ,K+-ATP酶的活性测定
Na+ , K+-ATP 酶活性的测定是根据 Jones
等[ 4] 的方法进行的 。将混合液(50 mmol·L-1
histidin , 3 mmol·L-1 MgCl2 , 1 mmol·L-1 Tris/
EGTA , 100 mmol·L-1 NaCl , 10 mmol·L-1 KCl , 3
mmol·L-1 T ris/ATP)和样品溶解在 DMSO 中(最
终浓度为 1%), 在 37℃的恒温水浴中培养 60 min ,
释放的无机磷通过 Ottolenghi 等[ 5] 的方法进行测
定。结果表明 , 茖葱中各化合物在浓度为 0.1
mmol·L-1的条件下测定 ,对 Na+ , K+-A TP 酶无影
响。
4　心肌肌浆网 Ca2+-ATP酶的制备和测定
Ca2+-ATP 酶的制备是根据 Chamberlain 等[ 6]
的方法进行的。首先将♂兔(2.5 kg)的心脏摘出 ,
用0.145 mmol·L-1 NaCl将心脏洗净 ,切成碎片 ,称
重。然后 , 加入 2 mL 溶液 A [ 0.25 mmol·L-1
sucrose , 0.5 mmol·L-1 DTT , 3 mmol·L-1 NaN3 ,
10 mmol·L-1 imidazole-HCl(pH 6.8)] ,用聚四氟乙
烯均化器均化 30 min ,离心(3 000×g , 15 min),上
清液用 5 ～ 7层的网状滤器过滤 。再离心(19 000×
g , 20 min),用含有 0.65 mmol·L-1 KCl溶液 A 悬
浊 ,静置 30 min 后 ,离心(4 400×g , 10 min),上清
液进一步离心(25 000×g , 10 min)。得到的沉淀溶
解于少量溶液A 中。置于-50℃保存备用 。
将样品或作为空白的 DMSO 1 μL 加入到 0.1
mL 混合液(50 mmol·L -1 histidin , 3 mmol·L-1
MgCl2 , 50μmol·L-1 CaCl2 , 100 mmol·L -1 KCl , 3
mmol·L-1 Tris/ATP , 3μg·mL-1 A23187)中 ,再加入
1μL 上述制备的 Ca2+-ATP 酶 , 在 37℃下反应 30
min后 ,根据 Shoshan 等[ 7] 的方法测定游离的无机
磷 。结果见表 2。
Tab 2　Effect of compounds from Allium victorialis
extract on Ca2+-ATPase activity
Compound
Inorganic phosphous release/
μmol·L -1/(μg protein·min-1)
C ont rol(1%DMSO) 1.25±0.05
2-PT 1.20±0.12
DMDS 1.16±0.32＊
MATS 1.07±0.28＊
MAS 0.95±0.36＊
DADS 1.02±0.25＊
Mix tures indicated in `Ca2+-ATPase activity were incubated
for 30 min at 37℃.The concentration of each compound w as
0.1 mmol·L-1 , x ±s , n =5.＊P<0.01 vs centrol(1%
DMSO).
·5·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2000 , 35(1)∶4～ 6
　　结果表明 , 化合物 DMDS , MATS , MAS 和
DADS ,在 0.1 mmol·L-1浓度下测定 ,对 Ca2+-ATP
酶有抑制作用 ,而 2-戊酮 ,在相同浓度下没有影响 。
讨 论
　　本实验利用微机控制的图像分析监视系统考察
了茖葱中挥发油成分对小鼠胎儿培养心肌细胞的心
率和振幅的作用 。结果表明 ,不含硫的化合物 2-戊
酮对心率和振幅均无显著性影响 ,而含硫的 4 种化
合物即 DMDS , MATS ,MAS 和 DADS 对培养心肌
细胞的心率和振幅均有不同程度的增强作用 。其中
MATS 作用最强 ,其次是 DMDS ,提示对心肌细胞
的心率和振幅的增强作用可能与化合物中的硫及其
数目有关 。
强心苷正性肌力作用的机制是通过抑制心肌细
胞膜上的 Na+ , K+-ATP 酶。本研究结果 ,茖葱中
的 5种化合物在浓度为 0.1 mmol·L-1的条件下测
定 ,对 Na+ ,K+-A TP 酶活性没有抑制作用 ,而含硫
的 4种化合物对 Ca2+-ATP 酶有抑制作用 ,结果表
明 ,含硫化合物的强心作用方式与强心苷不同 。
含硫化合物的强心作用机制可能与抑制心肌肌
浆网 Ca2+再摄取或增加心肌肌浆网 Ca2+的释放有
关 ,其作用的确切机制有待进一步研究 。
参 考 文 献
1　五岛喜与太 ,培养心筋细胞の搏动.科学 , 1974 , 44∶475
2　Polinger IS.Separation of cell types in embryonic heart cell
culture.E xp Cell Res , 1970 , 63∶78
3　Huang S L , Kakiuchi N , Hattori M , et al.A new
monitoring system of cultured myocardial cell mo tion:
Effect of pilose anather extract and cardioactive agents on
spontaneous beating of myocardial cell sheets.Chem Pharm
Bull , 1991 , 39∶384
4　Jones LR , Besch HR Jr , Fleming JW , et al.Separation of
v esicles of cardiac sarcolemma from vesicle of cardiac
sarcoplasmic reticulum.J Biol Chem , 1979 , 254∶530
5　Ottolenghi P.The reversible delipidation of a solubilized
sodium-plus po tassium ion-dependent adenosine triphos-
phatase from the salt g land of the spiny dogfish.J Biol
Chem , 1975 , 151∶61
6　Chamberlain BK , Levitsky DC , F leischer S.Isolation and
characterization of canine cardiac sarcoplasmic reticulum
w ith improved Ca2+ transport properties.J Biol Chem ,
1983 , 259∶6602
7　Shoshan V , Maclennan DH.Quercetin interaction with the
(Ca2+-Mg2+)-ATPase of sar coplasmic reticulum.J Biol
Chem , 1981 , 256∶887
8　Kakiuchi N , Senaratne LRE , Huang SL , et al.Effects of
constituents of Beli (Aegle marmelus) on spontaneous
beating and calcium-paradox of myocardial cell.Planta
Med , 1991 , 57∶43
9　Low ry OH , Rosebrough NJ , Farr AL , et al.Protein
measurements with the Folin Phenol reagent.J Biol Chem ,
1950 , 193∶265
EFFECTS OF SULFUR COMPOUNDS FROM CAUCAS
(ALLIUM VICTORIALIS L.)ON THE SPONTANEOUS BEATING
OF MYOCARDIAL CELL SHEETS IN VITRO
Zhao Huaiqing , Wang Xueya1 and Namba Tsuneo2
(Basic Courses of Shenyang Pharmaceut ical Universi ty , Shenyang 110015 ;1 Inst itute of Basic Medical
Science of L iaoning Province , Shenyang 110005 ;2 Toyama Medical and Pharmaceut ical University , Japan)
ABSTRACT　AIM:To study the effects of volatile sulfur compounds isolated f rom caucas (Allium
victorialis L .) on spontaneous beating of cultured mouse myocardial cells.METHODS:Cultured mouse
myocardial cells w ere prepared.The ef fects of f ive compounds from caucas on the rate and ampli tude of beating
of cultured myocardial cells were examined by using microcomputer-driven image analy zing sy stem .RESULTS:
Of these compounds , dimethyl disulf ide(DMDS), methy l allyl t risulfide(MATS), methyl allyl sulfide(MAS)
and diallyl disulfide(DADS)appreciably increased the beating rate and beating amplitude , and significantly
inhibited Ca2+ATPase activi ty , but non-sulfur 2-pentanone did no t affect them.CONCLUSION:The posit ive
inotropic effect on cultured myocardial cell sheets induced by sulfur compounds may be correlated with it s
inhibition on enzyme.
KEY WORDS　cultured myocardial cell;spontaneous beating;positive inotropic ef fect;A llium victorialis
L.;sulfur compounds
·6· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2000 , 35(1)∶4～ 6