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芪丹通脉片对肿瘤坏死因子-α诱导的心肌细胞的
细胞间黏附分子-1表达的影响
王宗仁 1 ,肖铁卉 1 ,李晶华 1 ,马　静 1 ,邵中军 2 ,郑　瑾 1 ,马爱玲 1
( 1. 第四军医大学附属西京医院 中医科 ,陕西 西安　 710032; 2. 第四军医大学 流行病学教研室 ,陕西 西安　 710032)
　　近年来 ,冠心病发生发展中的细胞黏附机制日
益受到重视 ,其中内皮细胞 ( EC) ,白细胞和血小板
之间以及与血管内皮基质间相互黏附、相互作用而
导致炎症反应和促凝异常、血栓形成 ,从而促进冠心
病的形成和发展 ,而黏附分子和黏附蛋白是介导细
胞黏附的分子基础。 研究发现 ,细胞间黏附分子 -1
( intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1) 参与
中性粒细胞黏附心肌细胞 ,释放细胞毒过程 ,在心肌
细胞坏死过程中起关键作用。一些细胞因子如肿瘤
坏死因子-α( TN F-α) ,γ-干扰素 ( IFN-γ) ,胰岛素样
生长因子-1 ( IGF-1) ,白细胞介素 -1 ( IL-1) ,白细胞
介素-6 ( IL-6) ,脂多糖 ( LPS)和佛波酯 ( PMA)等
可促进上皮细胞和血管平滑肌等细胞 ICAM-1的表
达 ,其中 TN F-α的作用尤其引人注目 [1 ]。本研究观察
芪丹通脉片 ( QDTMP)对 TN F-α诱导的培养乳鼠
心肌细胞 ICAM-1表达的影响 ,探讨中药复方制剂
对冠心病发生发展中的细胞黏附过程的作用机制。
1　材料与方法
1. 1　材料: SD大鼠 30只 ,雄性 ,体重 ( 220± 18)
g ,第四军医大学实验动物中心提供。 DM EM、胰蛋
白酶、胎牛血清 ( FBS)、 TN F-α、抗 ICAM-1多抗及
DAB染色剂购于武汉博士德公司。生物素标记羊抗
兔抗体 (二抗 ) , ABC复合物 ,第四军医大学神经生
物教研室提供。芪丹通脉片提取浸膏干粉 ( 1 g干粉
相当于生药 2. 862 g ) ,由第四军医大学附属西京医
院提供。
1. 2　含药血清制备: SD大鼠按体重随机分成: 对
照组、芪丹通脉片低、高剂量组。对照组 ig生理盐水
10 m L /kg ,芪丹通脉片低、高剂量组分别 ig 1, 2 g
生药 /kg;连续 7 d。第 8天断头取血 ,离心 ,取血清 ,
分装保存于 - 20℃ 冰箱备用。
1. 3　心肌细胞原代培养:新生 1～ 3 d SD大鼠 (第
四军医大学实验动物中心提供 ) ,雌雄兼用 ,活杀取
心室 ,除去心包膜 ,放入不含钙、镁的 Hanks液中漂
洗 2次 ,洗去多余水分 ,剪成 1～ 2 mm3组织碎块 ,
置于 0. 2% 胰蛋白酶溶液中 , 37℃ 水浴振荡消化
15～ 20 min, 200目不锈钢筛滤过 ,将上层细胞悬液
吸入含 10% FBS DM EM培养基的消毒离心管中
混匀 , 800～ 1 000 r /min离心 10 min,离心后弃上
清液 ,加入不含钙、镁 Hanks液混匀 , 800～ 1 000 r /
min离心 10 min,离心后弃上清液 ,加 4 mL培养液
混匀 ,接种在消毒的载玻片上 , 37℃ 孵箱中静置 3
h,调整细胞浓度为 5× 108 /L ,吸入含 10% FBS的
DMEM培养基转入培养皿 37℃ CO2孵箱中培养 ,
并观察细胞生长状况。 48 h后换液备用。
1. 4　分组: 加用 TN F-α和芪丹通脉片 ,换液时将
培养的心肌细胞随机分为 3类 ,一类在含 10% FBS
的 DMEM中分别加入 TN F-α ( 100 U /mL) ,另一
类在 10% 高剂量含药血清的 DMEM 中加入
TNF-α( 100 U /mL) ,第三类在含 10% 低剂量含药
血清的 DMEM中加入 TN F-α ( 100 U /mL) ,均刺
激 6, 12, 24 h。
·1035·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
收稿日期: 2003-03-14基金项目: 陕西省重点课题 ( 2001K12-G7)作者简介: 王宗仁 ( 1951— ) ,男 ,博士生导师 ,第四军医大学附属西京医院中医科主任。
Tel: ( 029) 3375347　 E-mai l: zong ren@ fmmu. edu. cn
1. 5　免疫组织化学:将载玻片用 PBS冲洗干净 ,放
入冷丙酮中固定 15 min, PBS冲洗干净。而后进行
免疫组化鉴定。3% 过氧化氢作用 15～ 20 min,水冲
洗 , PBS洗 3 min,共 3次。加抗 ICAM-1 (一抗 1∶
100) , 4℃ 冰箱过夜 , 37℃ 水浴箱 60 min, PBS冲
洗 3 min,共 3次。加生物素标记羊抗兔抗体 (二抗
1∶ 300) , 37℃ 水浴箱 30 min, PBS冲洗 3 min,共
3次。加过氧化物酶链霉菌抗生物素蛋白 (三抗 1∶
300) , 37℃ 水浴箱 30 min, PBS冲洗 3 min,共 3
次。加 DAB液显色 2～ 10 min。水冲洗 ,苏木精复
染 , 1% 盐酸酒精脱色 ,脱水透明 ,中性树胶封片。
1. 6　 ICAM-1的检测:用 Leica Q 500 Mc图像分
析仪对阳性结果的密度进行测定 (x±s )。
1. 7　数据统计:用 SPSS软件对资料进行整理 ,计
量资料用 x±s表示 ,采用 t检验对资料进行分析。
2　结果
　　免疫组化结果: 见表 1。 TN F-α ( 100 U /mL)
能明显刺激培养心肌细胞 ICAM-1的表达 ( P <
0. 01) , 6 h时表达水平较高 ,而用含芪丹通脉片血
清作用后心肌细胞 ICAM-1的表达下降 ,芪丹通脉
片能够下调各个时间点培养心肌细胞 ICAM-1表
达 ,与单纯 TN F-α刺激的心肌细胞比较有明显差
异。芪丹通脉片作用 12 h,高剂量组作用较低剂量
组明显 ,二者相比有差异 ,证明高剂量对 ICAM-1
的影响作用较明显。
表 1　芪丹通脉片与单纯 TNF-α刺激的
心肌细胞 ICAM-1表达比较 (x± s )
Table 1　 Comparison of ICAM-1 expression in myocardium
stimulated by QDTMP and TNF-α (x± s)
组　别 剂量
/( g· kg- 1 )
ICAM-Ⅰ 表达
6 h 12 h 24 h
对照 - 11. 32±1. 20 10. 83±1. 54 11. 54± 2. 01
TN F-α - 25. 61±4. 11 58. 14±6. 30* * 39. 68± 5. 44* *
芪丹通脉片 1 20. 09±4. 23△ 38. 57±4. 12△ 26. 35± 4. 55△
2 20. 27±3. 35△ 41. 95±5. 21△▲ 30. 62± 6. 02△
　　与对照组比较: * * P < 0. 01; 与 TN F-α组比较: △ P < 0. 01;
　　与芪丹通脉片低剂量组比较: ▲ P < 0. 05
　　* * P < 0. 01 vs control g roup; △ P < 0. 01 vs TNF-αg roup;
　　▲ P < 0. 05 vs QDTM P low do se g roup
3　讨论
　　黏附分子和黏附蛋白通过介导内皮细胞 ,血小
板和白细胞之间及其与其他细胞和细胞基质间的相
互黏附、相互作用 ,因而在冠心病发生 ,发展中有重
要作用。 ICAM-1为一种细胞黏附分子 ,属免疫球蛋
白超家族成员 ,分为还原型与非还原型 ,和成纤维母
细胞等细胞表达 ,通过白细胞上的配体 CD11 /CD18
复合物与任何白细胞相互作用 ,是炎症反应的可信
标志物。近几年来随着研究逐步深入 ,已证实其在缺
血再灌注损伤、急性心梗、动脉粥样硬化 ( AS)形成
中起着重要的作用 [2～ 5 ]。
心肌细胞在正常情况下仅表达极少量 ICAM-1,
多种因素可以影响 ICAM-1的表达。在某些病理因
素刺激下如:心脏遭受致命性损伤、心脏移植排斥反
应、心肌缺血再灌注 ,心肌细胞膜表面 ICAM-1量
可成倍增加。一些细胞因子尤其是 TN F-α可促进上
皮细胞和血管平滑肌细胞等细胞 ICAM-1的表
达 [1 ]。研究表明 , TN F-α可以刺激 ICAM在培养心
肌细胞上的表达 ,并呈浓度依赖性。心力衰竭时心肌
组织 TN F-α升高 ,可溶性 TN F-α及 TN F-α受体
升高。提示 TN F-α在心力衰竭的进程中可能起重
要作用 ,尽管机制有许多方面 ,但 TNF-α刺激心肌
细胞 ICAM-1表达可能是其中重要的一环。
芪丹通脉片根据中医异病同治及气血相关论研
制而成 ,组方中君药黄芪补益心气 ,气旺则运血有
力 ;臣药丹参为“达脏腑祛瘀滞之佳品”入血分而活
血行血 ,与黄芪相配加强益气活血之效 ;佐药当归为
“血中之气药” ,故而补血行血 ,红花活血、祛瘀止痛 ;
佐使药桂枝“宣道百药 ,通血脉” ,与黄芪合用能振奋
心阳 ,以达温通经脉之效。诸药合用以达益气活血、
温通经脉、活血化瘀之效。
近年来 ,有关中医中药对冠心病发生发展过程
中黏附机制作用影响的研究还很少 ,中医认为缺血
性心、脑血管疾病基本病机为气虚血瘀 ,治疗宜益
气、活血化瘀为主。 本实验的结果表明 ,芪丹通脉片
可以下调 TN F-α诱导的心肌细胞 ICAM-1表达 ,
对损伤心肌细胞具有保护作用 ,以高剂量作用明显 ,
其作用机制尚有待进一步证明 ,可能为活血化瘀中
药复方制剂对缺血性心血管疾病的治疗找到新的理
论依据。
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