全 文 ：分子植物育种，2015年，第 13卷，第 9期，第 2038-2050页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.9, 2038-2050
研究报告
Research Report
虎眼万年青鳞茎转录组特性分析
姜福星 1 江欣燕 1 吴生 2 杨丽娟 1 李文骥 1 陈其兵 1*
1四川农业大学园林研究所,成都, 611300; 2广东虎眼万年青种植场,中山, 528429
*通讯作者, cqb@sicau.com
摘 要 虎眼万年青具有很高的药用价值和经济价值，鳞茎是其主要的药用和繁殖器官，然而虎眼万年青
鳞茎的分子生物学信息严重缺乏成为制约其研究生产的瓶颈。为获得虎眼万年青鳞茎的转录组信息，应用
高通量测序技术对虎眼万年青鳞茎进行测序分析。采用 His4000测序平台共获得 8.2 G原始数据，经过整
理分析后，获得 7.6 G有效数据和 121 223条 Unigene；经过与 NR、GO、COG及 KEGG等数据库进行比较
分析后，56 374 条 Unigene 获得 NR 数据库的注释，39 263 条 Unigene 获得 GO 数据库的注释，12 388 条
Unigene获得 COG功能注释，5 405条 Unigene参与了新陈代谢途径，2 477条 Unigene参与了次生代谢途
径，166条 Unigene参与了萜类的合成，195条 Unigene参与了生物碱的合成，295条 Unigene作为转录因子
参与新陈代谢过程调控。研究结果为采用生物技术手段提高虎眼万年青的药用成分的含量及改善其园艺
性状提供了分子数据。
关键词 虎眼万年青,鳞茎,转录组测序,特性分析
Transcriptome Sequencing and Characteristic Analysis of Ornithogalum
caudatum
Jiang Fuxing 1 Jiang Xinyan 1 Wu Sheng 2 Yang Lijuan 1 Li Wenyi 1 Chen Qibing 1*
1 Institue of Garden Research, Sichuan Agriculture University, Chengdu, 611130; 2 Guangdong Ornithogalum Plantation, Zhongshan, 528429
* Corresponding author, cqb@sicau.com
DOI: 10.13271/j.mpb.013.002038
Abstract Ornithogalum caudatum possess very high medicinal and economical value, bulbs are their very
important medicinal and reproductive organs, however the genetics basis about O. caudatum bulb is virtually
unknown, these problem become bottleneck to their research and production. In order to get transcriptome
information about bulb of Ornithogalum caudatum, we carry out transcription sequencing of their bulb by high
throught sequencing. By using His4000 platform, 8.2 G raw data were obtained. After bioinformatics analysis, 7.6 G
valid data and 121 223 Unigene were obtained ; after comparison with and NR, GO, COG and KEGG search
database, 56 374 Unigenes were assigned into NR, 39 263 Unigenes were assigned into GO, 12 388 Unigene were
assigned into COG, 5 405 were involved in metabolites, 2 477 Unigenes were involved in biosynthesis of
secondary metabolites, in which 166 and 195 Unigene were involved in terpenoids and alkaloid biosynthesis
respectively, 295 Unigene take part in regulation of metabolites as transcription factors. These results can be used
to produce genetically improved varieties of Ornithogalum with increase secondary metabolite yields, different
compound compositions and better medicinal and agronomic characteristics.
Keywords Ornithogalum caudatum, Bulb, Transcriptome sequencing, Characteristic analysis
收稿日期：2015-07-22 接受日期：2015-08-10 网络出版日期：2015-09-13
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/3719
基金项目：本研究由四川农业大学学科建设双支计划(64070105)和四川省教育厅重点项目(15ZA0023)共同资助
虎眼万年青(Ornithogalum caudatum)属于百合科
虎眼万年青属多年生鳞茎植物，原产于非洲，后被引进
入中国，在东北和广东等地栽培，其鳞茎晶莹碧玉、秀
丽雅致，鳞茎包皮上产生的小仔球，形似虎眼且与叶片
表 1原始数据与有效数据
Table 1 Raw data and available data
样本
Samples
原始数据
Rawdata
有效数据
Cleandata
读数
Reads
54 030 586
53 116 228
碱基
Bases
8 158 618 486
7 600 244 437
Q20值 (%)
Q20 (%)
96.50
97.96
Q30值 (%)
Q30 (%)
91.36
93.59
GC含量 (%)
GC (%)
49.31
49.19
错误率 (%)
Error (%)
0.014 0
0.012 1
的生长形成对应关系，因而得名(宜亭, 2001,花木盆
景:花卉园艺, (3): 54; 陈璋, 2004, 花木盆景:花卉园
艺, (4): 4-5)；开始只是作为观赏植物栽培，后来发现
其可用来治疗肝炎和肿瘤等疑难病症，具有较高的
药用价值(徐暾海等, 2000;孙刚, 2015)；经分析表明，
其全草特别是鳞茎中含有的化学成分至少有 27种，
包括黄酮、生物碱、甾醇和多糖等多种有效成分
(Tang et al., 2001)；与叶片和根须等其他器官相比，
鳞茎中皂苷的种类和含量也最高(冯芳侠等, 2008)；
同时鳞茎具有较强的分化再生能力，不论野生还是
离体条件下，鳞茎都是虎眼万年青属植物最主要繁
殖器官(刘伟等, 2012)。
可见，虎眼万年青的鳞茎与百合科其他植物的
鳞茎非常相似，具有药用、繁殖和观赏等多种作用和
用途，可作为互相转化的“源和库”，对于其生长发育
起着重要的调节作用，对于科研和生产均具有重要
的价值和意义，引起了广泛的关注并成为研究的热
点(夏宜平等, 2005;吕英民等, 2009;吴沙沙, 2012)。
但是虎眼万年青及其鳞茎的研究目前多局限于组织
培养、药用活性成分的提取和鉴定、药理药效等方面
的研究(杨智蕴等, 1996,中草药, (7): 396-397;徐暾海
等, 2000; Tang et al., 2001; 2002; 白进发等, 2005;肖
冲和鱼红闪, 2006;赫玉芳等, 2010; Chen et al., 2012;
刘伟等, 2012;林淋等, 2014)，对其鳞茎的生理生化、
次生代谢及生长发育等方面的分子机制研究甚少，
其鳞茎分子数据的严重缺乏，成为制约虎眼万年青
研究和生产的瓶颈。
新一代转录组测序技术的发展对于分子生物学
的研究起到了巨大的推动作用。转录组测序(Tran-
scriptome sequencing)是基于 Illumina HiSeq 等测序
平台，研究特定组织或细胞在某个时期转录出来的
所有 mRNA，是基因功能及结构研究的基础和出发
点。通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某
一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转
录本序列信息(郝大程等, 2012; 江香梅等, 2014; 兰
道亮等, 2014)，不仅能够广泛应用于有参考基因组
序列的物种研究，如水稻、葡萄、黄瓜等，也能应用于
无参考基因组序列的物种，包括药用植物的次生代
谢、药用活性成分的分子机制的研究，如芝麻、虎杖、
樟树、白木香等，功能多且用途广阔(郝大程等, 2012;
江香梅等, 2014;兰道亮等, 2014)。基于转录组测序
得到的基因功能注释、蛋白质编码区序列、基因的表
达量、代谢途径等大量信息(郝大程等, 2012;江香梅
等, 2014;兰道亮等, 2014)，这些工作将为进一步研
究提供基础数据和重要参考(李滢等, 2010;林萍等,
2011; 郝大程等 , 2012; 魏利斌等 , 2012; 杨楠等 ,
2012; 张争等 , 2012; 王晓锋等 , 2013; 贾新平等 ,
2014;兰道亮等, 2014)。
本研究首次使用最新 Illumina HiSeq4000 转录
组测序平台对三年生虎眼万年青球茎进行测序分
析，分析其转录组特性。
1结果与分析
1.1测序数据初步分析
虎眼万年青鳞茎转录组测序后得到的原始数据
及去除杂质之后的有效数据结果显示(表 1)：获得原
始数据 8.2 G和 54 030 586条原始读序(Reads)，测序
数据质量评估采用软件 FastQC (v0.10.1)进行分析，
绝大部分碱基序列的平均质量值峰值大于 30，序列质
量较好(图 1)；过滤后得到有效数据 7.6G和 53 116 228
条读序(Reads)，质量参数 Q20 (%)为 97.96%，GC (%)
含量 49.19%，错误率为 0.012% (表 1)。
获得 121 223条Unigene序列，总碱基 67 913969，
最大 13 727 bp，最小 201 bp，平均 560.24 bp，N50值
为 850 bp，GC值为 46.81%。其中 1~400 bp有 77 670
条，占 64.07%；401~600 bp有 15 330条，占 12.65%；
601~800 bp 有 7 049 条，占 5.81%；800 bp 以上有
48 026 条；占 28.94%；10 000 bp 有 24 条占 0.01%
(图 2)。
1.2 Unigenes功能注释及 NR数据库注释
将拼接所获得的 121 223条 Unigene序列，使用
虎眼万年青鳞茎转录组特性分析
Transcriptome Sequencing and Characteristic Analysis of Ornithogalum caudatum 2039
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 1碱基质量分布图
Figure 1 Distribution curve of reads base quality
图 2 Unigene长度与数量统计表
Figure 2 Distribution table of number and length of unigene
图 3虎眼万年青 Unigene比对到的物种类别
Figure 3 Ornithogalum caudatum Unigenes camparision to species
distribution
BlastX 分别与 NR、String、Swissprot、KEGG 等数据
库进行比对，获得相应的功能注释；24 867条 Uni-
gene在 Pfam数据库获得注释，占总数的 20.51%；
21 440条 Unigene在 KEGG数据库中获得注释，占
17.69%；29 940条 Unigene在 Swissprot数据库中获
得注释，占 24.70%；15 813条 Unigene在 String数据
库中获得注释，占 13.04%；56 374条 Unigene在 NR
数据库中获得注释，占 46.50%。
121 223 条 Unigene 中有 56 374 条 Unigene 获
得 NR数据库的注释，其中：比对到海枣等植物物种
的有 16 369条，占获得注释的 56 374条 Unigene的
29.04%；比对到纹枯病原菌等微生物物种的有 20 401
条，占注释中的 36.19%；比对到未知和其他物种的有
19 604条，占注释中的 34.78% (图 3)。在比对到植物
物种中，有 12 686条比对到海枣，1 443条到葡萄，
660条到水稻，396条到可可，307 条到小米，297 条
到杨树，292条到桃树，288条到高粱。在 NR数据库
中，有 12 686条 Unigene比对到海枣，占获得注释的
Unigene总数的 22.50%，而比对到水稻、小米和高粱
等其他禾本科植物的 Unigene仅有 660条、307条和
288条，仅占 1.17%、0.54%和 0.51% (图 3)。这说明，
同为单子叶植物，百合科的虎眼万年青与棕榈科植
物海枣的亲缘关系可能比较近，而与单子叶植物中禾
本科植物亲缘关系可能比较远。与双子叶植物相匹配
的物种中，比对到葡萄的最多有 1 443条，占 2.56%，其
次为可可、杨树和桃树，分别为 396条、297条和 292
条，说明虎眼万年青作为百合科的单子叶植物与双子
叶植物物种的亲缘关系总体来说是比较远的。
比对到微生物、未知和其他物种的 40 005 条
Unigene所占的比例超过 70%，比对到植物的 16 369
条 Unigene不到 30%。这可能是因为虎眼万年青鳞
茎长期生长在土壤中，有很多内生共生的真菌、细菌
和放线菌等微生物菌群；同时虎眼万年青基因组信
息未知，缺乏参考序列，难以将虎眼万年青本身特有
的基因信息和与其共生的微生物的基因信息分离开
来，但这也为从虎眼万年青中筛选出有益的内生菌
进行虎眼万年青皂苷等药用活性成分的研发以及生
物农药的生产提供了非常有价值的信息和线索。
2040
虎眼万年青鳞茎转录组特性分析
Transcriptome Sequencing and Characteristic Analysis of Ornithogalum caudatum
图 4 COG功能分类图
注: A: RNA过程与修饰; B:染色质结构和变化; C:能量生产和
转化; D:细胞循环控制、细胞分裂及染色体参与; E:氨基酸运
输和新陈代谢; F:核苷酸运输和新陈代谢; G:糖类运输和代谢;
H:辅酶运输和代谢; I:脂类运输和代谢; J:翻译、核糖体结构和
生物合成; K:转录; L:复制、重组和修补; M:细胞壁膜生物合
成; N:细胞移动; O:翻译后修饰蛋白质折叠和分子伴侣; P:无
机离子运输和代谢; Q:次生代谢合成运输和代谢; R:一般功能
预测; S:未知功能; T:信号传导机制; U:细胞内交通分泌及囊
泡运输; V:防御机制; W:细胞外结构; Y:核结构; Z:细胞骨架
Figure 4 Classification chart of COG function
Note: A: RNA processing and modification; B: Chromatin struc-
ture and dynamics; C: Energy production and conversion; D: Cell
cycle control, cell division, chromosome partitioning; E: Amino
acid transport and metabolism; F: Nucleotide transport and
metabolism; G: Carbohydrate transport and metabolism; H:
Coenzyme transport and metabolism; I: Lipid transport and
metabolism; J: Translation, ribosomal structure and biogenesis;
K: Transcription; L: Replication, recombination and repair; M:
Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N: Cell motility; O:
Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; P:
Inorganic ion transport and metabolism; Q: Secondary metabo-
lites biosynthesis, transport and catabolism; R: General function
prediction only; S: Function unknown; T: Signal transduction
mechanisms; U: Intracellular trafficking, secretion, and vesicular
transport; V: Defense mechanisms; W: Extracellular structures;
Y: Nuclear structure; Z: Cytoskeleton
1.3 Unigene的 COG分类
对 Unigene进行了 COG分类，共获得 12 388个
COG功能注释，涉及 25个 COG功能类别，其中，
“翻译、核糖体结构和生物合成”(Translation, riboso-
mal structure and biogenesis)的转录物最多，有 1 298
个，占 10.48%；其次为“转录”(Transcription) 1 048
个，比例为 8.46%。在该转录组中，涉及植株生长发育
相关的功能定义主要包括：RNA组装修饰、染色体结
构变化、能量生产转化、氨基酸运输代谢、核酸运输
代谢、糖类运输代谢、辅酶运输代谢、脂类运输代谢、
细胞循环控制与细胞分裂及染色体参与、翻译与核
糖体结构及合成、信号转导机制、细胞壁、转录等多
个生理生化过程(图 4)。
1.4 Unigene的 GO分类
GO功能分类体系中(图 5)，有 39 263条 Unigene
具有具体功能定义，占 121 223条 Unigene的 32.39%；
共得到 65 472个 GO功能注释，平均每条转录物序
列 1.67个 GO注释。在 GO分类体系中，可被分为细
胞组份、分子功能和生物学过程三大类别下面的 47
个更详细的小的类别；52 761个转录物为细胞组份
(31.03%)，38 203 个转录物为分子功能(22.47%)，
79 057个转录物为生物学过程(46.50%)。
在细胞组份功能类型中，细胞所占比例最高为
21.29%，其次为细胞部分为 21.28%，而突触和突触
部分含量最低，仅有 5条序列；在分子功能类型中，
催化活性和蛋白结合所占比例最高，分别为 47.15%
和 38.83%；蛋白质标签和通道调控活性最低，仅有
3条和 1条序列；在生物学过程类型中，主要的生命
过程分别是代谢过程和细胞过程，分别是 26.94%和
21.65%，激素分泌和生物阶段最低，仅有 2条序列。
GO功能注释中，还获得了与鳞茎发育相关的发育
过程显微结构 940条 Unigene，有机物质新陈代谢
15 501条 Unigene，单一和多个组织过程 852条 Un-
igene，生长发育及发育过程调控的 222条 Unigene，为
研究鳞茎发育的分子机制提供了新的线索和信息。
1.5 KEGG代谢途径分析
KEGG代谢途径表明，有 5 405条 Unigene参与
了新陈代谢途径，至少有 1 878条 Unigene参与了苯
丙氨酸，酪氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷胱甘肽、色氨酸、
甘氨酸，丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸
等蛋白质代谢途径；至少 1 754条 Unigene参与了果
糖和甘露糖等糖类代谢途径，至少 358条参与了多
糖的代谢，至少 755条 Unigene参与了甘油脂和亚
油酸等脂类代谢途径(表 2)。这些与以前的报道是基
本一致的，人们已经通过生化分析发现，虎眼万年青
中含有苯丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、胱氨酸等多种氨
基酸(杨智蕴等, 1996,中草药, (7): 396-397)；而且虎
眼万年青的多糖主要由葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳
糖等单糖组成，呈现出较高的抗肿瘤活性，可探索开
发为天然抗肿瘤药物或功能食品(Chen et al., 2012)等。
2 477条 Unigene参与了次生代谢途径，吲哚类
和异喹啉类等生物碱类代谢途径 195条 Unigene，单
萜、双萜和萜类骨架等萜类代谢途径 166 条 Uni-
gene，嘧啶 369条，嘌呤 485条；其中，至少 397条 U-
nigene参与抗氧化的代谢途径，248条 Unigene参与
了谷胱甘肽代谢途径，83条参与了抗坏血酸途径，32
2041
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 5 Unigene的 GO分类图
注: 1:生殖; 2:多元有机体过程; 3:发育过程; 4:生物过程的正调控; 5:多细胞组织过程; 6:细胞过程,激素分泌; 7:单一组织过
程; 8:生长; 9:信号; 10:生物过程的负调控; 11:代谢过程; 12:生物调节; 13:免疫系统过程; 14:生殖过程; 15:生物过程的调控;
16:定位的建立; 17:细胞组分的组织或生物形成; 18:生物阶段和节律过程; 19:对刺激的反应和生物粘黏; 20:定位; 21:细胞外
区域部分和细胞外基质部分; 22:膜部分; 23:细胞连接; 24:细胞核; 25:细胞; 26:共质体部分,共质体; 27:病毒部分; 28:细胞
器; 29:细胞部分; 30:病毒; 31:膜关闭内腔,共质体; 32:细胞外基质; 33:膜; 34:大分子复合体; 35:细胞器部分; 36:电子携带活
动; 37:蛋白绑定转录因子活性; 38:绑定; 39:转运器活性,通道调节活性,蛋白标签; 40:催化活性,金属伴侣活性; 41:鸟嘌呤核
苷酸交换因子活性,营养库活性; 42:酶调节活性; 43:分子传感器活性; 44:结构分子活性; 45:核酸绑定转录因子活性; 46:受体
活性; 47:抗氧化活性
Figure 5 GO classification chart of all unigene
Note: 1: Reproduction; 2: Multiorganism process; 3: Developmental process; 4: Positive regulation of biological process; 5: Multicellu-
lar organismal process; 6: Cellular process, hormone secretion; 7: Single-organism process; 8: Growth; 9: Signaling; 10: Negative regu-
lation of biological process; 11: Metabolic process; 12: Biological regulation; 13: Immune system process; 14: Reproductive process;
15: Regulation of biological process; 16: Establishment of localization; 17: Cellular compnent organization or biogenesis; 18: Biologi-
cal phase: rhythmic process; 19: Response to stimulus, biological adhesion; 20: Locomotion; 21: Extracelllar matrix, extracellular re-
gion part, collagen trimer; 22: Membrane part; 23: Cell junction; 24: Nucleoid; 25: Cell; 26: Synapse part, symplast; 27: Virion part;
28: Organelle; 29: Cell part; 30: Virion; 31: Membrane-enclosed lumen, synapse; 32: Extracellular matrix part; 33: Membrane; 34:
Macromolecular complex; 35: Organelle part; 36: Electron carrier activity; 37: Protein binding transcription factor activity; 38: Bind-
ing; 39: Transporter activity, channel regulator activity, protein tag; 40: Catalytic activity, metallochaperone activity; 41: Guanyl-nu-
cleotide exchange factor acitivity, nutrient reservoir activity; 42: Enzyme regulator activity; 43: Molecular transducer activity; 44:
Structural molecule activity 45 nucleic acid binging transcription factor activity; 46: Receptor activity; 47: Antioxidant activtity
条参与了黄酮和类黄酮途径，1条参与了花青素代谢
途径，33条参与了甜菜色素代谢途径(表 2)。
还有至少有 1 564条 Unigene与挥发性物质相
关的代谢途径，包括脂肪酸、花生四烯酸、硫辛酸等
酸类物质，酚类、烷烃、酯类、柠檬烯和 α-蒎烯等烷
烯类、芳香复合物、松香油和香叶醇等苯环类物质、
甾醇和油菜素甾醇等(表 2)；116条参与了成瘾性物
质相关的代谢途径，包括咖啡、可卡因、烟碱和苯丙
胺等(表 2)；81条 Unigene所组成的硒复合物代谢途
径(表 2)，虎眼万年青每克干品中含有硒元素 46.32mg，
是现有的已知的植物中含量最高的(杨智蕴等, 1996,
中草药, (7): 396-397),硒是人体谷胱甘肽过氧化酶
的重要组成成分，不仅能有效地清除人体自由基，延
缓细胞衰老，而且在分子水平上能拮抗致癌物质、阻
断癌细胞的供血渠道来预防和抑制肿瘤。硒在预防
多种疾病方面起重要作用，虎眼万年青具有抗氧化
和抗癌等功效是与其善于富集土壤中硒元素并且含
量很高密切相关的(杨智蕴等 , 1996, 中草药 , (7):
396-397)。
采用质谱等研究方法，已经证明虎眼万年青鳞
茎中含有嘧啶、嘌呤、甾醇、酸类、多种糖苷、芦丁(黄
酮)等 27中有效成分(徐暾海等, 2000; Tang et al., 2001;
2002;林淋等, 2014)，并从中分离鉴定了单萜内酯和
虎眼万年青皂苷(白进发等, 2005; 肖冲和鱼红闪 ,
2006)，以及虎眼万年青能产生挥发性物质，挥发油中
含有烷类、甾醇、酸类等活性物质(赫玉芳等, 2010)。
KEGG代谢途径的分子数据分析结果与生理生
化研究互相验证，为深入研究虎眼万年青的药用成
分及所具有的抗肿瘤、镇痛抗炎和抗氧化等药效
(Chen et al., 2012;于艳辉等, 2013;林淋等, 2014;徐
旸等, 2014)提供了科学依据和参考。
1.6虎眼万年青皂苷合成的关键酶
虎眼万年青皂苷是虎眼万年青的主要有效成
2042
表 2虎眼万年青 KEGG代谢途径分析
Table 2 KEGG pathway analysis of Ornithogalum caudatum
编码
ID.
ko01100
ko03022
ko00561
ko00564
ko00591
ko00592
ko01230
ko00310
ko00270
ko00250
ko00410
ko00260
ko00380
ko00460
ko00350
ko00480
ko00340
ko04724
ko00400
ko03050
ko00500
ko01212
ko00590
新陈代谢途径
Metabolic pathways
新陈代谢途径
Metabolic pathways
基本转录因子
Basal transcription factors
甘油脂
Glycerolipid metabolism
甘油磷脂
Glycerophospholipid metabolism
亚油酸
Linoleic acid metabolism
α亚油酸
alpha-Linolenic acid metabolism
氨基酸合成
Biosynthesis of amino acids
赖氨酸降解
Lysine degradation
半胱氨酸和蛋氨酸
Cysteine and methionine metabolism
丙氨酸,天门冬氨酸和谷氨酸
Alanine, aspartate and glutamate
β丙氨酸
beta-Alanine metabolism
甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸
Glycine, serine and threonine metabolism
色氨酸
Tryptophan metabolism
氰基氨基酸
Cyanoamino acid metabolism
酪氨酸
Tyrosine metabolism
谷胱甘肽
Glutathione metabolism
组氨酸
Histidine metabolism
谷氨酸
Glutamatergic synapse
苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸
Phenylalanine, tyrosine and
tryptophan biosynthesis
蛋白酶体
Proteasome
淀粉和蔗糖
Starch and sucrose metabolism
脂肪酸
Fatty acid metabolism
花生四烯酸
Arachidonic acid metabolism
基因数量
Gene number
5 405
123
149
214
43
57
876
163
282
237
156
258
184
175
187
248
86
123
122
239
617
238
54
编码
ID.
ko00120
ko04971
ko00785
ko00052
ko00030
ko00040
ko00051
ko00513
ko00512
ko00531
ko00550
ko00510
ko00511
ko00534
ko00240
ko00230
ko00944
ko00942
ko00906
ko00965
ko00073
ko00941
ko00902
新陈代谢途径
Metabolic pathways
胆汁酸
Primary bile acid biosynthesis
胃酸
Gastric acid secretion
硫辛酸
Lipoic acid metabolism
半乳糖
Galactose metabolism
磷酸戊糖
Pentose phosphate pathway
戊糖和己糖醛酸
Pentose and glucuronate
interconversions
果糖和甘露糖
Fructose and mannose metabolism
多糖合成
Various types of N-glycan biosynthesis
Mucin型多糖合成
Mucin type O-Glycan biosynthesis
糖胺多糖
Glycosaminoglycan degradation
肽聚糖
Peptidoglycan biosynthesis
N聚糖合成
N-Glycan biosynthesis
其他聚糖的降解
Other glycan degradation
糖胺聚糖
Glycosaminoglycan biosynthesis
嘧啶
Pyrimidine metabolism
嘌呤
Purine metabolism
黄酮和类黄酮
Flavone and flavonol biosynthesis
花青素
Anthocyanin biosynthesis
类胡萝卜素
Carotenoid biosynthesis
甜菜素
Betalain biosynthesis
角质、软木质和蜡
Cutin, suberine and wax biosynthesis
类黄酮
Flavonoid biosynthesis
单萜
Monoterpenoid biosynthesis
基因数量
Gene number
10
36
10
172
207
254
146
115
1
19
6
153
60
4
369
485
14
1
33
33
17
19
3
虎眼万年青鳞茎转录组特性分析
Transcriptome Sequencing and Characteristic Analysis of Ornithogalum caudatum 2043
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
续表 2
Continuing table 2
编码
ID.
ko00904
ko00909
ko00900
ko00072
ko00430
ko00450
ko00960
ko00950
ko00901
ko00400
ko00073
ko00360
ko00053
ko00980
ko00965
ko00982
ko00140
ko00905
ko00945
ko00450
新陈代谢途径
Metabolic pathways
二萜
Diterpenoid biosynthesis
倍半萜和三萜
Sesquiterpenoid and triterpenoid biosyn-
thesis
萜类骨架
Terpenoid backbone biosynthesis
酮体合成与降解
Synthesis and degradation of ketone bod-
ies
牛磺酸和亚牛磺酸
Taurine and hypotaurine metabolism
硒复合物
Selenocompound metabolism
莨菪烷类生物碱
Tropane, piperidine and pyridine alkaloid
biosynthesis
异喹啉类生物碱
Isoquinoline alkaloid biosynthesis
吲哚类生物碱
Indole alkaloid biosynthesis
苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸
Phenylalanine, tyrosine
and tryptophan biosynthesis
角质、软木质和蜡合成
Cutin, suberine and wax biosynthesis
苯丙氨酸
Phenylalanine metabolism
抗坏血酸
Ascorbate and aldarate metabolism
细胞色素 P450的外源物代谢
Metabolism of xenobiotics
by cytochrome P450
甜菜色素
Betalain biosynthesis
细胞色素药物代谢
P450 Drug metabolism-cytochrome P450
甾类激素
Steroid hormone biosynthesis
油菜素甾醇
Brassinosteroid biosynthesis
芪类化合物和姜香酮
Stilbenoid, diarylheptanoid and
gingerol biosynthesis
硒复合物
Selenocompound metabolism
基因数量
Gene number
16
20
127
28
38
81
90
104
1
122
17
189
83
122
33
113
16
15
17
81
编码
ID.
ko00100
ko00930
ko00361
ko00281
ko00364
ko00627
ko00565
ko00363
ko00624
ko00626
ko00903
ko00623
ko00830
ko00643
ko01220
ko00650
ko00680
ko00642
ko05030
ko05031
ko05033
ko05032
新陈代谢途径
Metabolic pathways
甾醇
Steroid biosynthesis
己内酰胺
Caprolactam degradation
氯代环己烷和苯
Chlorocyclohexane and
chlorobenzene degradation
香叶醇
Geraniol degradation
氟苯甲酸乙酯
Fluorobenzoate degradation
氨基苯甲酸酯
Aminobenzoate degradation
醚脂
Ether lipid metabolism
双酚
Bisphenol degradation
多环芳烃
Polycyclic aromatic
hydrocarbon degradation
萘
Naphthalene degradation
柠檬烯和 α-蒎烯
Limonene and pinene degradation
甲苯
Toluene degradation
松香油
Retinol metabolism
苯乙烯
Styrene degradation
芳香复合物降解
Degradation of aromatic compounds
丁酸乙酯
Butanoate metabolism
甲烷
Methane metabolism
乙苯
Ethylbenzene degradation
可卡因
Cocaine addiction
苯丙胺
Amphetamine addiction
烟碱
Nicotine addiction
吗啡
Morphine addiction
基因数量
Gene number
135
18
18
26
11
103
70
17
15
36
41
16
37
39
60
94
188
13
13
71
5
27
2044
表 3虎眼万年青皂苷代谢的关键酶
Table 3 Key ezyme involved in caudaside metabolic in Ornithogalum caudatum
通路
Patyway
虎眼万年青皂苷
Ornithogalum caudaside
酶的编号
Ezyme ID
EC: 2.5.1.21
[EC:1.14.13.132]
[EC:1.1.1.216]
[EC:4.2.3.22(EC:4.2.3.75])
[EC:4.2.3.73 (EC:4.2.3.86])
Unigene数量
No. of unigene
9
6
1
3
1
Blast注释
Blast annotation
法呢酰二磷酸酯法呢酰基转移酶
Farnesyl-diphosphate farnesyltransferase (FDFT1)
鲨烯单加氧酶
Squalene monooxygenase (SQLE, ERG1)
金合欢醇脱氢酶
Farnesol dehydrogenase (FLDH)
大牻牛儿烯 D合成酶
Germacrene D synthase (GERD)
瓦伦烯(蛇床烯)合成酶
Valencene/7-epi-alpha-selinene synthase (TPS1)
分，经研究表明其属于甾体皂苷，具有抗肿瘤、抗真
菌、防治心脑血管疾病、降血糖和免疫调节等多种药
效和生物活性，明确虎眼万年青皂苷的生物合成途
径及其相关的关键合成酶是利用生物技术手段提高
虎眼万年青中有效成分含量的前提(肖冲和鱼红闪,
2006)。虎眼万年青皂苷的生物合成主要由 20条 U-
nigene编码 5个关键酶，其中包括：9条 Unigene编
码的法呢酰二磷酸酯法呢酰基转移酶(farnesyl-diph-
osphate farnesyltransferase, FDFT1)，6 条 Unigene 编
码的鲨烯单加氧酶(squalene monooxygenase, SQLE)，
1 条 Unigene 编码的金合欢醇脱氢酶 (farnesol de-
hydrogenase, FLDH)，3 条 Unigene 编码的大牻牛儿
烯 D合成酶(germacrene D synthase, GERD)，1条 Uni-
gene编码的瓦伦烯(蛇床烯)合成酶(Valence-ne/7-epi-
alpha-selinene synthase, TPS1) (表 3)。
此外，细胞色素 P450家族在虎眼万年青皂苷、
黄酮、甾醇等次生代谢物质的合成中起着重要作用
(徐洁森等, 2012)，从虎眼万年青 KEGG代谢途径中
找到 235 条 Unigene 可能参与编码细胞色素 P450
基因，包括乙醛脱氢酶、微粒体环氧化物水解酶和谷
胱甘肽 s-转移酶等，同时参与了细胞色素P450的
外源物质的代谢中。
1.7微卫星 SSR信息分析
对虎眼万年青的 121 223 条 Unigene 进行 SSR
位点搜索，共检测到 24 466个 SSR位点。SSR的类
型丰富，单核苷酸、双核苷酸到五核苷酸、六核苷酸
重复类型均存在，所占比例差别很大。其中，三核苷
酸所占比例最高，达到了 47.88%；比例最低的是五
核苷酸重复，仅为 0.44%；单核苷酸和二核苷酸所占
比例基本相同，分别为 23.51%和 25.98%。在检测到
的 SSR中，出现频率最高的 5类基序为：AGG/TCC、
AAC/TTG、AG/CT、AC/GT、A/T和 C/G等，这说明虎
眼万年青的微卫星基本是以三核苷酸的 AGG/TCC
和 AAC/TTG基序、二核苷酸 AG/CT和 AC/GT基序
及单核苷酸的 A/T和 C/G基序为最多(表 4)。上述
SSR特征的分析，有助于深入了解虎眼万年青微卫
星的组成、特点和分布，为进行虎眼万年青的微卫星
分子标记开发、遗传图谱构建以及遗传多样性和亲
缘关系的分析奠定了基础。
2讨论
高通量测序与建立文库等传统方法相比，具有
获得的数据量大、速度快、成本低和效率高等优点，
尤其适合没有参考基因组信息的物种展开研究(李滢
等, 2010; 林萍等, 2011; 郝大程等, 2012; 魏利斌等,
2012; 杨楠等, 2012; 张争等, 2012; 贾新平等, 2014;
兰道亮等, 2014)。高通量测序平台和技术也在与时俱
进，不断发展，从最初的 454GS FLX Titanium到 Illu-
mina HiSeq2000和 Illumina HiSeq4000。获得的转录
组测序数据的数量和质量尽管与不同物种本身的遗
传特性、基因组大小等因素有关系，但是测序平台的
高低往往成为测序效果的重要因素。虽然都是鳞茎
花卉，虎眼万年青鳞茎采用 Illumina HiSeq4000测序
平台获得 7 600 244 437 bp 有效数据和 121 223 条
Unigene，平均长度为 560 bp；石蒜鳞茎采用 Roche
454平台获得 308 633 593 bp有效数据和 14 111条
Unigene (Wang et al., 2013)，前者的有效数据和 Uni-
gene 分别是后者的 24.63 倍和 8.59 倍；与采用
Roche 454平台进行测序的木本植物白木香相比(张
争等, 2012)，数量和质量都要高出几倍和几十倍；采
虎眼万年青鳞茎转录组特性分析
Transcriptome Sequencing and Characteristic Analysis of Ornithogalum caudatum 2045
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 4虎眼万年青 SSR不同重复基序分布及优势碱基组成
Table 4 Distribution and compositions of the dominant repeat of the different repeat motif for SSR
重复基元长度
Length of repeat motif
单核苷酸
Mononucleotide
二核苷酸
Dinucleotide
三核苷酸
Trinucleotide
四核苷酸
Tetranucleotide
五核苷酸
Pentanucleotide
六核苷酸
Hexanucleotide
数量
Number
5 752
6 356
11 714
423
108
113
百分比(%)
Percentage (%)
23.51
25.98
47.88
1.73
0.44
0.46
优势重复基序
Advantage repeat motif
A/T; C/G
AG/CT; AC/GT
AGG/TCC; AAC/TTG
AAAT/TTTA
ATTTT/TAAAA
AGCGGG/TCGCCC
用 Illumina HiSeq4000和 Illumina HiSeq2000两个测
序平台也存在差距，鸟巢蕨采用 Illumina HiSeq2000
测序平台获得 5 908 586 517 bp有效数据和 42 907
条 Unigene (贾新平等, 2014)，分别仅占虎眼万年青
的 77.74%和 35.40%，只是测序质量稍好一些。这说
明，随着转录组测序技术的不断进步、测序平台的升
级改进及生物信息学的发展，能够从植物的转录组
数据中获得更理想的数据和有价值的信息。
在获得的 121 223 条 Unigene 中仅仅有 56 374
条在 NR 数据库中获得注释，占 46.50%，约有占
53.50%的 64 849 条 Unigene 未能得到注释，其中
Unigene序列片段长度不足，难以与同源基因进行比
对可能是最重要的原因。未能得到注释 64 519 条
Unigene中，1~600 bp的短序列占 90%以上，这与鸟
巢蕨转录组分析的研究结果相一致，转录组序列获
得的信息与被检测序列的长度紧密关联，转录组中
Unigene的序列越短，获得注释信息的可能性就越
低，高质量的测序结果及较长拼接序列的数据信息是
获得可靠性功能注释的前提和保证(贾新平等, 2014)。
而获得注释的 Unigene中，比对到微生物、未知
和其他物种的 40 005 条 Unigene 所占的比例超过
70%，比对到植物的 16 369条 Unigene不到 30%，这
可能主要是下面 2种原因造成的：(1)虎眼万年青基
因组遗传信息非常缺乏，虽然虎眼万年青属植物有
200多种，具有较高的观赏价值和药用价值，极具开
发潜力，但是对其的分子生物学研究才刚刚开始，
NR功能注释中，有 12 686 条 Unigene 比对到海枣
(Phoenix dactylifera)，12 448 条 Unigene 比对到瓜
亡革菌(Thanatepephorus cucumeris Frank)，12 020 条
Unigene比对到立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，7 851
条 Unigene比对到未知物种，1 443条 Unigene 比对
到葡萄，而比对到水稻、可可和桃树等物种的 Uni-
gene仅有几百条，这可能是转录组序列中存在很多
虎眼万年青属植物的新的功能基因，有待于深入分
析，为虎眼万年青属植物的研究提供新的重要信息；
(2)转录组数据中含有难以过滤的微生物遗传信息，
因为刚才提到的原因，虎眼万年青的基因组和转录
组信息严重缺乏，所采集的样本又是来自野外，虎眼
万年青鳞茎中可能含有大量的真菌、细菌和放线菌
等与其共生的内生菌(Endophyte)，而又很难将这些
微生物的遗传信息从转录组结果中清洁出来，但是
这也给进行虎眼万年青内生菌的研究提供了有价值
的信息和线索。植物内生菌是指存活于健康植物组
织内部，而又不引发宿主植物表现出明显感染症状
的微生物类群(姚领爱等, 2010)，内生菌具有可以促
进宿主植物次生代谢产物的合成，同时内生菌也能
合成与宿主植物相同或类似的次生代谢产物，增加
植物的抗病虫、抗干旱、固氮及生物修复等方面的能
力、促进植物的生长发育等作用，是有待于深入开发
的资源宝库及成为新的研究热点(南志标和李春杰,
2004; 李飞和李春杰 , 2006; 贾栗等 , 2007; 赵凯等 ,
2008;肖潇, 2011;陈向东, 2012;王志伟等, 2015)。这
提示我们，可以根据虎眼万年青鳞茎转录组分析数
据结合微生物实验技术进行虎眼万年青内生菌的研
究开发，如生产虎眼万年青皂苷等药用活性物质、研
制生物农药、增强虎眼万年青的抗逆性能和生物修
复的能力等。
KEGG代谢分析表明，虎眼万年青药用保健成
2046
分丰富多彩，不但含有多种氨基酸、多糖和亚油酸等
生理代谢途径，而且还含有生物碱、黄酮、硒复合物、
有机酸、皂苷和甾醇等多种药用活性成分，这样，转
录组测序分析的分子数据与虎眼万年青生理生化分
析得出的结论基本上得到了互相验证和相互补充(杨
智蕴等, 1996,中草药, (7): 396-397;徐暾海等, 2000;
Tang et al., 2001; 2002;白进发等, 2005;肖冲和鱼红
闪, 2006;赫玉芳等, 2010; Chen et al., 2012; 林淋等,
2014)，为进行深入研究奠定了基础。
KEGG代谢分析表明，有 123条 Unigene作为
转录因子调控新陈代谢过程，GO 功能分类表明有
618条 Unigene作为转录因子参与对虎眼万年青鳞
茎生长发育的调控，940条 Unigene参与了鳞茎发育
过程中显微结构的变化，222条 Unigene参与了鳞茎
生长发育和发育过程的调控，852条 Unigene参与了
鳞茎中单一和多个组织的形成过程，15 501条 Uni-
gene参与了鳞茎中有机物质新陈代谢的过程，这说
明鳞茎的发育和形成，是涉及到转录因子的调控和
功能基因的表达、信号的产生和传导、有机物质的代
谢、能量的形成和流动等系统而有序的过程，鳞茎的
研究成为今后虎眼万年青科研和生产的重要方向。
本研究首次在国内外采用 Illumina HiSeq4000
最新高通量测序平台建立了虎眼万年青鳞茎转录
组数据库，获得了大量的转录本信息，并对在鳞茎
中表达基因进行了序列组装、功能注释和分类、代
谢途径和微卫星位点分析，揭示了虎眼万年青鳞茎
转录组的总体概况和基本特征。为深入进行虎眼万
年青的药用活性成分、器官发育和抗性生理以及分
子标记等方面的研究提供了基础数据和丰富的信
息，为进一步挖掘虎眼万年青鳞茎相关的重要基因，
对虎眼万年青鳞茎的生长发育进行调控，从而提高
其药用活性成分的含量及改良其园艺性状奠定了基
础，为进行虎眼万年青属植物的研究开发也提供了
参考和依据。
3材料与方法
3.1材料
本研究所采用的虎眼万年青鳞茎由广东中山市
虎眼万年青种植场吴生总经理鉴定并提供，盆栽于
四川农业大学园林研究所实验地内，选择其中 5个
三年生生长健壮的虎眼万年青鳞茎作为实验材料。
3.2 RNA提取
使用 TRIzol 试剂(Invitrogen 美国)分别提取总
RNA，为清除残留的基因组 DNA,，每个 RNA样本中
加入 10 U DNaseⅠ (TaKaRa,日本) 37℃孵育 30 min，
5个 RNA样本的浓度被测定后，每个样本各取 10 μg
等量混合组成一个 RNA池(RNA pool,共 30 μg) (郝
大程等, 2012;江香梅等, 2014;兰道亮等, 2014)。接
着使用 Oligotex mRNAMidi Kit (Qiagen,德国)分离纯
化样品 mRNA (郝大程等, 2012;江香梅等, 2014;兰
道亮等, 2014)。整个 RNA的质量和含量通过使用
NanodropND-1000(LabTech,美国)检测吸光度 260nm/
280 nm (A260/A280)进行测定(郝大程等, 2012; 江香梅
等, 2014;兰道亮等, 2014)，RNA的完整性通过 1.5%
(w/v)凝胶电泳进行检测(李滢等, 2010;林萍等, 2011;
郝大程等, 2012;魏利斌等, 2012;杨楠等, 2012;张争
等, 2012;贾新平等, 2014;兰道亮等, 2014)。
3.3 cDNA 测序文库的构建及 Illumina4000 高通量
测序
使用 SOLiD Whole Transcriptome Analysis Kit
(Life technologies,美国)，参照其说明书标准流程构
建随机片段测序文库(郝大程等, 2012;江香梅等, 2014;
兰道亮等, 2014)。用带有 Oligo(dT)的磁珠富集 poly
(A) mRNA，加入打断试剂在恒温振荡孵育器中适温
将 mRNA打断成短片段，以打断后的 mRNA为模板
反转录合成第一链 cDNA (郝大程等, 2012;江香梅等,
2014; 兰道亮等 , 2014)；利用 DNA polymeraseⅠ、
dNTPs及 RNaseH配制第二链合成反应体系合成第
二链 cDNA (郝大程等, 2012; 江香梅等, 2014; 兰道
亮等, 2014)；经过试剂盒纯化回收、黏性末端修复
后，在 cDNA的 3，末端加上碱基“A”并连接接头，然
后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行 PCR
扩增得到测序文库，构建好的文库进过质检合格后，
使用 Illumina HiSeqTM 2000进行测序(李滢等, 2010;
林萍等, 2011; 郝大程等, 2012; 魏利斌等, 2012; 杨
楠等, 2012; 张争等, 2012; 贾新平等 , 2014; 兰道亮
等, 2014)。
3.4序列拼接与组装
使用二代测序数据质量统计软件 Trimmomatic
(v0.30) 对测序 Rawdata去除接头以及低质量序列等，
得到后续信息分析的 Cleandata，采用软件 FastQC
(v0.10.1)进行分析，评估结果信息(郝大程等, 2012;
江香梅等, 2014;兰道亮等, 2014)；对用短 Reads组装
软件 Trinity进行转录组样品数据从头组装，对组装
结果通过序列聚类软件 cd-hit-est (v4.5.4)做进一步
虎眼万年青鳞茎转录组特性分析
Transcriptome Sequencing and Characteristic Analysis of Ornithogalum caudatum 2047
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
序列拼接和去冗余处理，得到长的非冗余的 Unigene
序列，采用短 Reads 组装软件 Trinity (版本号
r2013-02-25)进行转录组样品数据从头组装，对组装
结果通过序列聚类软件 cd-hit-est (v4.5.4)做进一步
序列拼接和去冗余处理，得到长的非冗余的 Unigene
序列 (郝大程等, 2012; 江香梅等, 2014; 兰道亮等,
2014)。
3.5 Unigene功能注释、GO分类和代谢路径分析
用 Blastx将 Unigene序列比对到蛋白质数据库
Nr (NCBI非冗余蛋白库)、SwissProt (去冗余的蛋白
数据库)、KEGG (系统分析基因产物在细胞中的代谢
途径及这些基因产物功能的数据库)和 COG (对基因
产物进行直系同源分类的数据库) (E值＜1e-5) (郝大
程等, 2012;江香梅等, 2014;兰道亮等, 2014)，再通
过 BlastN将 Unigene比对到核酸数据库 Nt(NCBI非
冗余核酸数据库)(E值＜1e-5)(郝大程等, 2012;江香
梅等, 2014;兰道亮等, 2014)，得到给定 Unigene具有
最高序列相似性的蛋白，从而得到该 Unigene的蛋
白功能注释信息(郝大程等, 2012; 江香梅等, 2014;
兰道亮等, 2014)。采用 Blast2GO软件，根据 Nr注释
信息得到 GO注释信息；采用 WEGO软件对 ALL-
Unigene (按照分子功能, 细胞组分, 生物学过程)进
行GO功能分类统计，从宏观上认识碰碰香的基因功
能分布特征。将 Unigene序列按 Nr、SwissProt、KEGG
和 COG的顺序做 BlastX比对(E 值＜1e-5) (郝大程
等, 2012;江香梅等, 2014;兰道亮等, 2014)。取比对
结果中 Rank最高的蛋白确定该 Unigene 的编码序
列，根据标准密码子表将该编码区序列翻译成氨基
酸序列，从而得到该 Unigene的核酸序列(序列方向
5-3)和氨基酸序列(郝大程等, 2012;江香梅等, 2014;
兰道亮等 , 2014)。我们根据 Nr 注释结果，使用
blast2G0软件进行基因本体 GO功能分析，得到每个
基因的 GO信息以及 GO功能分类，在宏观水平上
了解该物种或者样品的基因功能分布特征(郝大程等,
2012;江香梅等, 2014;兰道亮等, 2014)。根据 KEGG
注释的基因功能信息，对参与次生代谢的序列(按次生
代谢物种类)进行分类(李滢等, 2010;林萍等, 2011;
郝大程等, 2012;魏利斌等, 2012;杨楠等, 2012;张争
等, 2012;贾新平等, 2014;兰道亮等, 2014)。
作者贡献
陈其兵和姜福星是本研究的实验设计和实验研
究的执行人；姜福星完成数据分析，论文初稿的写作；
吴生培养并提供实验材料；江欣燕、杨丽娟、李文骥和
高顺参与实验设计，试验结果分析；陈其兵是项目的
构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作
与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由四川农业大学学科建设双支计划
(64070105)和四川省教育厅重点项目(035Z1025)共同
资助。
参考文献
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