全 文 ：2016 年 5 月 第 18 卷 第 5 期 中国现代中药 Mod Chin Med May 2016 Vol. 18 No. 5
·中药农业·
△［基金项目］ 广西中医药科技专项(GZKZ1133) ;南宁市科技成果推广及产业化示范项目(201101074C)
*［通信作者］ 蒋妮，副研究员，研究方向:药用植物栽培病虫害防治;Tel: (0771)5602461，E-mail:jiangni292@ 126. com
广西莪术叶斑病病原鉴定及生物学特性研究
△
蒋妮* ，刘丽辉，胡凤云，刘威，刘凡
(广西药用植物园，广西 南宁 530023)
［摘要］ 目的:明确广西莪术叶斑病病原菌种类，掌握其生物学特性。方法:依据柯赫氏法则进行致病性测定
和病原菌验证，通过形态学特征观察、rDNA-ITS序列分析来确定病原菌;设置不同的培养基、温度、PH值、湿度，
观测菌丝生长及孢子萌发，进行生物学特性研究。结果:病原菌为大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla) ;菌株
在 PDA培养基生长良好，加了莪术汁的 PDA培养基更利于生长及产孢，温度 20 ～ 30 ℃、PH值 5 ～ 6 条件下适宜菌
丝生长及孢子萌发，ＲH 为 80%时孢子萌发率最高。结论:广西莪术叶斑病病原菌鉴定为 Phomopsis longicolla;中
温、潮湿、偏弱酸性环境条件适宜该菌生长。
［关键词］ 广西莪术;病害;病原鉴定;生物学特性
Identification of Curcuma kwangsiensis Leaf Spot Pathogen and
Observation of Its Biological Characteristics
JIANG Ni* ，LIU Lihui，HU Fengyun，LIU Wei，LIU Fan
(Guangxi Botanical Garden of medicine plant，Nanning 530023，China)
［Abstract］ Objective:The study is aimed to iendtify the organism that leads to the Curcuma kwangsiensis leaf spot
andgrasp the biological characteristics of the pathogen. Methods:The fungus was isolated from infected plants according to
Koch’s Ｒule. The identification of the pathogen was carried out mainly based on the morphological characters and molecular
analysis of internal transcribed spacer(ITS)sequences;The effects of temperature，humidity，PH and nutrition on mycelial
growth and conidialgermination of the pathogen were also investigated. Ｒesults:The morphological characters of the pathogenic
isolate were in agreement with Phomopsis sp. When compared with sequences in GenBank，the ITS sequence of the pathogen
was 99% similar to that of P. longicolla. On the condition of PH5 ～ 6，20 ～ 30 ℃ the fungal isolates grow bette and the more
conidiums germinate. PDA medium with rhizomazedoariae juice was the optimum medium. Conclusion:The pathogen causing
C. kwangsiensis leaf spot was identifidied as P. longicolla. The fungal isolates grow better on the condition of medium
temperature，humidity and weak acid environment.
［Keywords］ Curcuma kwangsiensis;disease;pathogen identification;biological characteristic
doi:10． 13313 / j． issn． 1673-4890． 2016． 5． 017
广 西 莪 术 Curcuma kwangsiensis S. G. Leset
C. F. Liang，为姜科姜黄属多年生草本植物，是中药
莪术的三大基源植物之一，又称桂莪术、毛莪术。
以根茎作为中药莪术使用，具有破瘀行气、消积止
痛之功效;块根作为中药郁金(习称 “桂郁金”)使
用，有行气化瘀、清心解郁、利胆退黄的功能;近
期文献报道莪术油还具有抗肿瘤、抗病毒等作
用［1-2］。广西作为广西莪术的道地药材产区，传统种
植于钦州灵山县、贵港市等地，南宁市隆安县也有
栽培，全区种植面积上万亩。近年来随着药材及其
他作物种植结构的调整，以及周边环境的不断变化，
广西莪术叶斑病发生严重。病害发生早期多从叶尖
或叶缘处出现黄褐色斑点，随着病原菌的不断侵染，
病斑逐渐向叶中脉扩展，引起叶片大面积枯黄，后
期植株早衰死亡，严重影响广西莪术的栽培生产。
国内外关于广西莪术病害的研究尚未见报道，叶斑
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2016 年 5 月 第 18 卷 第 5 期 中国现代中药 Mod Chin Med May 2016 Vol. 18 No. 5
病为广西莪术病害的首次报道。因此，明确广西莪
术叶斑病病原菌种类及其生物学特性，能够对该病
害的预防与控制提供科学依据。
1 材料和方法
1. 1 采样与分离
2013 年 6 月，在广西隆安县城厢镇小林村广西
莪术种植基地，采集具有典型症状的莪术病叶及健
康叶片，用清水洗净病叶表面，进行病原菌的分离
及纯化［3］:在病健交界处剪取 20 块长宽 4 ～ 5 mm的
病叶组织，用 75%的酒精消毒 2 ～ 3 s，0. 1%升汞消
毒 2 min，无菌水冲洗 3 遍，置于灭菌滤纸上，吸干
水后将病叶组织分别接到装有 PDA 培养基的培养皿
上，共 20 皿，在 26 ℃恒温条件下培养，4 天后挑取
组织块周围的菌丝转皿培养、纯化，对分离物归类、
编号、转管保存。
1. 2 致病性测定
采取针刺方式进行。将纯化的菌株接种至马铃
薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) ，在 28℃、ＲH 为 65%
霉菌培养箱内扩繁培养 5 d，用打孔器制成直径为
9 mm的菌片备用。用无菌接种针在健康的广西莪术
叶片上刺成面积约为 1 cm2 的伤口，用接种铲将菌
片接至伤口，保湿培养 3 ～ 4 d，观察发病情况。根
据柯赫氏法则，对发病叶片进行再分离，显微镜下
观察分离病菌与原接种菌株是否相同［3］。以接种
PDA培养基作为对照，在室温(20 ℃ ～ 25 ℃)下保
湿培养 5 天，记录发病情况。
1. 3 形态学鉴定
将分离纯化后的病原菌在 PDA 上培养 5 d，在
菌落边缘取菌丝块接种于无菌广西莪术叶片，在
25 ℃、12 h /12 h 光照 /黑暗交替条件下培养，20 d
后，在光学显微镜下进行病原菌形态学观察和测量，
包括子座大小、分生孢子器形态及排列、分生孢子
形态及大小等。
1. 4 核糖体 rDNA-ITS序列分析
采用 SDS法提取病原菌株的基因组 DNA［4］。采
用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物 ITS4
(5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3)和 ITS5 (5
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3) (上海捷瑞生物
工程有限公司合成) ，扩增该菌的 rDNA-ITS 序列。
扩增产物的纯化和序列测定委托北京诺赛生物科技
有限公司进行，所得到的核苷酸序列与 GenBank 中
相关菌株进行同源性比较［5］。
1. 5 不同培养基对菌丝生长的影响
选用 5 种培养基(编号 1 号 ～ 5 号)观察菌丝生
长情况:1 号 PDA 培养基(1000 mL 清水 + 200 g 马
铃薯 + 20 g蔗糖 + 20 g琼脂)、2 号 PDA莪术汁培养
基(1000 m1 清水 + 200 g马铃薯 + 10 g莪术汁 + 20 g
蔗糖 +20 g琼脂、)、3号燕麦培养基(清水 l000 mL +
30 g 燕麦 + 25 g 琼脂)、4 号燕麦马铃薯培养基
(1000 mL清水 + 200 g 马铃薯 + 30 g 燕麦 + 20 g 琼
脂 + 20 g 蔗糖)、5 号玉米培养基(清水 1000 mL +
50 g玉米粉 + 10 g 琼脂) ，清水琼脂培养基做对照。
在病原菌菌落边缘取直径 5 mm的菌饼移植到上述培
养基，25 ℃恒温培养，培养 72 h、96 h、120 h时分
别采用十字交叉法测量菌落直径，并计算平均值。
每个处理重复 3 次。
1. 6 不同温度对菌丝生长和孢子萌发的影响
将直径为 5 mm 的病原菌菌饼移植到 PDA 莪术
汁培养基平板上，在 5、10、15、20、25、30、
35 ℃ 7 个不同温度条件下培养，120 h后测量菌落
直径，每个处理重复 3 次。以 pH为 6 的 1%莪术叶
片汁配制孢子悬浮液(15 × 40 倍视野镜下 20 ～ 25 个
孢子) ，滴于凹玻片上，分别放置于10、15、20、
25、30、35、40 ℃下进行培养，48h 后观察其萌发
率，每处理重复 3 次。
1. 7 PH值对菌丝生长和孢子萌发的影响
用灭菌的 NaOH和 HCl分别调节莪术汁 PDA 培
养基 pH 值至 2、3、4、5、6、7、8、9，并制成平
板，接入 5 mm 的病原菌菌饼，25 ℃恒温培养，接
种后 120h 测量菌落直径，每处理重复 3 次。配置
1%莪术叶片汁孢子液(15 × 40 倍视野镜下 20 ～ 25
个孢子) ，以灭菌的 NaOH 和 HCl 调节上述培养基
pH 值为 l、2、3、4、5、6，7、8、9、10、1l 的梯
度。将孢子液滴于凹玻片上，25 ℃恒温培养，48 h
后观察其萌发率。每处理重复 3 次。
1. 8 湿度对孢子萌发的影响
在干燥器内用不同浓度的硫酸将干燥器分别调
制成相对湿度为 90、80、70、60、50、20、10%的
梯度湿度，将 1%莪术叶片汁孢子悬浮液(15 × 40 倍
视野镜下 20 ～ 25 个孢子)滴于凹玻片上，分别放置
于上述各相对湿度的干燥器中，25 ℃恒温培养，
48 h后观察孢子萌发率，每处理重复 3 次。
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2 结果和分析
2. 1 病害症状
发病植株的症状主要表现在叶片，病原菌主要
侵染植株的中上部叶片，一般先侵染嫩叶。病害发
生早期多从叶尖或叶缘处开始出现淡黄色的水渍状
斑点，病健交界明显，随着病原菌的不断侵染，病
斑逐渐向叶中脉扩展，形成边缘褐色、中间暗褐色
并凹陷的 “V”形大病斑，病斑上可见黑色小颗粒
(分生孢子器) ，后期叶片枯黄、植株死亡。
2. 2 病原菌分离、纯化及致病性测定
将病组织置于 PDA平板，25 ℃恒温培养 3 ～ 4 d
后，所有病组织均长出菌落，对各菌落进行编号、
纯化，其中产孢真菌用单孢分离法对进行纯化，不
产孢真菌采用多次挑取菌落边缘菌丝转皿纯化，共
得到 22 个纯化菌株。在室内将所有菌株离体接种至
健康的广西莪术叶片，保湿培养 5 d 后，仅编号为
v-3 菌株接种后发病，对照未发病。发病叶片表现出
明显的黄褐色病斑，对发病叶片进行再分离，获得
与原分离菌株一致的病原菌。根据柯赫氏法则，V-3
菌株为该病的致病菌株。
2. 3 病原菌的形态特征
菌株 V-3 在 PDA 培养基上生长良好，菌落圆
形，菌丝白色、有隔，疏松绒毛状，2 周后培养基
背面产生黑色球形至不规则形分生孢子器，直径
200 ～500 μm，但挑取分生孢子器在显微镜下难观察
到分生孢子。接种病原菌的莪术叶片，培养 15 d 后
可产生分生孢子器;在显微镜下可观察到两种类型
分生孢子，其中 α 型分生孢子长纺锤形，无色，单
孢，含有 l-2 个油球，大小为(5. 2 ～ 28. 2)μm ×
(1. 5 ～ 7. 1)μm;β型分生孢子无色，线形，一端稍
弯曲，单孢，l-3 个油球，大小为(2. 5 ～ 12. 2)μm ×
(1. 0 ～ 3. 1)μm。根据上述形态特征，认为该病原菌
为拟茎点霉属(Phomopsis sp. )真菌。
2. 4 病原菌核糖体 DNA-ITS序列分析
采用通用引物 ITS1 / ITS4 对 V-3 菌株的 rDNA—
ITS序列进行 PCＲ 扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电
泳检测，得到 1 个大小约为 500 bp 的片段，经序列
测定，确定该片段全长 451 bp，1 ～ 51 bp 为部分
18SrDNA，52 ～ 01 bp 为 ITS1，202 ～ 351 bp 为
5. 8SrDNA，352 ～ 401 bp为 ITS4，402 ～ 451 bp 为部
分 5. 8SrDNA(图 1)。将上述测序结果在 GenBank 中
进行同源性分析，该病原菌株与(Phomopsis sp. )同
源性达 99%。结合形态鉴定确定该病原菌为拟茎点
霉属真菌(Phomopsis sp. )。
ACCTGCGGAGGGATCATTGCTGGAACGCGCTTCGGCGCACCCAGAAA
CCCTTTGTGAACTTATACCTATTGTTGCCTCGGCGCAGGCCGGCCTCTT
CACTGAGGCCCCCTGGAGACAGGGAGCAGCCCGCCGGCGGCCAACCA
AACTCTTGTTTCTACAGTGAATCTCTGAGTACAAAACATAAATGAATC
AAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGC
AGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC
GAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCC
TGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCTGGCTTGGTGATGGGGCAC
TGCTCTCTGACGGGAGCAGGCCCTGAAATCTAGTGGCGAGCTCGCTA
GGACCCCGAGCGTAGTAGTTATATCTCGTTCTGGAAGGCCCTGGCGGT
GCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAAAATTTGACCTCGGATCAGG
TAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA
图 1 病原菌 ITS-rDNA片段序列图
2. 5 培养基对菌丝生长的影响
试验结果(图 2)表明，菌丝在 PDA 培养基(1
号)、莪术汁 PDA 培养基(2 号)燕麦马铃薯培养基
(4 号)上生长 120h 后，菌落平均直径分别为
80. 5mm、88. 5mm、75. 8mm，显著大于其他培养
基，其中 2 号培养基菌株生长最旺盛，菌丝呈白色
絮状且较 1 号培养基的菌丝稍致密，菌落突起。5
号玉米培养基上菌丝生长最差。
图 2 不同培养基对菌丝生长的影响
2. 6 温度对菌丝生长和孢子萌发的影响
图 3-a显示:该菌丝生长温度范围为 10 ℃ ～
35 ℃，最适宜温度范围为 20 ℃ ～30 ℃，以 25 ℃条
件下菌丝生长最好，平均直径为 62. 0mm，显著大于
其他温度条件下培养的菌落直径，在 5 ℃、40 ℃下
不能生长。图 3-b显示:分生孢子在 10 ℃ ～35 ℃范
围内均能萌发，20 ℃ ～ 30 ℃适宜孢子萌发，其中
25 ℃ 条件下，萌发率最高，为 80. 2%。，5 ℃、
40 ℃条件下不能萌发。
2. 7 不同 pH值对菌丝生长和孢子萌发的影响
图 4-a 结果表明:菌丝在 pH 值 3 ～ 9 条件下能
生长，适宜的 pH值范围为 4 ～ 7，pH 值为 5 条件下
生长最好，pH 值分别为 1、2、10、11 条件下不能
生长。图 4-b结果表明:分生孢子在 pH值 3 ～ 10 的
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图 3-a 不同温度对菌丝生长的影响
图 3-b 不同温度对孢子萌发的影响
条件下均可萌发，适宜 pH 值范围 4 ～ 7，pH 值为 5
条件下萌发最好，pH 值分别为 1、2、11 条件下无
法萌发。
图 4-a 不同 pH值对菌丝生长的影响
图 4-b 不同 pH值对孢子萌发的影响
2. 8 湿度对孢子萌发的影响
图 5 显示，孢子在相对湿度(ＲH)为 50%-100%
条件下均可萌发，ＲH 70% ～90%适宜萌发，ＲH80%
萌发最好，(ＲH)低于 50%，孢子不能萌发。
3 小结与讨论
拟茎点霉属真菌是一类重要的植物病原真菌，
大豆拟茎点种腐病菌能引起多种植物病害，目前
报道的寄主植物除大豆外，还为害三叶草、绿
豆、豌豆、花生、大蒜、洋葱、辣椒、番茄、三
图 5 不同湿度对孢子萌发的影响
裂叶豚草、苍耳、小地锦草、皱叶酸模等［6］。笔
者在传统形态学鉴定的基础上，通过对广西莪术
叶斑病病原菌的 rDNA-ITS 进行分析比对，从分子
生物学水平上进一步明确拟茎点霉属真菌—大豆
拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla)为广西莪术
叶斑病的病原真菌，发现该致病菌侵染广西莪术
为首次报道。
通过对广西莪术叶斑病病原菌的生物学特性研
究发现，该病原菌对营养的要求不严格，在多种培
养基上均能生长良好，以 PDA、莪术汁 PDA 培养基
最为适合;菌丝生长及孢子萌发适宜温度为 20 ～
30 ℃，偏弱酸性条件利于孢子萌发;孢子萌发需要
一定的湿度，ＲH ＜ 50%不萌发，ＲH 为 80%时孢子
萌发率最高。可见，该病原菌喜中温、潮湿、偏弱
酸性环境，在田间控制病害时应考虑病原菌的生物
学特性进行。同时，关于该病原菌对碳氮源的利用
等生物学特性，以及该病害的田间防治技术还有待
进一步研究。
参考文献
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(收稿日期 2015-03-09)
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