全 文 ：书收稿日期:2012-09-12; 修订日期:2013-01-06
基金项目:江西省卫生厅科技计划项目( No． 20111077) ;
赣南医学院院级课题( No． YB2009008)
作者简介:刘 海( 1983-) ，男( 汉族) ，江西湖口人，现任赣南医学院中级
工程师，硕士学位，主要从事药物制剂研究工作．
* 通讯作者简介:杨建琼( 1979-) ，女( 汉族) ，江西兴国人，现任赣南医学
院讲师，硕士学位，主要从事天然产物活性成分研究工作．
吉祥草提取物对人结肠癌
HT － 29 细胞体外抑制作用的研究
刘 海1，杨建琼2* ，熊 亮1，马华谋2，徐小军2
(1．赣南医学院，江西 赣州 341000; 2．赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000)
摘要:目的 研究吉祥草提取物对人结肠癌 HT － 29 细胞的体外增殖抑制作用和诱导凋亡作用。方法 MTT 法筛选吉祥
草乙醇提取物及其不同溶剂萃取部分对 HT － 29 细胞抑制作用的活性部位;通过凋亡染色观察细胞凋亡形态;应用流式
细胞术 Annexin Ⅴ － FITC / PI双标记法检测细胞凋亡率。结果 吉祥草正丁醇萃取物对 HT － 29 细胞的抑制作用较强，且
呈量效和时效关系，作用 48 h时 IC50值为 66． 59 mg·L
－1，凋亡染色显示有典型的凋亡形态出现，流式细胞仪检测其能诱
导 HT － 29 细胞凋亡并呈剂量依赖关系。结论 吉祥草正丁醇萃取物能抑制人结肠癌 HT － 29 细胞增殖并诱导细胞凋亡。
关键词:吉祥草; 抗肿瘤活性; 细胞凋亡; 人结肠癌 HT － 29 细胞
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 05． 033
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:B 文章编号:1008-0805( 2013) 05-1103-02
结肠癌是消化道中最常见的恶性肿瘤之一。其常规治疗方
法中的化疗、放疗毒副作用大，许多患者愈后生存期短。中药或
天然药物毒副作用小、具有悠久的民间应用历史，已成功开发的
药物有紫杉醇、长春碱类、喜树碱类等［1］。因此从中草药中开发
高效、低毒的抗结肠癌药物具有重要意义。
吉祥草 Ｒeineckia carnea (Andr．)kunth．为百合科吉祥草属植
物吉祥草的全草［2］。其植株含有甾体类等化学成分［3 ～ 6］。药理
研究表明吉祥草具有止咳化痰、抗炎［7］、杀灭钉螺作用等［8］，但
对其抗肿瘤方面的生物活性研究尚未见报道。有研究报道百合
科植物中的一些甾体皂苷类化合物具有很强的抗肿瘤活性［9］。
本研究以富含此类成分的吉祥草为研究对象，采用人结肠癌 HT
－ 29 细胞作为体外抗肿瘤实验模型，观察吉祥草提取物对 HT －
29 细胞体外抑制作用，并探讨中药吉祥草对人结肠癌细胞的作
用机制。
1 仪器与材料
1． 1 仪器 连续光谱多功能酶标仪(Varioskan Flash ，美国 Ther-
mo Fisher) ;智能型倒置荧光相差显微镜(IX71，日本 Olympus) ;
流式细胞仪(FACS Calibur，美国 BD)。
1． 2 材料 吉祥草采集于贵州清镇，经贵阳中医学院陈德媛教授
鉴定为百合科吉祥草 Ｒeineckea carnea (And．)Kunth;DMEM 培
养基和胎牛血清(美国 Gibco公司) ;细胞凋亡荧光 Hoechst 33258
检测试剂盒(南京凯基生物科技发展技术有限公司) ;Annexin V
－ FITC Apoptosis Detection kit(美国 BD 公司) ;四甲基偶氮唑盐
(MTT，Sigma公司 ) ;人结肠癌 HT － 29 细胞(赣南医学院科研中
心保藏提供) ;其它试剂均为分析纯。
2 方法
2． 1 提取与分离方法 吉祥草干燥全草 10kg，粉碎，用 95%的工
业乙醇加热回流提取 3 次，每次 3 h，滤过，合并滤液，减压浓缩，
得乙醇浸膏。在乙醇浸膏中加入适量蒸馏水制成混悬液，然后依
次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别合并萃取液，减压浓缩，
分别得到石油醚浸膏(40 g)、乙酸乙酯浸膏(340 g)和正丁醇浸
膏(1． 20 kg )。
2． 2 吉祥草各提取部位供试液溶液制备 分别称取已干燥至恒
重的乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇浸膏 0． 5 g，精密称定，用二
甲基亚砜(DMSO)溶解于 10ml 容量瓶中，配制成质量浓度为 50
g·L －1的各提取部位供试液，4℃冰箱保存，临用前用培养液稀释
分别配制成不同浓度各提取部位供试液(乙醇提取液及正丁醇
提取液:25，50，100，200，400mg·L －1;石油醚:100，200，400，800，
1600 mg · L －1;乙 酸 乙 酯 提 取 液:50，100，200，400，800
mg·L －1) ，并使各提取部位所含 DMSO的体积分数小于 0． 1%。
2． 3 细胞培养 在 5 % CO2、37℃条件下，用含 10%胎牛血清的
DMEM培养液传代培养 HT － 29 细胞实验用细胞均处于对数生
长期。
2． 4 MTT法测定不同部位对 HT － 29 细胞生长的抑制作用 取
对数生长期 HT － 29 细胞以 1 × 104 /孔接种于 96 孔板培养，常规
条件培养 24 h后，设组并分别加入经培养基稀释的不同浓度各
提取部位供试液 200 μl，同时设置对照组孔(加入等体积的培养
液) ，各组均设 6 个复孔，置 5% CO2、37℃孵箱培养，在指定时间
(12，24，48，72 h)于每孔加入 MTT(5 g·L －1)20μl，孵育 4 h 后，
小心吸弃孔内上清液，每孔加入 DMSO 150 μl，振荡待蓝色晶体
溶解后，酶标仪于 570 nm(参考波长 630 nm)处检测每孔的吸光
度(A)值，确定药物对肿瘤细胞的抑制率。细胞的生长抑制率
(%)=［1 －实验组(A570nm － A630nm)/对照组(A570nm － A630nm) ］×
100%。采用 lgC －抑制率回归分析法计算半数抑制浓度(IC50)。
2． 5 正丁醇提取物对 HT － 29 细胞凋亡形态的影响 取对数生
长期 HT － 29 细胞以 5 × 104 /孔接种于 12 孔培养板，常规培养 24
h后，设组并加入经培养基稀释成 200 mg·L －1的正丁醇提取物
1 ml，同时设置对照组孔(加入等体积的培养液) ，置 5% CO2、
37℃孵箱培养 24 h后吸出培养液，用冷 Buffer A 洗涤细胞两次，
加入 1 ml 的 4%甲醛溶液 4℃固定细胞 10 min，吸弃固定液，用
Buffer A洗涤细胞两次，每孔滴加 100μl Hoechst 33258 工作液
(取试剂盒中 Hoechst 33258 原液用蒸馏水稀释 10 倍) ，室温染色
10 min，水冲净晾干，于荧光显微镜下观察凋亡形态。
2． 6 Annexin Ⅴ － FITC / PI双标记法检测正丁醇提取物对 HT －
29细胞的凋亡率 将 HT － 29 细胞按 2 × 105 /ml、每孔 2 ml 接种
于 6 孔板中培养，24 h后分别加入正丁醇提取物使其终浓度分别
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 5 时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 5 期
书为 25，50，100，200，400mg·L －1，对照组加入等量的培养液，继续
培养 24 h，0． 25%胰酶消化并收集细胞，预冷 D － Hanks 洗涤，重
悬于 binding buffer(10 mmol /L HEPES，pH7． 4，140 mmol /L NaCl，
2． 5 mmol /L CaCl2) ，细胞浓度 1 × 10
6 cells /ml。取 100 μl细胞悬
液，加 5 μl Annexin Ⅴ － FITC和 5 μl PI(50 μg /ml) ，于室温黑暗
中孵育 15 min，加入 400 μl binding buffer，轻轻混匀，1 h 内上流
式细胞仪检测。计算凋亡细胞数占总细胞数的百分比。凋亡细
胞为 Annexin V阳性细胞(AV + /PI －象限)。
3 结果
3． 1 各提取部位对 HT － 29 细胞作用 48 h 后的增殖抑制作用
药物用作用 48 h后，正丁醇萃取部位对 HT － 29 细胞的增殖抑制
作用最强，其 IC50为 66． 59 mg·L
－ 1;乙醇提取物次之，其 IC50为
101． 43 mg·L －1;乙酸乙酯部位抑制活性较弱(见表 1)。因此，
本试验以增殖抑制作用最强的正丁醇萃取部位进行了后续实验:
时效 －量效关系、细胞凋亡形态的观察以及细胞凋亡率的检测，
以考察正丁醇萃取部位对 HT － 29 细胞的增殖抑制作用是否与
细胞凋亡有关。见表 1。
表 1 各提取部位对 HT －29 细胞作用 48h后的增殖抑制作用(珋x ± s)
组别
浓度
/mg·L －1
抑制率
(%)
IC50
/mg·L －1
乙醇组 25 7． 08 ± 0． 36 101． 43
50 21． 86 ± 1． 22
100 51． 50 ± 2． 06
200 79． 56 ± 3． 58
400 90． 91 ± 3． 18
石油醚组 100 5． 16 ± 0． 26 ＞ 1000
200 10． 79 ± 0． 46
400 19． 02 ± 1． 06
800 23． 12 ± 1． 04
1600 36． 39 ± 2． 01
乙酸乙酯组 50 2． 45 ± 0． 15 741． 21
100 9． 32 ± 0． 42
200 15． 23 ± 0． 65
400 30． 31 ± 1． 33
800 51． 58 ± 1． 19
正丁醇组 25 10． 95 ± 0． 51 66． 59
50 36． 90 ± 1． 33
100 79． 33 ± 3． 25
200 90． 24 ± 2． 89
400 93． 50 ± 2． 24
3． 2 正丁醇萃取物对 HT － 29 细胞增殖抑制的剂量依赖性和时
间依赖性 本实验选择了 5 个浓度梯度的正丁醇提取物(25，50，
100，200，400 mg·L －1)作用于 HT － 29 细胞 12，24，48，72 h。结
果发现正丁醇提取物对 HT － 29 细胞的抑制活性随着浓度增加
及作用时间的延长而增加，表现为剂量依赖性和时间依赖性(见
图 1)。
图 1 正丁醇萃取物对 HT －29 细胞的增殖抑制
3． 3 正丁醇萃取物对 HT － 29 细胞凋亡形态的影响 经 Hoechst
33258 凋亡染色荧光显微镜下观察可见，正常对照组细胞核呈微
弱、均匀荧光，胞质舒展;实验组细胞生长疏散，核固缩，呈致密浓
染或呈碎块状致密浓染亮蓝色荧光，为典型凋亡细胞表现
(图 2)。
图 2 正丁醇提取物作用 24h后 HT －29 细胞形态变化(200 ×)
3． 4 流式细胞仪检测正丁醇萃取物对 HT － 29 细胞凋亡率的影
响 流式细胞仪 Annexin V － PI双标法分析显示(见图 3 ～ 4) :不
同浓度的正丁醇提取物作用 HT － 29 细胞 24 h后，随正丁醇浓度
加大，细胞凋亡发生率明显增高，与对照组相比有统计学意义
(P ＜ 0． 05)。
图 3 正丁醇萃取物对 HT －29 细胞凋亡率的影响
图 4 正丁醇萃取物诱导 HT －29 细胞凋亡率统计图
4 讨论
本实验以人结肠癌 HT － 29 细胞作为体外抗肿瘤实验模型，
通过 MTT法筛选吉祥草提取物对 HT － 29 细胞体外抗癌作用的
活性部位，结果发现正丁醇萃取物的抑制作用较强且呈量效和时
效关系，作用 48 h时 IC50值为 66． 59 mg·L
－1。细胞凋亡是细胞
死亡的一种主要形式，与许多生理和病理过程的发生和发展有密
切的关系，是一种重要的生命现象，通过 Hoechst 33258 荧光染色
我们发现，正丁醇萃取物与 HT － 29 细胞共培养 24 h 后，细胞核
呈致密浓染的固缩形式或碎块状致密亮监色荧光，颜色有点发
白，为典型凋亡细胞表现。
流式细胞术 Annexin Ⅴ － FITC / PI 双标记法是目前检测细
胞凋亡较为理想的方法，细胞凋亡早期［10］，磷脂酰丝氨酸(PS)
暴露于细胞膜外，钙依赖性的磷脂结合蛋白 Annexin Ⅴ对 PS 亲
和性较高，用作探针检测细胞膜表面的 PS位置，可特异结合标记
的 FITC荧光素表现为 Annexin +高染，保持了完整的细胞膜而使
荧光染料 PI不能进入细胞质呈 PI －低染，因此，在流式细胞仪的
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时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 5 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 5
书双变量散点图上，凋亡细胞为 Annexin + /PI － 象限，正常细胞为
Annexin － /PI －均低染象限，Annexin Ⅴ － FITC / PI 双标记法实验
表明吉祥草正丁醇萃取物能够抑制 HT － 29 细胞增殖并诱导 HT
－ 29 细胞凋亡，但从吉祥草正丁醇萃取部位分离出具有抗肿瘤
活性的单体化合物及其诱导肿瘤细胞凋亡的机制有待于进一步
研究，以发现新的抗肿瘤活性先导化合物，对推动和加速治疗肿
瘤疾病的新型药物的研制与开发具有重要意义。
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收稿日期:2012-09-06; 修订日期:2012-12-31
基金项目:“教育部新世纪优秀人才支持计划人选”资助项目( 教技函 2010 － 14 号，NCET － 10 － 0093 ) ; 广西自然科学基金项目 ( 桂科基 0832006，
2011GXNSFF018006)
作者简介:程允相( 1988-) ，女( 汉族) ，河南驻马店人，现任广西中医药大学药学院中药师，硕士学位，主要从事心血管药理学方面的研究工作．
* 通讯作者简介:杨秀芬( 1969-) ，男( 汉族) ，广西凌云人，现任广西中医药大学教授，硕士研究生导师，博士学位，主要从事药物( 中药) 心血管药理学
方面的研究工作．
桂郁金水提物收缩家兔主动脉条的机制研究
程允相，石卫州，樊星花，杨秀芬*
(广西中医药大学药学院，广西 南宁 530001)
摘要:目的 研究桂郁金水煎液对离体家兔胸主动脉条的作用，并探讨其作用机制。方法 采用家兔离体胸主动脉环灌流
模型，制备离体动脉条标本，将离体标本随机分为 7 组: 去内皮组、内皮完整组、溶媒对照组、桂郁金对照组、氯沙坦( 10 －6
mol /L) 组、普萘洛尔( 10 －6mol /L) 组、维拉帕米( 10 －6mol /L) 组。去内皮组和内皮完整组分别累积加入桂郁金水煎液使终
浓度分别为 5． 58，11． 16，22． 32，44． 64，89． 28 mg /ml，溶媒对照组累积加入等量的纯净水，桂郁金对照组加入桂郁金水煎
液使终浓度为 44． 64 mg /ml，氯沙坦组、普萘洛尔组、维拉帕米组分别用相应的阻断剂孵育 10 min后加入桂郁金水煎液使
终浓度为 44． 64mg /ml，观察桂郁金水煎液对离体家兔胸主动脉条收缩张力的作用，以及各阻断剂对此作用的影响。结果
桂郁金水煎液达到一定浓度时可明显收缩家兔胸主动脉条，去内皮组与内皮完整组都呈现明显的量效关系，但去内皮组
与内皮完整组组间差异不显著; 药物溶媒则对动脉条张力变化无明显影响;与桂郁金对照组相比，氯沙坦组和维拉帕米
组均有差异显著性( P ＜ 0． 01) ，普萘洛尔组则无差异显著性( P ＞ 0． 05) 。结论 桂郁金水煎液对家兔胸主动脉条有非内
皮依赖性收缩作用，其作用机制可能与 AT受体、Ca2 +通道有关，则与 β受体可能无关。
关键词:桂郁金; 离体胸主动脉; 收缩
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 05． 034
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2013) 05-1105-02
The Study of Mechanism of Guiyujin Water Extract on Aorta Contraction in Ｒabbits
CHENG Yun-xiang，SHI Wei-zhou，FAN Xing-hua，YANG Xiu-fen*
( College of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning Guangxi，530001，China)
Abstract: Objective To study the mechanism of Guiyujin water extract on aorta contraction in rabbits in vitro．Methods Use the
thoracic aorta ring perfusion model in rabbits，and divided them into seven groups randomly: the endothelium removal group，the
endothelium group，the solvent control group，the GYJ control group，the Losartan group，the Pro group and the Ver group． For the
endothelium removal and endothelium groups，GYJ were added accumulately every 15 minutes andmade the final concentrations re-
spectively at 5． 58，11． 16，22． 32，44． 64，89． 28 mg /ml，for the solvent control group，the same amount of pure water was added;
for the GYJ control，losartan，propranolol，verapamil groups，used with corresponding blockers to incubate for 10 minutes ( except
GYJ control group) ，then joined GYJ to make the final concentration at 44． 64 mg /ml，observed the changes of vascular tension．
Ｒesults GYJ could obviously contract thoracic aorta rings at a certain concentration，the endothelium removal group and the endo-
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 5 时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 5 期