全 文 ：收稿日期:2010-08-12; 修订日期:2011-01-05
基金项目:吉林省教育厅科研项目(No． 20050402 － 5)
作者简介:何秀霞(1975-) ，女(汉族) ，内蒙古乌海人，现任长春理工大学
生命科学技术学院副教授，硕士研究生导师，博士学位，主要从事生物化
学与分子生物学研究工作．
独角莲提取液体外抗宫颈癌 Hela细胞增殖
和诱导凋亡的研究
何秀霞，张春兰，何乃彦，于源华，张淑华，葛淑敏
(长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130022)
摘要:目的 探讨独角莲对宫颈癌的治疗作用，揭示其抑癌机理。方法 利用独角莲根茎水提物，作用宫颈癌 Hela 细胞
株，通过噻唑氮蓝比色实验(MTT)、流式细胞仪(FCM)和 Western blot 分析，研究独角莲对细胞增殖和细胞调亡的影响。
结果 独角莲对 Hela的增殖抑制率为 65． 08%。并能引起凋亡细胞的增加，成剂量依赖性，作用 72 h 后的凋亡率最高达
24． 5%。Western blot检测 Hela细胞经不同浓度的块茎提取液处理 48 h后，caspase － 3 蛋白表达逐渐增强。独角莲抗肿
瘤作用可能与上调 Hela细胞中 caspase － 3 蛋白的表达有关。结论 独角莲是一种在宫颈癌治疗上有前景的中草药。
关键词:独角莲; 宫颈癌; 细胞增殖; 细胞凋亡
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2011． 07． 032
中图分类号:R285． 5 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2011)07-1620-02
宫颈癌是妇科三大恶性肿瘤之一，在我国的发病率较高［1］。
其治疗手段较为单一，且副作用较大，受到一定限制，因此筛选和
研究更为有效的天然低毒治疗药物对宫颈癌的治疗具有重要意
义［2］。独角莲在我国传统中医治疗中广泛用于治疗多种恶性肿
瘤疾病［3］，有较好的临床疗效，同时动物模型实验也显示独角莲
可明显抑制肿瘤生长［4］。近年来人们对独角莲的抑癌作用研究
逐步增多，但至今未能揭示其药效作用机制［5］。本实验采用噻
唑氮蓝比色法，并借助流式细胞仪及 Western blot分析手段，对独
角莲抑癌作用的细胞学机制作了初步的研究。
1 材料
人宫颈癌细胞(Hela)由本实验室保存。MTT、DMSO 等购自
美国 SIGMA公司;5FU(上海旭东海普药业有限公司) ;Annexin
V － FITC /PI凋亡检测试剂盒(Bender Medsystem 公司)。CO2 培
养箱(美国 Shellab) ，荧光倒置显微镜 Nikon ECLIPSE TE2000 －
E，酶标仪(DNM －9602 普朗新酶标仪)。
2 方法
2． 1 独角莲块茎提取液的制备 以独角莲块茎粗粉为原料，按照
10∶ 1 比例加入蒸馏水，超声波萃取 20 min 间隔 1 min 再重复 1
次，真空干燥后得干浸膏用蒸馏水稀释至 1 mg /ml备用。
2． 2 细胞培养 宫颈癌 Hela 细胞培养液 DMEM中加入含 10 %
热灭活小牛血清培养液，置 37 ℃、5 % CO2 及充分饱和湿度的培
养箱内进行培养，选对数生长期的细胞用于实验。
2． 3 药效的 MTT法测定 参考文献［6］的 MTT 方法略有改动。
调整细胞浓度至 4 ～ 6 × 104 /ml，接种于 96 孔板中，每孔 100 μl。
每组设 4 个复孔，分别设:调零组(培养液)、空白对照组(培养液
+药物)、正常对照组(培养液 +细胞)、实验组［细胞 +不同浓度
独角莲块茎提取液(62． 5，125，250，500，1 000，2 000，4 000 μg /
ml) ］和阳性对照组(5 Fu浓度为 20 μg /ml)。37℃培养 72 h，测
定 MTT溶解后的吸光度波长 492 nm。重复 3 次，计算细胞生长
抑制率:
细胞生长抑制率(%)=(1 －加药组平均 OD 值 /正常对照
组平均 OD值)× 100%。药效对照如表 1 所示。
表 1 MTT法测定药效对照
试剂
细胞
溶液 V /μl
不完全
培养液
V /μl
块茎提取
液溶液
V /μl
5Fu
注射液
V /μl
小牛
血清
V /μl
5 mg /ml
MTT
DMSO
V /μl
调零 0 200 0 0 20 20 150
空白对照 0 100 100 0 20 20 150
阴性对照 100 100 0 0 20 20 150
实验 100 0 100 0 20 20 150
阳性对照 100 0 0 100 20 20 150
绘制细胞对样品的药敏性曲线，以对数样品浓度为横坐标，
细胞生长抑制率为纵坐标，可求出细胞生长抑制率为 50%时的
药物浓度，即 IC50。
2． 4 细胞凋亡检测 参考《现代分子生物学实验技术》的 FCM［7］
略有改动，将生长良好的细胞分为正常细胞对照组和实验组。实
验组 a、b、c、d中分别加入质量浓度为 0． 5，1． 0，1． 5，2． 0 g /L的独
角莲块茎提取液，对照组不加。AnnexinV FITC /PI 双标染色，流
式细胞仪测定 Hela细胞的凋亡率。
2． 5 Western blot检测 caspase － 3 蛋白表达水平 取对数生长期
的 Hela细胞以 1 × 106 密度接种于 6 孔细胞培养板，加入不同浓
度块茎提取液(0，0． 5，1． 0，1． 5，2． 0 g /L)混合物，并设对照(普通
培养基) ，培养 48 h，用 Walterson 细胞裂解液提取细胞质及细胞
核蛋白。对蛋白样品进行 Western blot分析［8］。
2． 6 统计学方法 实验数据均采用 SPSS13． 0 统计软件分析，采
用单因素方差分析进行比较，以 珋x ± s来表示，组间采用 t检验，P
＜ 0． 05 为统计学差异有显著性意义。
3 结果
3． 1 独角莲块茎提取液体外抑癌作用 独角莲块茎提取液浓度
在 62． 5 ～ 4 000 μg /ml之间，对 Hela细胞的生长具有一定的抑制
作用，当浓度为 2 000 μg /ml，细胞的生长抑制率达到最高
65． 08%(图 1)。由图 1 可知当细胞生长抑制率为 50%时药效浓
度约为 500 μg /ml，即 IC50为 500 μg /ml。
图 1 独角莲块茎提取液对 Hela细胞的生长抑制率
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时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 7 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL． 22 NO． 7
3． 2 细胞凋亡检测 不同浓度的独角莲块茎提取液作用 HeLa
细胞 24，48，72 h 后，随独角莲块茎提取液浓度加大和作用时间
延长，凋亡率明显增高，与对照组相比具有显著差异性结果见图
2。
a －正常细胞 b －加入独角莲块茎提取液 72 h后
图 2 细胞仪检测的散点图
图 3 AnnexinV － FITC /PI双标法检测独角莲
块茎提取液对 HeLa细胞凋亡的影响
独角莲诱导人宫颈癌 HeLa 细胞凋亡具有明显的药物浓度
依赖性，在同一时间段，随药物浓度的增加细胞凋亡率增加，两者
呈正相关(P ＜ 0． 01)。同一浓度不同时间段(24，48，72 h)细胞
的凋亡率逐渐增加。2 g /L 浓度独角莲作用 72 h 后的凋亡率为
24． 5%结果见图 3。
3． 3 Western blot 分析 caspase － 3 表达情况 Western blot结果显
示 HeLa细胞经不同浓度的独角莲块茎提取液处理 48 h，caspase
－ 3 蛋白表达逐渐增强(图 4) ，提示 caspase － 3 作为细胞凋亡通
路的重要组成部分，其活化可能参与了独角莲诱导的 HeLa 细胞
的凋亡。也证明了独角莲具有抑制癌细胞增殖的能力。
1 ～ 5 分别为:对照组 0 g /L，实验组 a 0． 5 g /L，
实验组 b 1． 0 g /L，实验组 c 1． 5 g /L，实验组 d 2． 0 g /L
图 4 不同浓度独角莲块茎提取液作用于
HeLa细胞 48 h的 caspase － 3 蛋白表达
4 讨论
HeLa细胞体外培养每 3 天可以传代 1 次。细胞生长时间过
长或过短都不能使大部分细胞处于对数生长期，影响细胞的实验
效果。本研究表明细胞密度为 6 × 104 /ml 时，独角莲浓度为
2 000 μg /ml，对 Hela细胞的增殖抑制率 72 h达 65． 08%，说明独
角莲对 Hela细胞增殖具有显著抑制作用，是一种极具开发潜力
的抗癌中药。Hela细胞在相同药物浓度下(2． 0 g /L) ，随作用时
间延长，细胞凋亡率逐步加强，72 h后凋亡率为 24． 5%。细胞具
有极其复杂的生命活动，细胞凋亡途径是一个涉及细胞生长增殖
和受到外界刺激后死亡一个重要的组成部分［9］。独角莲能引起
凋亡细胞的增加，并成剂量依赖性。
目前发现，细胞凋亡有 3 条不同的通路(线粒体通路、死亡受
体通路和内质网通路) ，但其最终主要通过活化半胱氨酸蛋白酶
(caspase)导致细胞凋亡，其中 caspase － 3 是各条凋亡通路的枢
纽，各种凋亡刺激激活 caspase后，最终激活 caspase － 3 而诱导细
胞凋亡。正常情况下，胞质中的 caspase － 3 以无活性的酶原(pro
－ caspase － 3)形式存在，当细胞发生凋亡时酶原将裂解而被活
化。活化的 caspase － 3 能够降解多种底物，导致染色质凝聚、核
酸激活和细胞骨架断裂崩解等一系列的级联分子反应，最终导致
细胞凋亡［10］。Western blot 结果显示独角莲抗肿瘤作用可能与
上调 Hela细胞中 caspase － 3 蛋白的表达有关。
本实验从细胞生物学水平证实了独角莲块茎提取液对宫颈
癌 HeLa细胞系的体外杀伤作用，其影响细胞凋亡的机制还有待
进一步深入研究。
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