全 文 ：2014·24 /
臭菘根部分离的一种酪氨酸酶抑制剂的研究
毛欣欣，张智文 *，李长田
（吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118）
摘要：目的：对臭菘根部中分离的一种化学成分的酪氨酸酶抑制活性进行研究。方法：利用色谱柱分离纯化再根据理化性质和波谱技
术对化合物进行结果鉴定，采用酶动力学方面对臭菘根部分离得到的化合物 3，5- 二甲氧基 -4-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸其酪氨
酸酶抑制研究。结果：从臭菘植物根部的甲醇部分分离的化合物 3，5- 二甲氧基 -4-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸，对单酚酶（IC50=0.4
毫摩尔 / 升）和二酚酶（IC50=0.25毫摩尔 / 升）都具有抑制作用。结论：从臭菘植物根部首次分离得到的化合物 3，5- 二甲氧基
-4-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸为酪氨酸酶的竞争型可逆性抑制剂，抑制常数（KI）为 3.0997毫摩尔 / 升。
关键词：臭菘；酪氨酸酶；抑制作用；动力学；3，5- 二甲氧基 -4-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸
中图分类号：TQ464.8 文献标识码：A DOI编号：10.14025/j.cnki.jlny.2014.24.0017
实验研究
Shiyanyanjiu
臭菘为天南星科（Araceae）臭菘属(Symplocarpus)多年生宿
根草本植物，分布于东西伯利亚鄂霍茨克、中国东北部、北美
东部、朝鲜半岛和日本，在中国主要分布于吉林省、黑龙江和
乌苏里江流域以及松花江流域[1-4]。
臭菘生长于海拔 300 米以下地区，常生于湿草甸、沼泽
或沼泽落叶林中、潮湿针叶林及混交林下，河渠的水流中也
有生长。据《中华本草》记载在药理方面臭菘的根煎剂具有镇
静、解痉和祛痰作用，解表止咳，化痰平喘，主治发烧头痛、
气管炎咳喘等。臭菘叶主治风湿痹痛，有祛风除湿的功效。臭
菘种子亦有镇咳、祛痰、平喘、强心的药效，主治气管炎咳喘
[5]。目前对臭菘的化学成分及其活性的研究报道很少，本实
验从臭菘根部的甲醇部分得到 1 个化合物，经波谱分析，鉴
定其为 3 5- 二甲氧基 -4-O-B-D- 吡喃葡萄糖基桂皮酸
（为该植物首次分离得到），由于其是肉桂酸类衍生物亦为羧
基化合物，据文献报道此类化合物有对酪氨酸酶的抑制作用
[6-8]，而作为酪氨酸酶的抑制剂，可作于防止食品褐变的添加
剂、化妆品美白的功能成分以及农业害虫的调节剂等[9，10]。本
文从酶动力学角度分析了 3，5- 二甲氧基 -4-O-B-D- 吡
喃葡萄糖基桂皮酸的酪氨酸酶抑制活性，为臭菘植物作为天
然产物的开发与利用提供参考。
1 实验方法
1.1 仪器与材料
Varian Inova500 型核磁共振仪，LCQ 型质谱仪，ZF-1 型
三用紫外分析仪，凝胶 Sephadex LH-20，RE-52AA 旋转蒸发
仪，TU-1810 紫外分光光度计，GB204 电子分析天平，GF254
硅胶板、柱层析用硅胶均为青岛海洋化工厂所产，L- 酪氨酸
（L-Tyrosine）、左旋多巴（L-DOPA）、酪氨酸酶均为 SIGMA
公司产品，其他药品、试剂均为分析纯。
臭菘[Symplocarpus foetidus (Linn.) Salisb.]采于吉林省临江
市老三队地区 （N:41.56.596°、41.94452°E:126.81072°、
126.8019°H:370m、573m 正西坡）。经吉林农业大学园艺学
院胡全德教授和中药材学院李长田副教授鉴定，所采植物样
品为臭菘属（Symplocarpus）臭菘（S. foetidus）植物。
1.2 提取与分离
将臭菘晾干，取干根 2 公斤，用 95%工业酒精 60℃回流
提取 3 次，合并提取液，解压浓缩至浸膏无溶剂味，加水悬
浮，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯各萃取 3 次，将萃取
后的剩余部分用硅胶色谱柱、氯仿—甲醇系统进行梯度洗
脱，又经凝胶纯化和重结晶等分离手段得 193.23 毫克白色晶
体化合物。
1.3 结构鉴定
化合物为白色结晶（甲醇），1H NMR （300 MHz, DM
SO）δ 12.29 （s，1H），7.51 （d，J = 15.9 Hz，1H），7.03（s，
2H），6.53（d，J = 15.9 Hz，1H），5.03（d，J = 7.4 Hz，3H），
4.95（d，J = 17.3 Hz，2H），4.43（d，J = 25.4 Hz，1H），4.31（t，
J = 5.3 Hz，1H），3.62 - 3.50（m，1H），3.40（dd，J = 11.4，
5.7 Hz，2H），3.19（s，2H），3.10（dd，J = 25.3，8.7 Hz，3H）。
13C NMR （101 MHz，DMSO）δ 167.55（C-1），118.36
（C-2），143.87 （C-3），129.59 （C-1），106.65（C-2，C-6），
152.68 （C-3，C-5），136.23 （C-4），102.23（C-1），77.20
（C-5），76.55 （C-3），74.13 （C-2），69.91（C-4），60.84
（C-6），56.45（C-OCH3×2），以上波谱数据与文献报道基
本一致[1]，故鉴定此化合物为 3，5- 二甲氧基 -4-O-B-D-
吡喃葡萄糖基桂皮酸。
1.4 化合物对酪氨酸酶的抑制测定
以 1.2 中分离得到的 3，5- 二甲氧基 -4-O-B-D- 吡
喃葡萄糖基桂皮酸（以下称为抑制剂）作为待测样品，测定其
对酪氨酸酶的抑制作用。
酪氨酸酶的单酚酶活性测定：将测单酚酶酶活力所用
底物 L-Tyrosine 置于恒温水浴锅中 30℃水浴 10 分钟后，向
各比色皿中加入 2.8 毫升，继而取配好的不同浓度（抑制剂
浓度分别为 0.75、0.5、0.4、0.3 和 0.2 毫摩尔 / 升）的待测抑
制剂各 0.1 毫升于各比色皿中，对照皿中加入不含抑制剂的
DMSO 0.1 毫升，最后分别加入酪氨酸酶溶液 0.1 毫升（酪氨
酸酶终浓度为 13.37 微克 / 毫升）快速混匀，紫外分光光度计
475 纳米波长下测定吸光度（测定时温度保持在 30℃），每分
钟读取记录一次数据，连续测 7 分钟。
酪氨酸酶的二酚酶活性测定：测定二酚酶活力方法同上
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所述，但所用底物 L-DOPA 缓冲液，酪氨酸酶终浓度为 6.67
毫克 / 毫升。
抑制剂对酪氨酸酶的抑制可逆性测定：在测定活力的体
系中，L-DOPA 为固定底物，其浓度为 0.5 毫摩尔 / 升，向各
比色皿中加入不同浓度的抑制剂（0.5、0.3、0.1 和 0.05 毫摩
尔 / 升），并改变所加入酶的浓度（1.66、2.66、4.44、6.66、8.88
和 13.37 毫摩尔 / 升），测吸光度。
抑制剂对酪氨酸酶二酚酶活性抑制类型及抑制常数测
定：将不同浓度的抑制剂（0.75、0.4、0.2 和 0.05 毫摩尔 / 升）
以及不含抑制剂的等体积 DMSO 加入含有不同浓度
L-DOPA 底物（0.5、 25、0.33、0.66 和 1.0 毫摩尔 / 升）的测
酶活体系中，测吸光度。
2 结果与分析
如图 1所示，不同浓度的抑制剂对酪氨酸酶氧化 L-Tyr
的抑制效果，由图 1a 中（曲线 1）的发展走势可以看到不含抑
制剂的体系中 L-Tyr 的氧化有明显延滞期。图 1a 中 2~7 曲
线显示了所含不同浓度抑制剂（浓度从低到高）体系中的酪
氨酸氧化的反应过程，结合图 1b 中所示的含不同浓度抑制
剂各体系的反应延滞时间和图 1c 中显示的稳态期不同抑制
剂对稳态期酶活力的抑制情况，延滞时间不会随着抑制剂浓
度的增加而有所变化，而稳态期系统中酶活力随着抑制剂浓
度的增加呈减低趋势。浓度为 0.75 毫摩尔 / 升的抑制剂系
统中的剩余酶活为 30%，抑制剂浓度为 0.2 毫摩尔 / 升的系
统中的为 72%。抑制剂的半抑制浓度（IC50）为 0.4 毫摩尔 /
升。
b
图 1 化合物对单酚酶的抑制作用
（a）酪氨酸酶促反应酪氨酸氧化的发展曲线，1~6 化合物
浓度依次为：0、0.2、0.3、0.4、0.5 和 0.75 毫摩尔 / 升；（b）化
合物对延滞时间的影响；（c）化合物对单酚酶稳态活力的影
响。
抑制剂抑制酪氨酸酶对 L-DOPA 的氧化活性，即对二酚
酶的抑制效果试验，是用 L-DOPA 作为酪氨酸酶的底物的，
二酚酶的反应会立即达到稳态期（没有延滞时间）。由图 2 中
所示的结果可以看出，酪氨酸酶二酚酶的活力随着抑制剂的
剂量增加而减弱，且在 0.4 毫米以内的抑制剂浓度有较为显
著的降低，降幅可达 62%，而在抑制剂浓度为 0.4~0.75 毫摩
尔 / 升的范围内下降较缓，降幅为 12.4%。估算出导致剩余
酶活力失去 50%的抑制剂浓度（IC50）为 0.25 毫摩尔 / 升。
（a）酪氨酸酶促反应 L-DOPA 变化的发展曲线，1~6 化
合物浓度依次为：0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75 毫摩尔 / 升；（b）
化合物对二酚酶稳态活力的影响。
从 L-DOPA 氧化的被抑制情况，来研究抑制剂对酪氨酸
二酚酶的抑制机制。图 3 所示，在含有抑制剂的系统中酶活
力与酶浓度的关系，由于作用的抑制剂浓度的不同，在图中
给出了酶活力对酶浓度的一组全部通过原点的直线，抑制剂
浓度的增加使得直线的斜率呈现下降的结果，表明抑制剂的
存在不会使酶在总量上有所减少，而仅仅是减弱了酶的活
力。
图 3 化合物对酪氨酸酶二酚酶的抑制机理，1~5 化合物
浓度分别为 0、0.05、0.1、0.3、0.5 毫摩尔 / 升
对 L-DOPA 氧化过程中的酪氨酸酶动力行为进行了研
究。在本次研究中，酪氨酸酶参与催化的 L-DOPA 氧化反应
遵循着米氏动力学。改变含有不同浓度抑制剂各体系中的反
应底物 L-DOPA 的浓度，并测定各体系中 L-DOPA 氧化反
应的初速度。含抑制剂体系中酪氨酸酶的动态研究如图 4 所
示的以 Lineweaver-Burk 双倒数作图，得到一组相同截距，且
相交于纵坐标轴（1/V），斜率不同的直线。由这种只使米氏
常数（Km）增大，却不会影响最大反应速率（Vm）的情况，可
以判断该抑制剂对酪氨酸酶为竞争性抑制。出现这种竞争类
型一般认为是由于抑制剂与酶反应底物具有相类似的结构，
其会与底物竞争酶活性中心的结合位点。竞争性抑制剂只能
与游离酶（E）相结合，以与底物争夺酶结合部位的方式，使
酶活力呈现下降的结果，并不能酶—底物的复合物（ES）结
合，底物量的增加会减少其与酶的几率，而使它与酶结合产
生的这种抑制作用减弱，直至消失。以图 4 中各浓度抑制剂
对应的直线结合米氏方程计算出米氏常数（Km），以 Km 对
抑制剂浓度作图（图 4b），获得一条斜率为 3.0997 的直线，进
而可知该抑制剂与酶结合时的平衡常数，即抑制常数（KI）为
3.0997 毫摩尔 / 升。
（a） Lineweaver-Burk 双倒数作图，直线 1~5 化合物浓度
实验研究
Shiyanyanjiu
a
图 2 化合物对酪氨酸酶二酚酶抑制浓度效果
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实验研究
Shiyanyanjiu
分 别 为
0、0.05、
0.2、0.4
和 0.75
毫摩尔 /
升。
（b）
直线的斜
率对抑制
剂浓度作
图
3 讨论
酪氨
酸酶以三
种形式存
在，氧化
态（Eoxy）
酪氨酸酶
可以单酚
或二酚结
合与底物
作用成为
脱 氧 态
（Emet）酶
同时生成水和醌，脱氧态酶再与氧结合成为氧化态酶，而进
入循环，还原态酶（Edeoxy）则仅仅可以结合二酚却不具有单
酚酶活性。酪氨酸酶同时具有单酚酶活性和二酚酶活性，就
是由于此三种形式酶的存在与转化而表现出来的。本试验从
臭菘植物中所提取的 3,5- 二甲氧基 -4-O-B-D- 吡喃葡
萄糖基桂皮酸是肉桂酸类衍生物亦为羧基化合物，同时具有
抑制单酚酶和二酚酶活力的功能，且其所表现出的抑制活性
为竞争性抑制。试验结果表明 3,5- 二甲氧基 -4-O-B-D-
吡喃葡萄糖基桂皮酸对酪氨酸酶促反应的延滞时间几乎没
有影响，对二酚酶的抑制作用要好于对单酚酶的作用。该抑
制剂浓度为 0.75 毫摩尔 / 升时，单酚酶的剩余酶活为 30%，
而二酚酶的剩余酶活为 25.6%。两者的半抑制浓度（IC50）分
别为 0.4 和 0.25 毫摩尔 / 升。文献对肉桂酸及其衍生物对酪
氨酸酶的抑制报道的不少，石艳、陈清西[12]等人研究了肉桂
酸及其 3 个衍生物（2- 羟基肉桂酸、4- 羟基肉桂酸、4- 甲氧
基肉桂酸）对酪氨酸酶的抑制，研究发现，除 2- 羟基肉桂酸
外，其余三者对二酚酶都有不同程度的抑制。龚盛昭等人对
肉桂酸、对羟基肉桂酸以及肉桂酸甲酯抑制酪氨酸酶催化反
应的动力学研究中测得肉桂酸和肉桂酸甲酯均为为非竞争
性抑制剂，肉桂酸对单酚酶和二酚酶抑制的 IC50分别为 0.37
和 0.61 毫摩尔 / 升，抑制常数（KI）为 0.68 毫摩尔 / 升，肉桂
酸甲酯抑制单酚酶和二酚酶的 IC50为 0.61 和 1.49 毫摩尔 /
升，其抑制常数为 0.66 毫摩尔 / 升，而对羟基肉桂酸对酪氨
酸酶的抑制类型为混合型的，其单酚酶和二酚酶的 IC50为
0.12 和 0.50 毫摩尔 / 升，对游离酶（E）和酶—底物络合物
（ES）的抑制常数分别为 0.29 和 0.60 毫摩尔 / 升[13-15]。
本研究中的抑制剂的 IC50较上述的肉桂酸及其衍生物
的都要低，且比熊果苷的（IC50=5.3 毫摩尔 / 升）也要低很多，
可被利用于酪氨酸酶抑制剂中，若将其产品化，还需对其进
行更深入的研究。
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作者简介：毛欣欣，硕士，吉林农业大学中药材学院，教
师，研究方向：野生动植物保护与利用。
通讯作者：张智文，硕士，吉林农业大学中药材学院，教
师 研究方向：天然药物化学。
图 4 化合物对酪氨酸酶的抑制类型和抑制
常数的测定
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