全 文 ：菌株号 采集地点 采集日期
CH0002 广西南宁山圩农场博爱分场 2007-10-16
CH0003 广西南宁山圩农场博爱分场 2007-10-16
CH0006 广西南宁山圩农场博爱分场 2007-10-16
CH0008 广东雷州市幸福农场 2007-10-21
CH0009 广东雷州市东方红农场 2007-10-22
CH0010 广东雷州市东方红农场 2007-10-22
CH0014 广东雷州市东方红农场 2007-10-22
CH0017 广东雷州市东方红农场 2007-10-22
CH0021 广东雷州市东方红农场 2007-10-22
CH0023 广东雷州市东方红农场 2007-10-22
CH0026 广东雷州市金星农场 2007-10-22
CH0027 广东雷州市金星农场 2007-10-22
CH0028 广东雷州市金星农场 2007-10-22
表 1 实验材料
剑麻也称龙舌兰麻， 为龙舌兰科 Agavaceae 龙
舌兰属 Agave linnaeus， 是多年生肉质旱生草本植
物， 是一种在热带亚热带地区栽培的重要硬质纤维
作物。 剑麻茎腐病是剑麻最严重的病害之一[1-2]。 50
年代初， 坦桑尼亚 [3-4]和肯尼亚 [5]最早报道发生此
病。 我国于 1987 年在广东省的一些国营农场发现
此病， 给当地造成重大经济损失 [6]。 近年来， 该病
又相继在我国各剑麻主产区发生为害， 并有不断加
重之势， 以广西植麻区为害最为严重。 有关此病的
发生规律、 病原对药物的敏感性和病原生物学特性
的研究已有报道 [3，6-8]， 而在剑麻茎腐病菌属内种间
的分子分类方面， 国内外尚未采用 ITS 区同源性开
展工作， 鉴于此， 本文采用形态学和 rDNA-ITS 序
列分析相结合的方法对 13 个来源于广西和广东不
同农场的未经鉴定的剑麻茎腐病菌进行分类鉴定，
以期为建立剑麻茎腐病菌的分子检测与其病原菌的
快速诊断技术奠定基础， 为剑麻茎腐病的防治提供
参考依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试菌株及来源 剑麻茎腐病菌菌株 13
个， 由中国热带农业科学院热带生物技术研究所按
柯赫法则分别从中国广西南宁和广东雷州的剑麻发
病病茎上分离得到。 菌株编号和分离地点见表 1。
热带作物学报 2011， 32（6）： 1093-1096
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2010-12-01 修回日期： 2011-05-23
基金项目： 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（ITBBZx1051） ； “948” 项目（2010-Z6）； 国家麻类现代农业产业技术体系建设专项
（CARS-19-E17）； 国家科技支撑计划（2007BAD48B06）； 海南省自然科学基金（80510）。
作者简介： 郑金龙（1982年—）， 男， 福建漳平人， 硕士。 研究方向： 剑麻分子病理研究。 *通讯作者： 易克贤， E-mail: yikexian@21cn.com。
剑麻茎腐病菌的 rDNA-ITS序列分析
郑金龙 1，2， 高建明 1， 张世清 1， 陈河龙 1， 刘巧莲 1， 易克贤 1，2*
1 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室 海南海口 571101
2 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所， 海南儋州 571737
摘 要 应用核糖体 rDNA-ITS 区的序列分析研究 13 个不同地区来源的剑麻茎腐病菌， 测序结果表明， 参试菌
株的 ITS 扩增区约 600 bp， 无太大的长度变异， 同时通过在 GenBank 中搜索其同源性序列并构建它们的系统发
育树， 结果表明， 引起剑麻茎腐病的病原为黑曲霉菌 Aspergillus niger。
关键词 剑麻； 茎腐病； rDNA-ITS； 序列分析
中图分类号 S435.63 文献标识码 A
Sequence Analysis of ITS Region of rDNA
of Aspergillus niger in Sisal
ZHENG Jinlong1，2, GAO Jianming1, ZHANG Shiqing1, CHEN Helong1, LIU qiaolian1, YI Kexian1,2
1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, CATAS, Key Laboratory of Tropical Crop
Biotechnology, Ministry of Agriculture Haikou, Hainan 571101, China
2 Institute of Environment and Plant Protection, CATAS, Danzhou, Hainan 571737, China
Abstract Thirteen isolates causing sisal stem rot from different regions were studied using ribosome rDNA-ITS region
sequence. The sequencing results showed that the ITS amplified region of the tested isolates were about 600 bp,
without too much variation in length. After sequence blast in the GenBank and constructing the phylogenetic tree,
the results showed that the pathogen was identified as Aspergillus niger.
Key words Sisal stem rot disease; rDNA-ITS; Sequence analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2011.06.021
第 32 卷热 带 作 物 学 报
图 1 剑麻茎腐病大田发病症状 图 2 剑麻茎腐病病原菌菌落图 图 3 剑麻黑曲霉分生孢子梗及分生孢子图
1.1.2 供试试剂 DNA 提取试剂盒购自美国
Biomiga 公司； DNA 片段回收试剂盒和 pMD19-T
载体购自宝生物工程（大连）有限公司； 2×Taq PCR
MasterMix 购自天根生化科技 （北京 ）有限公司 ；
rDNA-ITS通用引物 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT
ATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA
GG-3′）， 由北京三博远志生物技术有限责任公司合
成； 大肠杆菌 JM109感受态细胞由笔者实验室制备。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组 DNA 提取 各参试菌株的总 DNA
采用植物真菌 DNA 提取试剂盒提取， 试剂盒购自
美国 Biomiga公司， 按试剂盒的说明步骤操作。
1.2.2 rDNA-ITS PCR扩增 ①引物： 引物为真菌
通用引物 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）
和 ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′），
由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。 ②
PCR反应体系（50μL）： 2×Taq PCR MasterMix 25μL，
引物 ITS4、 ITS5 各 2μL， 模板 2μL， ddH2O 19μL。
③PCR反应条件： 94℃变性 2 min； 94℃变性 1 min；
54℃退火 1 min； 72℃延伸 1.5 min； 共 35 个循环；
72℃延伸 10 min。 ④检测 PCR 产物： 取 5 μL 产物
加 0.5 μL SYBR GREEN I 染剂， 在 1％的琼脂糖
凝胶上 60 V 电泳 20 min 后， 在凝胶成像系统中观
察、 拍照。
1.2.3 PCR扩增产物克隆测序 将 PCR 扩增产物
纯化后与 pGEM-T Easy Vector 为克隆载体连接，
再转化至大肠杆菌感受态细胞中， 用含有 X-Gal、
IPTG、 Amp 的 LB 平板筛选， 挑取白色菌落培养，
并做 PCR检测， 剔除假阳性菌株， 对克隆成功的菌
株样品送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.2.4 rDNA-ITS序列分析 将获得的测序结果登
入 NCBI 网站， 在 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 数
据库中进行 Blast 检索比对， 然后将测序所得到的
序列信息与 GenBank上下载的已知黑曲霉属菌株的
序列（GenBank的序列登记号分别为： EU440772）用
DNA MAN软件绘制系统发育树， 分析其同源性。
2 结果与分析
2.1 分离病原菌的形态特征及显微鉴定结果
通过对 13个菌株培养物显微观察， 菌丝有隔，
无色、 淡色或表面凝集有色物质； 分生孢子梗从壁
厚而膨大的足细胞垂直生出， 多数无隔， 上部较粗
大， 顶端膨大成球形的泡囊， 从泡囊的全部表面放
射状地生出小梗或仅在泡囊顶端生出小梗， 小梗或
在顶端再分化成 2个至多个的小梗， 分生孢子串生
于小梗顶端， 作辐射状排列或丛集成柱形， 形状、
颜色、 大小和纹饰的变化很大（图 1、 2、 3）。 初步
鉴定结果为黑曲霉菌 Aspergillus niger， 属半知菌
亚门丝孢纲丝孢目丝孢科曲霉属。
2.2 rDNA-ITS PCR 扩增结果
应用真菌 ITS区的通用引物 ITS4（5′-TCCTCCG
CTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGT
CGTAACAAGG-3′）对剑麻茎腐病病原菌基因组 DNA
进行扩增， 得到一条 600 bp 左右的特异性条带，
且没有其它片段的干扰， 基本无拖带现象， 所扩增
的条带特异性较好（图 4）。
图 4 剑麻茎腐病病原菌 r DNA ITS 区段 PCR 扩增电泳图
1094- -
第 6 期
2.3 rDNA-ITS 区序列比对结果
将获得的测序结果登入 NCBI网站， 在 GenBank+
EMBL+DDBJ+PDB 数据库中进行 Blast检索、 比对，
结合形态学的观察结果， 结果表明， 13 个参试菌
株均为黑曲霉菌 Aspergillus niger， 属半知菌亚门
Deuteromycotina、 丝孢纲 Hyphomycetes、 丝孢目
Hyphomycetales、 丝孢科 Hyphomycetaceae、 曲霉属
Aspergillus， 这与本研究中的显微观察鉴定结果相
同； 用 DNA MAN 软件构建的系统发育树（图5）结
果表明， 13 个供试菌株和网上下载的已知黑曲霉
菌（EU440772RC）的同源性高达 96％以上， 进一步
证明本研究的 13 个参试菌株均为黑曲霉菌； 同时
这 13 个供试菌株和网上下载的已知黑曲霉菌
（EU440772RC）在同源性 96％处被分为 2 个组， 第
一个组只有一个菌株 CH0010， 其它菌株被分在第
二个组， 而第二个组又在同源性 97％处分为 2 个
亚组， 同时这 2个亚组下还有细分， 说明本研究的
13 个参试菌株间的遗传距离存在一定差异， 但差
异不显著， 亲缘关系较为密切。
3 讨论
真菌 rDNA 由于存在高度保守区和可变区而被
认为是目前真菌分子研究方法的理想部位。 尤其是
核糖体内转入间隔区（ITS）， 它是介于 18S rDNA、
5.8S rDNA 和 28S rDNA 之间的区域， 该区域进化
速率较编码区快， 在种内不同菌株间高度保守， 而
在真菌的种间存在着较大的变化， 这些变化反应
在系统发育上非常直观， 易于理解。 可为研究真
菌的系统发育、 分类鉴定和分子检测提供丰富的
遗传信息 [9]。
本研究测序结果表明： 13 个剑麻茎腐病病原
菌的 ITS 扩增片段介于 580～604 bp 之间 ， 通过
blast 比对， 13 个参试菌株均属于黑曲霉菌。 尽管
有的真菌种内显示出显著的 ITS 多态性[10]， 但对大
多数的真菌而言， ITS 多态性都表现出种间差异明
显， 而种内较为一致的规律性 [11-14]， 本试验的系统
发育树结果表明， 13 个参试菌株和网上下载的已
知黑曲霉菌（EU440772RC）的同源性高达 96％以上，
而菌株之间亲缘关系较近， 基本没有差异， 该结果
也恰好反映了此现象。
由于剑麻茎腐病的发病初期是在剑麻植株体
内， 肉眼不易观察， 需到发病中后期才能观察到，
但该病到了中后期， 剑麻植株的地下茎组织大部分
已病变腐烂； 同时由于真菌病害潜伏期长， 不易掌
握施药期， 且由于剑麻植株的蜡质层、 鳞片极大地
阻碍了药剂的顺利渗入， 这样给生产上防治该病带
来极大的困难。 因此， 该病快速检测方法的研发就
显得极为重要。 本文的另一个重要目的就是希望能
为后期进行剑麻茎腐病病原菌的快速检测研究奠定
基础， 以提供理论依据。
图 5 基于分离菌株及来自 GenBank 的黑曲霉菌的 ITS 序列构建的系统发育树
郑金龙等： 剑麻茎腐病菌的 rDNA-ITS序列分析 1095- -
第 32 卷热 带 作 物 学 报
对剑麻茎腐病病原菌进行种的分子鉴定国内外
至今未见报道， 本研究通过 rDNA-ITS 对剑麻茎腐
病病原菌进行鉴定， 以期为今后对剑麻茎腐病的发
病规律、 防治方法及病原菌的快速检测等方面研究
奠定基础， 同时为该病菌的分类鉴定及其系统发育
研究提供理论和依据。
参考文献
[1] 孙光明. 剑麻栽培工程[M]. 北京： 中国农业出版社， 2007.
[2] 李道和. 剑麻栽培[M]. 北京： 中国农业出版社， 1998.
[3] Mand. M. Wallance， E. C. Diekmahns. Bole rot of sisal[J]. The
East African Agricultural Journal， 1952， 18（1）： 24-29.
[4] R. Cifferri. Red rot of sisal in Venezuela[J]. Phytopathology ，
1951， 41（8）： 766.
[5] J. F. Wienk.Planter dan-bole rot[J]. Kenya Sisal Bd.Bull， 1964，
（50）： 33.
[6] 黄 标， 符清华 . H.11648 麻茎腐病发生规律及防治研究 [J].
热带农业科学， 1990（3）： 38-45.
[7] Tomomichi Yanagita， Sabura Yamagishi. Comparative and quantitative
studies of fungi toxicity against fungal spores and mycelia [J].
Applied Microbiology， 1958， 6（6）： 375-381
[8] 郑服从， 黎乙东. 剑麻茎腐病病原菌生物学特性的研究[J]. 热
带农业科学， 1992， 13（1）： 79-85.
[9] 林剑伟， 阙友雄， 陈天生， 等 . 核糖体 DNA 的内转录间隔区
序列标记在真菌分类鉴定中的应用[J]. 生物技术通讯， 2007，
18（2）： 292-294.
[10] Chillali M， Idder I H， Guillaum in J J， et al. Variation in the
ITS and IGS regions of ribosomal DNA among the biologic
alspecies of Europe an Arm illafia[J]. Mycol.Res， 1998， 102：
533-540.
[11] Huang H， Mao W M， Zheng R Y. PCR base dretriction fragment
length polymer phismsin ribosomal DNA of the genus Cunning
hamel[J]. Myco system， 1999， 18： 259-269.
[12] 阎培生， 罗信昌， 周 启. 木耳属真菌 rDNA 特异扩增片段的
RFLP 研究[J]. 菌物系统， 1999， 18： 206-213.
[13] ODonnell K. Ribosomal DNA internal transcribe dspacersare
highly diver gentint hephytopatho genicas comycetes Fusarrium
sambucinum（Gibberella pulicaris）[J]. Current Genetics， 1992， 22：
213-220.
[14] Persson Y， Erland S， Jansson H. Identification of nematode-
trapping fungi using RFLP analysis of the PCR amplified ITS
region of ribosomal DNA[J]. Mycol.Res.， 1996， 100： 531-534.
责任编辑： 叶庆亮
1096- -