全 文 ：第 40卷 第 3期
2016年 5月
南京林业大学学报(自然科学版)
Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition)
Vol．40，No．3
May，2016
doi:10．3969 / j．issn．1000－2006．2016．03．007
收稿日期:2015－03－18 修回日期:2015－12－03
基金项目:国家自然科学基金项目(31270715，31000295);浙江农林大学发展基金项目(2010FＲ072)
第一作者:汤叶根(735938916@ qq．com)。* 通信作者:徐英武(yxu@ zafu．edu．cn)，教授。
引文格式:汤叶根，施泉，林新春，等． 雷竹 SOC1蛋白原核表达及纯化［J］． 南京林业大学学报(自然科学版)，2016，40(3) :41－46．
雷竹 SOC1蛋白原核表达及纯化
汤叶根，施 泉，林新春，徐英武*
(浙江农林大学，亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300)
摘要:为了获得有活性的雷竹 PvSOC1蛋白(Phyllostachys violascens SUPPEＲSSOＲ OF CO OVEＲEXPＲESSION 1)，
并进一步讨论其结构形态，通过原核表达方法得到 PvSOC1的可溶性重组蛋白，以 pET－GST作为表达载体，大肠
杆菌 E．coli Ｒosetta作为宿主菌株，超表达全长和 IKC 结构域的雷竹 PvSOC1 蛋白。发现在 37℃条件下，菌液浓
度 D(600)值达到 0．4～0．6时进行诱导，控制 IPTG终浓度为 0．4 mmol /L，诱导目的蛋白表达 5 h，可以获得可溶
的 IKC结构域 GST融合蛋白。采用 TEV(tobacco etch virus protease)酶切技术、配合 GST亲和层析柱及分子层析
色谱柱，去除标签蛋白并纯化目的蛋白。所获得的高纯度 IKC结构域 PvSOC1蛋白经过对比分析发现其以八聚
体形式存在。
关键词:雷竹 SOC1蛋白;原核表达;蛋白纯化
中图分类号:Q518. 2 文献标志码:A 文章编号:1000－2006(2016)03－0041－06
Expression and purification of Phyllostachys violascens SOC1 protein in prokaryotic system
TANG Yegen，SHI Quan，LIN Xinchun，XU Yingwu*
(The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang Agriculture and
Forestry University，Linan 311300，China)
Abstract:In order to obtain soluble recombinant PvSOC1(Phyllostachys violascens SUPPEＲSSOＲ OF CO OVEＲEX-
PＲESSION 1)protein in vitro． We used pET－GST as expression vector，to over-express full-length and IKC structural
domain of PvSOC1 in E．coli Ｒosetta prokaryotic system． We found the optimal expression strategy is when the suspension
cultures OD600 value reaches 0．4－0．6，add IPTG and keep it＇s concentration at 0．4 mmol /L ． Kept incubating for 5 h at
the temperature of 37℃ to induce the protein．We found IKC domain is soluble，to compare with the fullength sequence，it
started from No．62 amino acid and ends at No．225． Added TEV (tobacco etch virus protease)protease to remove GST
tag．Combined glutathione sepharose resin with size exclusion chromatography (SEC)to get highly purified IKC domain of
PvSOC1．And chromatography data proof this domain exists as a octamer．
Keywords:Phyllostachys violascens SOC1 protein;prokaryotic system;protein purification
MADS－box基因家族能够编码 58 个氨基酸－
DNA结合域，是参与调节数条发育途径的转录因
子，在被子植物系谱演化过程中经历了大量的复制
与趋异过程［1］。拟南芥(Arabidopsis thaliana)开花
整合因子 SOC1 作为含有 MADS－box 结构域的转
录因子［2］，能够整合来自不同开花途径的信号，传
递给花分生组织基因，从而实现对开花时间的精确
调控［3－4］。
有研究表明，SOC1 蛋白能够与 MADS－box 家
族中的 CO、FVL、FLC、FT、AGL24及 SVP 蛋白相互
作用，激活植物从营养生长到生殖生长的转
化［5－7］。mＲNA表达分析显示，CO 蛋白识别 SOC1
启动子序列中 351 bp的特异性区段，促进 SOC1基
因的表达［4，8－11］。多种 MADS 结构域蛋白免疫共
沉淀的结果，支持了 SOC1 /FUL以复合物形式完成
成花信号传递的结论［12］。春化途径基因 FLOW-
EＲING LOCUS C(FLC)能在上游调控 SOC1 表
达［9，13］。相反，FLC蛋白作用于同一区段的 CArG－
box 则抑制 SOC1 的表达［3－4，8］。研究显示，FT 对
SOC1起正调节作用，也有 AGL24 在开花转型期间
对 SOC1蛋白起促进作用的观点;相对的，SVP 起
抑制作用［5，10，14］。而 MADS－box 家族蛋白相互作
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 40卷
用的位点是 IKC 结构域［15］(I、K、C 结构域的合
称)。
拟南芥 SOC1(642 bp)和雷竹 SOC1 基因的蛋
白序列对比发现，相似度达到 72%，并且 K 结构域
保守。异源的MADS－box蛋白家族如何规则排列，
并和靶 DNA相互作用形成复合物的机理目前仍未
可知。但是实验发现体外 SEP3 同源二聚体与
MADS结构域(又称 M 区)异源二聚体结合，能够
形成 DNA复合物［16］。已有研究表明 K 结构域能
够帮助异源MADS－box蛋白互作，是发生二聚体化
的结构基元［17］。但 MADS 结构域作为 DNA 结合
位点不参与构象［18］。由于可溶性 AtSOC1 蛋白较
难获得，所以该蛋白相关信息较少。笔者获得了可
溶的 PvSOC1蛋白 IKC结构域，可以通过同源蛋白
PvSOC1-IKC结构域的研究，初步认识 MADS 家族
蛋白相互作用的方式。
雷竹(Phyllostachys violascens)是禾本科竹亚科
刚竹属竹种，是中国南方特有的优良栽培竹种，但
常有开花现象，不利栽培。有研究认为，雷竹开花
的生物学特殊性很可能是调控开花的转录因子
PvSOC1在蛋白构象上区别于同源蛋白的分化造
成的［1］，PvSOC1 与同源基因在表达时间、花序形
成和促进花器官的发育等方面的作用也有区
别［3］。竹子开花的生理研究受取样困难和相关基
因组信息缺乏的限制，因此研究竹子开花关键因子
非常必要。
1 材料与方法
1．1 试材
试验材料取自亚热带森林培育国家重点实验
室(简 称 本 实 验 室)大 棚 内 1 年 生 雷 竹
(Phyllostachys violascens)实生苗。E． coli DH5α 感
受态细胞，E．coli 表达菌株 ＲosettaTM(DE3)以及表
达质粒 pET－GST 为本实验室保存;ＲNA 提取试剂
盒购自北京鼎国昌盛有限公司;AMV 酶反转录试
剂盒、DNA 聚合酶、各种 DNA 限制性内切酶及其
配套缓冲液购自宝生物工程(大连)有限公司;
DNA连接酶购自 New England 公司;DNA 纯化试
剂盒、胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有
限公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公
司合成，全长 cDNA由马腾飞等［19］提供。
1．2 试验方法
1．2．1 PvSOC1原核表达载体的构建
用 Trizol法提取雷竹茎尖组织 ＲNA，反转录得
到 cDNA。对雷竹 SOC1基因进行序列结构域分析
(图 1)，根据雷竹 SOC1 基因的全长序列(681
bp)，IKC结构域(498 bp，为 SOC1 全长的第 62 到
第 226个氨基酸)设计引物，采用 PCＲ技术配对上
游和下游引物(PvSOC1－F 为 CGC GGA TCC ATG
GTG CGG GGG AAG ACG CAG，PvSOC1－Ｒ为 CAC
GCC TCG AGT TAT CCT GAC TTA TCT GTT GT;
PvSOC1－IKC－F 为 CGC GGA TCC ATG GTG CGG
GGG AAG ACG CAG，PvSOC1－IKC－Ｒ为 CAC GCC
TCG AGT CAA GCA TGG TTA TCC TGA CT)进行
扩增。PCＲ反应体系为:10×Buffer 2 μL，上游引物
(10 μmol /L)1 μL，反向引物(10 μmol /L)1 μL，
dNTP(2．5 mmol /L)1 μL，cDNA(0．05 μg /L)1 μL，
rTaq 酶(5 U /μL)0．25 μL，加水至总体积为 20 μL。
反应条件:预变性 94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，65 ℃
45 s，72 ℃ 45 s，共 32个循环;72 ℃ 8 min。
图 1 雷竹 PvSOC1基因编码区及MIKC结构域划分图
Fig．1 The full OＲF length of PvSOC1 gene and the amino acid sequence analyze using NCBI
PCＲ扩增产物回收后，用限制性内切酶 XhoⅠ
和 BamHⅠ双酶切 3 h、胶回收试剂盒回收目的片
段。酶切胶回收产物连接到酶切后拥有同样黏性
末端的 pET －GST 载体上，热激转化到大肠杆菌
DH5α中。之后涂布于抗 Kan+的 LB 平板上，菌液
PCＲ验证阳性克隆后，取样送上海生工生物有限
公司测序。测序验证正确，菌株扩大培养，提取质
粒，转化大肠杆菌表达菌株 ＲosettaTM(DE3)并涂布
在含有 Kan+的 LB 平板上。保存单克隆，得到
PvSOC1不同结构域基因重组子，重组子在表达过
24
第 3期 汤叶根，等:雷竹 SOC1蛋白原核表达及纯化
程中以 N端包含 GST标签的融合蛋白形式表达。
1．2．2 PvSOC1蛋白的可溶性表达条件筛选
测序正确的单克隆放大培养，转接到 10 mL的
含 50 μg /mL Kan+抗性的 LB液体培养基中，37 ℃
培养 3 h。菌液 D(600)值为 0．4 ～ 0．6 时，以 IPTG
终浓度 0．4 mmol /L为诱导条件，分别在 37 ℃、5 h
和 20 ℃、10 h的条件下进行诱导培养。
2 mL 菌液经 6 000 r /min 离心 10 min，弃上
清，加入 0． 75 mL 裂解液(0． 2 mol /L NaCl，20
mmol /L Tirs－HCl pH 8. 0)，冰溶破碎细胞，超声破
碎仪功率设定为 100 W，开、关分别 5 s和 8 s，超声
波处理 1 min，超声结束静置 5 min;在 4 ℃条件下
17 000 r /min离心 35 min，收集上清液，取 20 μL加
入 5 μL 蛋白上样缓冲液(250 mmol /L Tris －Hcl
(pH6. 8)，10%(体积比)SDS，0. 5%(体积比)
BPB，50%甘油，5% β－巯基乙醇)煮沸 10 min 作
为上清液样品，离心得沉淀，加 500 μL 裂解液再次
超声波处理后，取 20 μL 加入 5 μL 蛋白上样缓冲
液煮沸 10 min 视为沉淀样品。所有样品点样在
15%聚丙烯酰胺凝胶，经 SDS－PAGE 电泳，获得目
的蛋白的小量表达分析结果。
1．2．3 谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化 PvSOC1蛋白
使用谷胱甘肽琼脂糖树脂初步纯化 PvSOC1
蛋白。具体步骤如下:1 L菌液经 6 000 r /min离心
10 min收集诱导后的细胞，加入 20 mL裂解缓冲液
(0．2 mol /L NaCl，20 mmol /L Tirs－HCl，pH 8．0)。
冰浴，超声功率为 200 W，开、关分别 5 s 和 8 s，超
声 15 min，静置 10 min 后，在 4 ℃条件下 17 000 r /
min离心 35 min，收集上清液。用裂解缓冲液作为
平衡缓冲液，平衡好约 2 mL 谷胱甘肽琼脂糖树脂
柱，将裂解菌上清液倒入树脂纯化柱，放入冰浴摇
床缓慢摇动结合 60 min 左右，取出纯化柱置于支
架上，滤出并弃去未特异性结合谷胱甘肽琼脂糖树
脂上的杂蛋白液，再用 15倍柱体积清洗缓冲液(0．
2 mol /L NaCl，20 mmol /L Tris－HCl pH 8．0)洗脱非
特异性结合的杂蛋白，最后用 5倍树脂体积的洗脱
缓冲液(0．2 mol /L NaCl，20 mmol /L Tris －HCl，20
mmol /L glutathtione pH 8．0)收集目的蛋白。
1．2．4 PvSOC1－IKC融合蛋白去除标签
在 10 mL 洗脱的蛋白液中(缓冲条件 0． 2
mol /L NaCl，20 mmol /L Tirs－HCl，pH 8．0)，加入
10 μL的 TEV Protease溶液(10 mmol /L)，4 ℃下酶
切过夜，靶标蛋白和标签可以充分切开。酶切液中
加入 pH 8．0 的 20 mmol /L Tirs－HCl 缓冲液，将上
述反应体系的 NaCl浓度调低至 50 mmol /L。稀释
的蛋白混合液通过 AKTA Purifier 仪器上样到规格
为 5 mL 的 Hitrap Q 型离子柱，上样流速设置为 2
mL /min，盐浓度梯度设置为在 30 mL 体积内实现
从 20 mmol /L到 1 mol /L的梯度变化，缓冲体系为
20 mmol /L Tirs－HCl，pH 8．0。PvSOC1-IKC在 NaCl
浓度上升至 130 mmol /L 时洗脱，GST 标签蛋白在
离子柱内 NaCl 浓度上升至 170 mmol /L 时洗脱。
实现标签蛋白与目的蛋白的分离。
1．2．5 分子层析色谱柱纯化目的蛋白
使用谷胱甘肽琼脂糖树脂及离子柱初步纯化
目地蛋白后，用凝胶过滤层析柱纯化可溶性的融合
蛋白。将收集的洗脱液用 10 ku 超滤浓缩柱 4 800
r /min离心浓缩至 500 μL后注射进 AKTA进样口，
以裂解缓冲液(0．2 mol /L NaCl，20 mmol /L Tris －
HCl pH 8．0)作为上样缓冲液，使用分子筛 Super-
dexTM 75 10 /300 GL 分离，调节 AKTA 仪器，设定
缓冲液进样流速为 0．5 mL /min，分离纯化目的蛋
白。取 20 μL fraction蛋白样品加入 5×蛋白上样缓
冲液，煮沸 10 min，于 15%聚丙烯酰胺凝胶(SDS－
PAGE)点样，完成电泳，并根据蛋白条带位置和纯
度观察目的蛋白的纯化情况。
2 结果与分析
2．1 pET－GST－PvSOC1原核表达载体
在马腾飞等［19］前期工作已经获得包含全长
PvSOC1基因的 cDNA 序列的基础上，根据 MIKC
结构域和 IKC 结构域设计引物，扩增出全长以及
包含全部 IKC 结构域的目的片段。将全长和 IKC
结构域片段克隆到表达载体，对转化表达宿主成功
的菌株，提取质粒进行 PCＲ鉴定和双酶切鉴定，均
得到期待的目的片段，证明成功构建出全长及 IKC
结构域的 pET－GST－PvSOC1 原核表达载体。
2．2 可溶性的 PvSOC1蛋白表达条件
将构建好的原核表达菌株扩大培养，离心收集
菌过后用裂解液悬浮菌体超声破碎。12%SDS 电
泳图中(图 2)检测发现 25 ku PvSOC1(其 GST 标
签融合蛋白为 50 ku)在 37 ℃条件下诱导 5 h能过
量表达，但在上清样品中没有检测到目的蛋白，目
的蛋白在沉淀样品中出现于 50 ku 位置。PvSOC1
－IKC(18 ku)在 37 ℃条件下诱导 5 h 可以表达出
目的蛋白，且在上清液和沉淀样品均出现，以融合
蛋白 43 ku(GST 25 ku)形式表达。表明 PvSOC1－
IKC以 pET－GST 为原核表达载体，在 37 ℃条件
下，IPTG终浓度 0．4 mmol /L条件下诱导表达 5 h，
可以得到过量表达的可溶蛋白。因此，只有
34
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 40卷
PvSOC1－IKC可进行蛋白纯化。
图 2 PvSOC1全长蛋白及 IKC结构域表达及
可溶性检测
Fig．2 Screening for soluble PvSOC1 protein expression
注:C．未诱导对照，CK;M．Marker;S．上清样品 soup samples;
P．沉淀样品 precipitation samples． PvSOC1－IKC．雷竹 SOC1 蛋白
IKC 结构域 PvSOC1 － IKC． IKC domain;PvSOC1． 雷竹全长
PvSOC1，诱导温度 37 ℃和 20 ℃。PvSOC1．Full－length PvSOC1．
37 ℃ and 20 ℃ ． inducing temperature．
2．3 纯化的目的蛋白和聚合形态
经 TEV Protease 酶切和离子柱纯化后用 10 ku
超滤浓缩柱浓缩至体积 500 μL，使用 AKTA
Purifier上样至凝胶过滤层析柱 SuperdexTM 75 10 /
300 GL 作最终纯化(图 3a)。洗脱缓冲液为 0. 2
mol /L NaCl，20 mmol /L Tris－HCl pH 8．0，流速设置
为 0．5 mL /min，接取流出液的体积分率(fraction)
为 0．25 mL。取小量 fraction 样品加入蛋白上样缓
冲液，煮沸 10 min，15%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
－PAGE)，结果如图 3b所示。图 3a标识 AKTA Pu-
rifier 8—10. 75 mL进样体积时的峰值读数对应图
3b泳道中标识 8—10．75 泳道的蛋白条带，图中显
示纯化蛋白大小为 18 ku，是 PvSOC1－IKC蛋白，此
蛋白吸收峰位置在 134 ku蛋白吸收峰位置之前。
2．4 PvSOC1－IKC可溶蛋白的聚合体形态
小牛血清蛋白(BSA)溶液以单体和二聚体形
式存在，拥有 67 ku 大小的单体及 134 ku 二聚体。
为了比较 PvSOC1－IKC的聚合体形态，使用小牛血
清蛋白在分子筛 SuperdexTM 12 10 /300 GL 出峰位
置图作为标尺，得到蛋白出峰图谱。对比PvSOC1－
IKC的峰形曲线和位置(相同缓冲液和分子筛
柱)，比较出峰位置推断蛋白大小，从而判断聚合
体形态。
参照(图 3a)黑色曲线为去除 GST 标签后的
PvSOC1－IKC 上样曲线，峰值位置在进样后 9． 5
mL。PvSOC1－ IKC 蛋白最高峰值位置在分子筛
SuperdexTM 12 10 /300 GL，比 134 ku 出峰位置早;
BSA 134 ku峰值位置在 9．7 mL，67 ku 峰值位置在
11 mL。PvSOC1－IKC 的蛋白为 18 ku，非常接近
图 3 PvSOC1－IKC混合蛋白 SEC流出样品结果
图(a)及对应 SDS－PAGE胶结果(b)
Fig．3 Chromatogram of SEC－fractionated
fractions after SEC
注:a．横坐标为上样体积数，纵坐标为吸光值;b．M 为蛋白
Maker。8～10．75对应 SEC峰值图纵坐标流出液体积数(mL)。
Abscissa represents the volume，ordinate represents the absorbance
values． Gel filtration of PvSOC1－IKC proteins;M． Marker proteins．
8—10．75． SDS page gel of the peak in SEC Chromatogram at 9．5
mL;PvSOC1－IKC． target protein(18 ku)．
134 ku，因为较早出峰，说明分子质量比 134 ku 略
大，判断是以八聚体形式存在，聚体分子质量大小
为 144 ku。认为 PvSOC1－IKC的构象为八聚体。
前人研究发现，在形成精细功能复合物的时
候，SOC1 碳端 11 个氨基酸残基将会起到关键作
用［7］。SOC1碳端及 K 区是保守的，推断 SOC1 蛋
白通过 IKC结构域形成同源或异源多聚体完成开
花信号的传导。
3 讨 论
在植物生育期分子调控网络中，SOC1 作为光
信号因子起到承上启下的功能［3－4］。因此 SOC1 拥
有与上下游转录因子相互作用的结构域。
MADS－box 转录因子主要由 MADS 盒、K-盒、
I-盒、C末端组成［20］。SOC1 基因在被子植物中的
单子叶和双子叶中都较保守［21－22］，SOC1 具有
MADS－box家族高度保守的 DNA 结合域即 MADS
box，是转录因子氮端高度保守域，大约含有 60 个
氨基酸［23］，识别并结合下游目标基因的特定位点，
从而起到调控目标基因表达的作用。SOC1 也具
44
第 3期 汤叶根，等:雷竹 SOC1蛋白原核表达及纯化
有一个特征性结构域 K box，该结构域能够折叠成
3个两性 α螺旋，使得 MADS-box 蛋白之间能够形
成二聚体，通过介导蛋白质之间的相互作用来调控
目标基因的表达［24］，I 区大约 30 个氨基酸，位于
MADS box与 K box之间，对决定特异 DNA结合及
二聚体起着关键作用。C 端能够调整 MADS 之间
的相互作用，并且参与转录激活过程［25－27］，同时还
能稳定或增强以 K box 为媒介的相互作用［28－29］。
对拟南芥 SOC1(642 bp)和雷竹 SOC1 基因的核酸
序列和蛋白序列比较后，发现核酸序列的相似度
低，但是蛋白序列相似度达到 72%。同时，雷竹与
毛竹(Phyllostachys edulis(Carr．)H． deLehaie)的
SOC1蛋白序列比对发现，只是在碳端非保守区有
3个碱基的区别，翻译后的 SOC1 蛋白在这两种竹
子中序列匹配度也相似，所以其蛋白构象也可能是
相似的。由于 MADS 区的保守性，因此 IKC 结构
域的序列差别很可能决定了竹子区别于双子叶植
物的独特开花过程。SOC1 对可于花信号传递的
特异性是由 IKC 结构域与 MADS 家庭蛋白形成不
同构象多聚体的方式决定的。
对全长和 IKC 结构域的雷竹 SOC1 蛋白进行
了可溶性检测，发现只含有 IKC 结构域的 PvSOC1
蛋白是可溶的，而全长 PvSOC1 蛋白不可溶，说明
M区具有较强疏水性，在蛋白合成及修饰过程中
该区域暴露在外，因此蛋白从胞内释放后，疏水区
结合形成包涵体不可溶。
分子筛 SuperdexTM 12 10 /300 GL 图谱表明，
PvSOC1是以八聚体形式存在的。由于 MADS－box
的结构域是非常保守的，是 DNA 与蛋白的识别与
结合位点［15］。结合 DNA 需要多个 MADS－box 结
构域，但 MADS 结构域自身不能对多聚体形成产
生效果［30－31］。对已知 SOC1 /TM3－like MADS 家族
基因进行序列对比得知，在裸子和被子植物中，
MADS家族同源 SOC1 在碳端有 11 个氨基酸残基
是高度保守的，不受系统发育学距离和进化突变先
后的影响。在形成精细功能复合物的时候，SOC1
碳端 11个氨基酸残基将会起到关键作用［1］。笔者
认为 IKC 结构域形成八聚体赋予了 PvSOC1 结合
DNA的能力。只有 IKC结构域首先形成多聚体才
能使 SOC1蛋白的 MADS－box 结构相互靠近，结合
DNA。是否 PvSOC1 蛋白 IKC 区可以和非同源
MADS 家族蛋白互作形成多聚体还有待进一步验
证，但是 SVP、AGL15、AGL18 已经展现了能与
SOC1 结合的能力［32－34］。而且已发现同属于
MADS家族的 SEP3 蛋白同源二聚体能搭配 MADS
家族的异源二聚体形成 DNA 复合物，研究者提供
的模型中［16］，同源的两个 SEP3蛋白相互作用形成
二聚体，之后和 AP1蛋白以及 PI 蛋白形成一个四
聚体，而 DNA 环绕这个功能活性聚体形成蛋白、
DNA复合物。
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(责任编辑 刘昌来)
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