全 文 ：基金项目:国家自然科学基金资助项目(81173515) ;江苏高校优势学科建设工程资助项目
作者简介:李军，男，硕士研究生 研究方向:中药化学 * 通信作者:梁侨丽，女，副教授，硕士生导师 研究方向:中药活性成分研究
Tel:(025)85811512 E-mail:liangqiaoli2008@ 163. com
·论 著·
荆三棱顺式茋类化合物的结构修饰及抗炎活性
李军，梁侨丽* ，雷玲玲，崔晓东，刘杰，东水华(南京中医药大学药学院，南京 210023)
摘要:目的 对荆三棱顺式茋类化合物进行结构修饰及体外抗炎活性评价。方法 分别运用甲基化、乙酰化、去甲基化反应
对荆三棱中新的顺式茋类化合物 sciryagarol I(1)进行结构修饰。采用噻唑蓝(MTT)法考察化合物 1 及其结构修饰物 3 ～ 5 和
荆三棱中另一新顺式茋类化合物 sciryagarol II(2)对 ＲAW264. 7 细胞活力的影响。以脂多糖(LPS)与 Pam3csk4 分别诱导
ＲAW264. 7细胞炎症模型，运用酶联免疫吸附法(ELISA )法检测化合物 1 ～ 5 对细胞释放炎性因子肿瘤坏死因子-ɑ与白细胞
介素-6(IL-6)的影响。结果 通过1 H-NMＲ 和 HＲESI-MS 确定修饰物 3 ～ 5 的结构;化合物 1，2 和 5 能显著抑制由 LPS 或
Pam3csk4诱导的 ＲAW264. 7 细胞释放的炎性因子肿瘤坏死因子-ɑ和白细胞介素-6。结论 修饰物 3 ～ 5 皆为新化合物，顺式
茋类化合物的抗炎作用强度与其结构上的酚羟基数目有一定关系。
关键词:荆三棱;顺式茋类化合物;结构修饰;肿瘤坏死因子-ɑ;ＲAW264. 7 细胞
doi:10. 11669 /cpj. 2015. 01. 004 中图分类号:Ｒ284 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2015)01 － 0015 － 04
Structure Modification of Cis-Stilbenoids from the Tubers of Scirpus yagara and Their Anti-Inflammatory
Activities
LI Jun，LIANG Qiao-li* ，LEI Ling-ling，CUI Xiao-dong，LIU Jie，DONG Shui-hua(Nanjing University of Chinese Med-
icine，Nanjing 210023，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To synthesize cis-stilbenoids derivatives and investigate their anti-inflammatory activities in vitro.
METHODS Sciryagarol I(1)from the tuber of Scirpus yagara，was used as a primary material. The synthetic derivatives were ob-
tained via methyltion，acetylation，and demethylation. MTT assay was used to detect the effects of compound 1，its synthetic deriva-
tives 3-5 and sciryagarol II(2)on ＲAW264. 7 cells viability. And the inhibitory activities of compounds 1-5 against TNF-ɑ and IL-6
production in LPS-and Pam3csk4-activated ＲAW264. 7 cells were evaluated by ELISA assay. ＲESULTS The compounds 3-5 were
synthesized，and their structures were characterized by 1H-NMＲ and HＲESI-MS spectra. ELISA assay showed that compounds 1，2
and 5 significantly inhibited the production of TNF-ɑ and IL-6 from LPS-and Pam3csk4-stimulated ＲAW264. 7 cells. CONCLUSION
Three novel compounds 3-5 are synthesized. The number of phenolic hydroxyl in the structure of cis-stilbenoids may be related to
their anti-inflammatory activities.
KEY WOＲDS:Scirpus yagara;cis-stilbenoid;structure modification;TNF-ɑ;ＲAW264. 7
茋类化合物存在于自然界的多科植物中，被称
为植物内毒素，是植物免疫系统在受到外界侵害
(如细菌、病毒、光辐射等)时进行特殊免疫应答所
产生的，由于其多样化的生理活性(如抗氧化、抗病
毒、抗炎、抗肿瘤等) ，一直备受关注［1］。荆三棱
(Scirpus yagara Ohwi)为莎草科藨草属植物，是常用
的药用水生植物，其干燥块茎为中药三棱的来源，块
茎中富含茋类化合物，现代药理学表明，它们具有抗
氧化、抗肿瘤、保护心血管等作用［2-4］。但是有关荆
三棱中茋类化合物对炎症反应影响的文献报道却非
常少见。许多慢性疾病的发病机制都涉及炎症机
制，例如炎性肠病、类风湿关节炎、败血症、动脉粥样
硬化和癌症等［5］。抑制炎症因子的生成是预防或
者治疗一些慢性疾病的重要靶标。脂多糖(LPS)
和 Pam3csk4 诱导的 ＲAW264. 7 小鼠巨噬细胞是常
见的两种研究炎症反应的模型［6］。巨噬细胞在 LPS
或 Pam3csk4 刺激下，可促进炎性因子如肿瘤坏死因
子(TNF-ɑ)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β
等的分泌［7］。近期，本课题组从荆三棱块茎中分离
鉴定出 2 个新的顺式茋类化合物 sciryagarol I(1)和
sciryagarol II(2) ，并发现它们具有抗肿瘤、抗细菌、
抗真菌的活性［8］(图 1)。本实验中，我们对含量较
·51·
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高的 1 进行了结构修饰，设计合成了 3 个新化合物
3 ～ 5。另外，还观察了 1 ～ 5 对 LPS 或 Pam3csk4 诱
导的 ＲAW264. 7 细胞炎性因子 TNF-ɑ 和 IL-6 表达
的影响，以考察它们的抗炎作用。
1 材料与仪器
Sciryagarol I和 sciryagarol II均为本课题组从荆
三棱块茎分离得到的新化合物［8］，经 HPLC检测，化
合物纯度大于 99. 0 %。ＲAW264. 7 细胞(中国科学
院上海生命科学院细胞库) ;DMEM 培养基、胎牛血
清和青霉素-链霉素(Gibco 公司) ;LPS 和 MTT(Sig-
ma公司) ;Pam3CSK4(Invitrogen 公司) ;小鼠 TNF-ɑ
与 IL-6 ELISA试剂盒(eBioscience 公司) ;分析型薄
层板(青岛海洋化工厂) ;制备型薄层色谱板(Merck
公司);其余试剂均为市售分析纯或化学纯。
熔点用 X － 4 型显微熔点仪测定，温度未校正;
HＲESI-MS谱用 AB SCIEX Triple TOFTM5600质谱仪测
定;1H-NMＲ谱用 Bruker DＲX －300型超导核磁共振仪
测定，四甲基硅烷(TMS)为内标，DMSO-d6为溶剂。
图 1 Sciryagarol Ⅰ(1)和 sciryagarol Ⅱ(2)的结构
Fig. 1 The structures of sciryagarol Ⅰ(1)and sciryagarol Ⅱ
(2)
图 2 目标化合物的合成路线试剂和反应条件
a －碘甲烷，丙酮，碳酸钾，搅拌，30 ℃;b －乙酸酐，吡啶，搅拌，80 ℃;c －碘代
三甲基硅烷，环丁砜，45 ℃，氮气，搅拌
Fig. 2 Synthesis route for the title compounds. Ｒeagents and
conditions
a － CH3I，CH3COCH3，K2CO3，rt，30 ℃;b －(CH3CO)2O，pyridine，rt，80
℃;c － iodotrimethylsilane，sulfolane，45 ℃，N2，rt
2 实验方法和结果
2. 1 化合物 3 的合成［9］
Sciryagarol I(20 mg，0. 075 mmol)加入反应瓶
中，加丙酮 10 mL 溶解，再加入 K2 CO3(20. 6 mg，
0. 149 mmol)作为缚酸剂，搅拌 0. 5 h 后，冰浴下加
入 0. 015 mL CH3I(0. 241 mmol) ，加热至 30 ℃反应
24 h。反应完毕，过滤，减压蒸干滤液，得到黄色固
体。粗产品用制备薄层色谱纯化，展开剂条件为石
油醚-乙酸乙酯 = 10∶ 1(V /V) ，得到黄色粉末 3，收率
80. 7%。mp 138 ～ 139 ℃。1 H-NMＲ(DMSO-d6，300
MHz)δ:3. 75(3H，s，OCH3) ，3. 83(3H，s，OCH3) ，
6. 59(1H，d，J = 11. 7 Hz) ，6. 93(1H，d，J = 11. 4
Hz) ，7. 12(1H，d，J = 9. 0 Hz) ，7. 21(1H，td，J = 7. 5，
1. 2 Hz) ，7. 27(1H，dd，J = 7. 5，1. 2 Hz) ，7. 33(1H，
dd，J = 7. 5，1. 2 Hz) ，7. 34(1H，d，J = 9. 0 Hz) ，7. 40
(1H，td，J = 7. 5，1. 2 Hz)。HＲESI-MS(m/z) :Calcu-
lated for C17 H14 O4［M + H］
+:283. 096 5，found:
283. 096 2。
2. 2 化合物 4 的合成［10］
在常温水浴中，sciryagarol I (15 mg，0. 056
mmol)加入三孔烧瓶中，加入 2 mL 无水醋酐，待样
品搅拌溶解后加入 1 mL吡啶，逐渐加热至 80 ℃，反
应 2 h，反应液冷却至室温后，边搅拌边加入 20 mL
蒸馏水，放置过夜，有黄色固体析出，过滤，烘干，得
到淡黄色针状结晶 4，得率 86. 9%。mp 150 ～ 152
℃。1 H-NMＲ(DMSO-d6，300 MHz)δ:2. 31(3H，s，
CH3) ，3. 83(3H，s，OCH3) ，6. 59(1H，d，J = 11. 4
Hz) ，6. 90(1H，d，J = 11. 4 Hz) ，7. 14(1H，d，J = 9. 0
Hz) ，7. 22(1H，td，J = 7. 5，1. 2 Hz) ，7. 30(1H，dd，
J = 7. 5，1. 2 Hz) ，7. 36(1H，dd，J = 7. 5，1. 2 Hz) ，
7. 38(1H，d，J = 9. 0 Hz) ，7. 40(1H，td，J = 7. 5，1. 2
Hz) ;HＲESI-MS(m/z) :calculated for C18H15 O5［M +
H］+:311. 091 4，found:311. 091 0。
2. 3 化合物 5 的合成［11］
取 sciryagarol I(20 mg，0. 075 mmol)加入三孔
烧瓶中，加入 4 mL无水环丁砜，45 ℃搅拌溶解。在
氮气保护下，加入 0. 1 mL碘代三甲基硅烷，于 45 ℃
下反应 2. 5 h，反应结束后冷却至室温，加入蒸馏水
0. 3 mL，反应液在 70 ℃下搅拌 0. 5 h，然后室温搅拌
过夜。反应液中加入 5 mL乙酸乙酯，用饱和食盐水
萃取 3 次，每次 5 mL，有机相中加入无水硫酸钠后
放置过夜，除去干燥剂，回收溶剂，得到淡黄色粉末
5，得率 79. 4%。mp 155 ～ 156 ℃。1 H-NMＲ(DMSO-
d6，300 MHz)δ:6. 64(1H，d，J = 8. 7 Hz) ，6. 75
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(1H，d，J = 11. 7 Hz) ，7. 04(1H，d，J = 8. 7 Hz) ，7. 13
(1H，t) ，7. 17(1H，d) ，7. 25(1H，d) ，7. 28(1H，t) ，
8. 04(1H，d，J = 11. 7 Hz)。HＲESI-MS(m/z) :cal-
culated for C15 H11 O4［M － H］
－:253. 048 0，found:
253. 047 6。
与原料 sciryagarol I的氢谱数据［8］比较，化合物
3 的氢谱数据显示，3 在 δ 3. 75(3H，s)处新出现一
个甲氧基信号，且没有出现 δ 9. 93 处的羟基信号，
其他波谱数据与 sciryagarol I一致，同时高分辨质谱
给出 3 的分子式比 sciryagarol I 多 CH2，上述说明 3
为 sciryagarol I 4-羟基的甲基化衍生物。化合物 4
的氢谱数据显示，4 在 δ 2. 31(3H，s)处新出现 1 个
甲基信号，同样 δ 9. 93 处的羟基信号消失，4 的高分
辨质谱显示比 sciryagarol I 多出 C2H2O，上述说明 4
为 sciryagarol I 4-羟基的乙酰化衍生物。化合物 5
的氢谱数据显示，5 在 δ 3. 82(3H，s)处的甲氧基信
号消失，且 5 的高分辨质谱给出的分子式比 scirya-
garol I少了 CH2，说明 5 为 sciryagarol I 5-甲氧基的
去甲基化衍生物。
3 体外抗炎活性分析
3. 1 细胞培养
ＲAW264. 7 细胞培养在含有 10%的胎牛血清的
DMEM完全培养基中，培养基中含有 100 u·mL －1青霉
素、100 μg·mL －1链霉素。细胞在含有 5% CO2的 37
℃ 培养箱中培养。ＲAW264. 7 细胞呈单层贴壁生长，
2 ～3 d传代 1次，0. 25%胰酶消化传代。
3. 2 MTT法测定细胞存活率
取对数生长期的 ＲAW264. 7 细胞，以每孔 1 ×
105个·孔 － 1将细胞接种于 96 孔板中，设 4 个复孔，
培养 20 h后弃去培养液，加入含有不同浓度药物的
培养基 100 μL，对照组加入含有 0. 2% DMSO 的培
养基 100 μL，空白组只加 100 μL DMEM培养基，培
养 24 h，每孔加入浓度为 5 g·L －1 MTT溶液 20 μL，
继续培养 4 h后，弃去培养液，每孔加入 150 μL DM-
SO终止反应，振荡 10 min 使结晶完全溶解，用酶标
仪于 490 nm 波长测定光密度值(A 值)。计算存活
率，存活率 =(实验组 A值 －调零 A值)/(空白组 A
值 －调零 A值)。
3. 3 ELISA测定各炎性因子含量
取对数生长期的 ＲAW264. 7细胞，以 2 ×105个·
孔 －1的细胞密度接种于96孔板中，细胞培养4 h后弃
去培养液，PBS洗 2 遍，加入无血清的 DMEM 培养基
培养 20 h。弃去板孔内液体，PBS 洗 2 遍，将各待测
药物与 LPS 共同加入刺激细胞。实验分设空白组
(加入 DMEM 培养液)、LPS组(LPS 1 μg·mL －1)、药
物加 LPS 组(各浓度药物 + LPS 1 μg·mL －1) ，
Pam3csk4 组(500 ng·mL －1) ，药物加 Pam3csk4 组和
药物组(加入含各药物最大终浓度的 DMEM 培养
液) ，每组设 3个复孔。加样后培养 16 h，分别收取上
清液，ELISA 法检测细胞上清液中 TNF-ɑ 与 IL-6 的
含量。操作步骤按试剂盒操作说明书进行。
3. 4 数据统计
采用 Graphpad Prism 5. 0 对数据分析进行单因
素方差分析(analysis of varianee，ANOVA)，采用
SPSS 17. 0 计算 IC50值，组间两两比较采用 Students
t test，P ＜ 0. 05 有统计学意义。
3. 5 实验结果
3. 5. 1 细胞毒性实验结果 MTT 实验测得的各化
合物对 ＲAW264. 7 细胞形态无影响，光密度值与正
常对照组比，A 值无显著差异的浓度范围见图 3。
MTT的结果显示，各化合物进行抗炎活性评价实验
的最大试药浓度分别为:化合物 1 和 3 ～ 5 均为 50
μmol·L －1，化合物 2 为 20 μmol·L －1。
3. 5. 2 ELISA实验结果 分别用 LPS 和 Pam3csk4
刺激的巨噬细胞，测定化合物对细胞释放炎性因子
TNF-α和 IL-6 含量的影响，评价化合物的抗炎活
图 3 化合物 1 ～ 5 不同浓度对 ＲAW264. 7 细胞存活率的影
响． n = 3，珋x ± s
与空白组比，1)P ＜0. 05
Fig. 3 Effects of compounds 1-5 on the cell vitality of
ＲAW264. 7 macrophages． n = 3，珋x ± s
1)P ＜0. 05，vs control
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性。各化合物抑 制 LPS 和 Pam3csk4 诱 导 的
ＲAW264. 7 细胞释放 TNF-α 和 IL-6 的 IC50值见表
1。化合物 3 和 4 浓度在 50 μmol·L －1以内抑制
LPS和 Pam3csk4 诱导的 TNF-α 和 IL-6 释放的作用
很弱，而化合物 1 抑制 LPS 诱导的 TNF-α 释放的作
用也很弱，故数据未显示。
4 讨 论
炎症是机体受到外界微生物侵袭或损伤后，免
疫系统做出的一种局部的、保护性反应［12］。在炎症
产生的过程中，巨噬细胞扮演着关键的角色，其能受
外界刺激产生各种炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子
(TNF-ɑ)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β
等［13］。在众多炎性因子中，TNF-α 通过调节 IL-1、
IL-6、IL-1β等的表达，在调节炎症反应中起关键作
用［14］。由 LPS 等诱导的促炎因子如 TNF-α 和 IL-6
等在炎症疾病的反应过程中起到重要作用。这些炎
症因子的过度表达会导致或加重多种炎症相关疾病
如败血症、动脉粥样硬化、炎性肠病等［15］。调节
TNF-α和 IL-6 的表达是研究预防和治疗炎症疾病
的靶点。
茋类化合物存在于多种植物中，具有抗炎、抗肿
瘤的活性［16］。本实验以对 LPS和 Pam3csk4 分别刺
激的巨噬细胞释放 TNF-α 和 IL-6 的影响为评价指
标，首次研究了荆三棱块茎中分离到的新顺式茋类
化合物 1 和 2 以及 1 的结构修饰物 3 ～ 5 的体外抗
炎活性。3 和 4 分别是化合物 1 结构上酚羟基的甲
基化和乙酰化产物，无显著的抗炎活性。1 抑制
LPS 诱导的 ＲAW264. 7 细胞释放 IL-6 的 IC50 为
47. 79 μmol · L －1，抑 制 Pam3csk4 诱 导 的
ＲAW264. 7 细胞释放 TNF-α 和 IL-6 的 38. 24 和
26. 03 μmol·L －1;5 是化合物 1 的去甲基化合物，2
和 5 在结构上都比 1 多一个酚羟基，其抗炎活性明
显提高，2 和 5 抑制 LPS 诱导的 ＲAW264. 7 细胞释
表 1 化合物 1，2，5 抑制 LPS 和 Pam3csk4 分别刺激的
ＲAW264. 7 细胞释放 TNF-α和 IL-6 的 IC50值 . μmol·L
－1
Tab. 1 IC50 of compounds 1，2，5 of inhibiting LPS and
Pam3csk4-induced TNF-α and IL-6 levels in ＲAW264. 7
cells. μmol·L －1
Compound
LPS Pam3csk4
TNF-α IL-6 TNF-α IL-6
1 － 47. 79 38. 24 26. 03
2 10. 98 8. 39 7. 71 10. 20
5 32. 81 41. 58 21. 50 25. 97
放 TNF-α 和 IL-6 的 IC50值分别为 10. 98 和 8. 39
μmol · L －1、32. 81 和 41. 58 μmol · L －1，抑制
Pam3csk4 诱导的 ＲAW264. 7 细胞释放 TNF-α和 IL-
6 的 IC50值分别为 7. 71 和 10. 20 μmol·L
－1、21. 50
和 25. 97 μmol·L －1。这些数据显示，这类顺式茋
类化合物的抗炎活性可能与其酚羟基取代数目以及
位置有一定关系，其具体的构效关系还需要分离或
合成更多的衍生物在活性比较基础上进行总结。
ＲEFEＲENCES
［1］ LI Y Q. Design，synthesis and biological Evaluation of stilbene
derivatives［D］. Dalian:Dalian University of Technology，
2006.
［2］ EDIT COMMITTEE OF FLOＲA OF CHINA． Flora of China(中
国植物志) ［M］. Beijing:Science Press，1961，11:7.
［3］ ZHANG T J，WANG L L. Study on the chemical constituents of
Scirpus yagara(I) ［J］. Mod Pharm Clin(现代药物与临床) ，
2009，24(1) :36-38.
［4］ YANG G X，ZHANG L Y，CHEN G. Determination of four phe-
nolic compounds in Scirpus yagara Ohwi by CE with amperomet-
ric detection［J］. Chromatographia，2010，71(1) :143-147.
［5］ NATHAN C，DING A H. Nonresolving inflammation［J］. Cell，
2010，140(3) :871-882.
［6］ LIU B. The innate immune reponse mechanism of TLＲ2，TLＲ4
and ＲP105 in mouse macrophages infected by Staphylococcus au-
reus［D］. Changchun:Jilin University，2013.
［7］ YANG J H，LI S C，XIE C F，et al. Anti-inflammatory activity
of ethyl acetate fraction of the seeds of Brucea Javanica［J］. J
Ethnopharmacol，2013，147(1) :442-446.
［8］ LIANG Q L，LEI L L，CUI X D，et al. Bioactive cis-stilbenoids
from the tubers of Scirpus yagara ［J］. Fitoterapia，2013，84
(1) :170-173.
［9］ ANDＲEW N L，PHILIP D W，STEPHEN P W，et al. Syntheses
of differentially protected isocoumarins［J］. Tetrahedron，2010，
66(11) :5573-5582.
［10］ LI X J，DU Z C，DENG J G，et al. Synthesis and anti-inflamma-
tory activity of mangiferin acylated-derivatives［J］. Chin J Exp
Tradit Med Form(中国实验方剂学杂志) ，2012，18(24) :
228-232.
［11］ NOBUHIＲO S，YUKIHIＲO K. A convenient synthesis of 2，5-di-
hydroxypyrazines［J］. J Heterocyclic Chem，1986，23(17) :
1677-1679.
［12］ HU B Y，ZHANG H，MENG X L，et al. Aloe-emodin from rhu-
barb(Ｒheum rhabarbarum) inhibits lipopolysaccharide-induced
inflammatory responses in ＲAW264. 7 macrophages［J］. J Eth-
nopharmacol，2014，153(3) :846-853.
［13］ WANG J，JIANG W，WANG Y. Anti-inflammation of flavonoid
compounds from Dalbergia odorifera T. Chen in lipopolysaccha-
ride stimulated ＲAW264. 7 macrophages［J］. Chin J Cell Mol
Immunol(细胞与分子免疫学杂志) ，2013，29(7) :681-684.
［14］ ELMALI N，BAYSAL O，HAＲMA A，et al. Effects of resvera-
trol in inflammatory arthritis［J］. Inflammation，2007，30(12) :
1-7.
［15］ ZHANG X M，SONG Y，CI X X，et al. Effects of florfenicol on
early cytokine responses and survival in murine endotoxemia［J］．
Int Immunopharmacol，2008，8(4) :982-987.
［16］ ＲIVIＲE C，PAWLUS A D，MＲILLON J M. Natural stilbe-
noids:Distribution in the plant kingdom and chemotaxonomic in-
terest in Vitaceae［J］. Nat Prod Ｒep，2012，29(19) :1317-
1333. (收稿日期:2014-06-11)
·81· Chin Pharm J，2015 January，Vol. 50 No. 1 中国药学杂志 2015 年 1 月第 50 卷第 1 期