全 文 ：第 4 卷第 2期
19 8 8年 4 月
生 物 化 学 杂 志
C h in es e B io n c em ia el Jo u rn a l
Vol
.
4
. 付。 . 乏
A P r
. ,
1 98 8
海枣曲霉 p一半乳糖普酶的催化性质
曹宇成 张树政
(中国科学院微生物研究所 , 北京 )
摘 要
通过浏定海枣曲霉冬半乳糖普晦的底物特异性 , 表明该晦水解对一峭
基盼基 冬半乳箱替 (P N P一刀一到 ) 的活 力最高。 _该 晦 水 解 P N P一刀一ga l ,
乳糖和对一对基盼基 刀一 D一岩藻糖替 ( P N P一刀一 f u c ) 的相 对 活 力 为 1 0 ,
63
.
1 , 1 0
.
3
。 不 同浏定方法的结果均表明 , 这一 P X P甲一 f ue 水解 活 性来
自刀一半乳格普晦本身。 H g Z+ 、 D 一半乳糖和 D一半乳糖一 r 一内醋对该 晦 有抉
烈的抑制作用 , 魄 十和 4 m ol l/ 脉也有较强的抑制作用 。 该晦水 解 P N P一刀-
ga l 和乳糖的 K m 值分别为 1 . 3及 36 . 2 m m ol l/ , V m “ x 则令 利 为 4 78 和 1 89
拼m o l . m i n 一 ` . m g 一 ` 。 L i n e w e a v e r 一 B “ r k 作图法及 D i x o n 作图法均表明 D一半
乳糖和 D 一半乳糖酸一 y一内醋对该晦显示竞争性抑制作用 , 共 iK 分别为 4和
0
.
g m m o l / l
。
关链词 : 刀一半乳糖普晦 底物特异性 抑制荆 海枣曲霉
前 古口
前文报道了海枣曲霉介半乳糖普酶的提纯 一与性质 t` , , 本文则报导该酶的底物 特 异性 、
抑制剂及一些动 力学性质 。
材 料 和 方 法
一 、 主要化学试剂
对一稍基酚基户半乳糖普 (P N P一刀一ga l) , 对一稍基酚基 户 D 一岩藻糖普 (P N P一刀一 f uc ) , 其
余对一稍基酚基糖普及 D 一半乳糖酸一 ,一内醋 , 均为美国卜 S ig m 。 公司产品 。 乳 糖 ( A , R ) ,北京
化工厂产品 。 D一半乳糖 (生化试剂 ) ,上海试剂二厂产品 。
二 、 酶的制备与提纯
按前文方法进行 l[] 。
本文于 1 9 8if年月 1 0 日 6收到
I Q9
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1988. 02. 003
三 、 酶活力的测定
1
.以 P N P 一刀一 g al 或共他 P N P一 a或 刀一糖普为底物时 , 测定方法同前文 t ’ ] 。
2
. 以乳搪 、 纤维二糖等为底物时 , 1%底物 (P H 4 . o 、 o . l m ol l/ 柠檬酸一N气H P O ; 缓冲
溶液 ) 。 . s m l , 酶液0 . 5 lm , 40 ℃反应 15 分钟后 , 用葡萄糖氧化酶法 图 测活力 。
3
. 以淀粉 、 木聚糖等为底物时 , 同 “ 2” 法进行反 应 , 用 oS m og iy 一N le s on 法 [ a] 测 定产
生的还原糖 。
四 、 各种化学试剂对酶活力的影响
在存在金属离子 (1 m m ol l/ ) 或碳水化合物 ( l o m m ol l/ ) 的条件下 , 按常法测定酶水解
P N P一刀一 g a l 的活力 。
结 果 和 讨 论
一 、 各种金属离子对酶活力的影响
在所测定的各种试剂中 , 只有 H g Z十对该酶有强烈的抑制作用 , A g + 、 4 m ol l/ 服也有一定
的抑制作用 。 Pba 十 、 C u Z+ 、 E D T A 和 SD S 等常见的抑制剂均对该酶活力无明显影响 ( T ab l e l ) 。
这表明 , 该酶对金属离子不敏威 , 其活力也不需金属离子 。
T a b l e 1 E f f e e t o f v a r i o u s e h e m i e a l s o n 七h e a e t i v i七y o f 日一 g a l a e七o s i d a s e
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7 1
.
8 9
.
…
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二 、 各种碳水化合物对酶活力的影响
测定结果表明 , D一华乳糖酸一 y一内醋对该酶有强烈的抑制作用 , D一半乳糖也有较强的抑
制作用 。 而乳糖 、 D一葡萄糖等多种碳水化合物对该酶活 力无明 显 影 响 (T a b l e 2) 。 据报道 ,
D一半乳糖对米曲霉 ( A s p e r夕i l l u s o r y二 a e ) [ 4〕 ,环状芽 抱 杆 菌 ( B a o i l l u s o i r o u l a o s ) t . ]等多
种微生物来源的冬半乳糖普酶均有抑制作用 。 D一半乳糖酸一 y一内酷对 牛 肝 t“ 1 、番木瓜 [ 7〕刀-
半乳糖普酶有强烈抑制作用。 本文则首次报道 D一半乳糖酸理一内酶对霉菌来 源 的户半乳糖
普酶也有强烈的抑制作用 。
1 10
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8
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2
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1 7 9
.
2一 . . . . . . . . . . . . . . .三 、 酶的底物特异性测定结果如 T ab l e 3 。 刀一半乳糖普酶对 P N P一刀一 ga l 的水解活力最高 , 对乳糖也有较 强的水解作用 。 该酶对 p N p 一刀一葡萄糖普 ( p N p 一刀一 g l e ) 、 p N p 一刀一木 糖 普 ( p N p 一刀一 x y l ) 等多种糖普 , 及纤维二糖 、 蔗糖 、 淀粉和木聚糖等多种糖类均无水解作用 。 这说明该酶底物特异性
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.
3
较强 , 同时所用酶液的纯度也很高 。 然而 , 该酶对 P N P一刀一 f uc 也有 较 低的水解活性 。 这一
活性的最适 PH 和温度 , PH称定范围均与 P N P一刀一夕 l 水解活 性 完全一致 。 且二者均在 60 ℃
子工l
长时间保温仍稳定 , 而在 65 ℃迅速失活 。
二者在 65 ℃保温时失活 50 %的时间均为 27
分钟左右 。 这些性质与从同一材料 中提纯
的卜D一岩藻糖普酶相去甚远 , 后者在 40 ℃
即易失活 〔“ 〕 。 抑制剂试验表明 , 对同 一 材
料提纯的冬 D 一岩藻糖普酶和 冬葡萄糖普
酶有强烈抑制作用的 D 一 葡萄糖 酸菊一 内
醋 , 却对 冬半乳糖昔酶的 P N P一刀一 f uc 水
解活性完全没有影响 。 相反 , 刀一 半 乳 糖
普酶的抑制剂 D一 半乳糖及 D一 半乳 糖酸
刁一内醋均强烈抑制其 P N P一刀一 f u 。 水解活
性 , 且不同浓度的 D一半乳糖酸一 y 一内酷对
该酶 的 P N p 一刀一 g a l 和 P N p 一刀一 f u c 水解活
性的抑制曲线基本一致 ( iF g . 1 ) 。 `综合上述
结果 , 可以认 为 尽半 乳糖普酶 的 P N P 一
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介 fu 。 水解活性来 自该酶本身 , 而 不大可能是样品中混有未分离的 户D 一岩 藻糖 普 酶 。 实际
上 , 不少动 、 植物来源的糖普酶均能同时水解数种糖普键 。 如仁杏 0[] 、 鼠肾 l0[ , 、 牛肝 〔” ]和猫
肝 [’ 幻 等来源的价半乳糖普酶 , 均有较高的户葡萄糖普酶和 户D 一岩藻糖普酶活 性 。 然而 ,
本文则首次报道微生物 L来源的卜半乳糖普酶也有 足D 一岩藻糖普酶活性 。
四 、 酶的动力学参数
分别于 6 0℃和 P H 4 . o , 按常法测定该酶水解 0 . 2一 s m m o l / 1 p N p 一刀一 g a l 或 5一 l o o m m o l / l
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1 1 2
乳糖的活力。 将测定结果按 wo ol f法作图 ( Fi g. 2, 3) . 结果 ,求得冬半乳糖普酶水 解 P N乡一
户 g a l 和乳糖的 K m 值分别为 1 . 3和 3 6 . Zm m o l / l , V m a x 则分别为 4 7 8和 1 8 9拼m o l . m i n 下 一m g 一 ` 。
五 、 O一半乳糖及 O一半乳糖酸一 y一内醋的抑制类型与抑制常数
1
.
iL n
“ w e a ve r 一 B u r k 作图法 按测 K m 值的同徉条件 , 测定存在抑制剂 与否时 , 酶的
水解活力 。 将结果作双倒数图 ( iF g . 4) 。 反应体系中无抑制剂及存在 2 . s m m ol l/ D 一半 乳 糖 、
或 D 一半乳糖酸一卜内醋时 , 其双倒数曲线均在 。 一 `轴上相交 , 一在咚」一 `轴上 的 截 距 则分别为
一 0 . 79 , 一 0
.
48
, 一 0 . 21
。 因此 , _巨逮糖类均对价半乳糖普酶显示竞事性抑制 作 用 。 在竞
事型抑制作 用中 , K i 与 K m 及存在抑 制剂时的表现 K ln a, p 有如下关系:
K l =
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由该式 ,可 求 得 D一半乳糖和 D 一半乳糖酸即一内醋的 K i 值 分 别 为 3 . 9和 o . g m m o l l/ 。
2
.
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n 作图法 于 60 ’ 及 p H 4 . o按常 法 测定反应体系中存在不 同 浓度 D一半乳糖或
D 一半乳糖酸即一内醋时酶水解 1 和 Z m , ol l/ P N P一刀一 ga l 的活力。 将 结 果 按 iD xo n 法 作 图
(F 19
.
5
,
6)
。结果亦表明 , 存在这二种抑制剂时 , 酶水解不同浓度底物的 iD xo n 曲线均相交于
横轴上面 , 因而二者均对冬平乳糖普酶显杀竞争性抑制作用 , 由曲线交点在横轴上对应的座
标值 , 可求得 D一半 乳糖和 D一半乳糖酸叮一内醋的 K i 值分别为 .4 1和 .0 8 5 nI ln o l l/ 。
从上述结果看 , 由 iL en w e a ve r一 B ur k 作图法和 iD xo n 作图法得到的结果基本一致 。 二个
作图法求得的 D 一半乳糖酸一 y一内醋的 K途植均远小于 D ` 半乳糖的 iK 值 , 故前者对 户半乳糖
普酶有很强的抑制作用 。 这可能是由于 、D 一半乳糖酸刁一内醋与该酶水解底物时形成的过渡态
有些类似 。
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线 考 文 献
[ 1〕 , 宇成 、 张树改 ( 1 9 8乃 , 《生物化学杂志》
仁2 〕 唐国教 ( 1 97幻 , 心徽生物学通报 》 6 ( 4 ) , 3 3一 3 4 。
落李4
[ s 〕 S om oy gi , M . ( 2 95 2 ) , J . B i o l . c h 。 , . , 1 5 5 , 1。一2 3 .
〔 4 〕 aP r k , Y . K . e t a l . ( 1 0 7。) ,了. F o o` S c i . , 4 4 , 1 0 0一 10 5。
[ 5 〕 喻 z a f f a r , Z . e t a l ( z , s` ) , A g r . B i o l . c h e . , , 4 5 , 5 0 5 3一 3 0 6 1。
[ s 〕 D i e ioc io
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R
.
A
.
e t a l
.
( i o a 4)
, c ` ,五。几少J , . R , , . 1 2 7 , 1 0。一1 2 0 .
〔 7 〕 伪 t a h i , K . a n d M e s a k i , A . ( 2 9合3 ) , d 君, . B矛。 I . c 寿, 。 . , 4 7 , 2峨4 1一 2刁5 1。
[ 8 〕 eZ 铭 , Y . C . e * a l . ( 1 9 8` ) , 了, , , r : ` t i o : ` 1 s y 。 产。 , i : 二 o 。 刀: r , 。 ` 。 , 。 ` , i c , , B e i j五。 ` , 以 j朋 , aM y Z一 3 0。
〔 。 1 W a l k e r , D . E .叨 d A xe r l r od , B . (1 07 . ) ,注 , ` 无. 召 10动 * 。 . B i o户几夕: . , 18 1 , 10 2一 1 0 , .
〔1 0 1 G le w , R . H . e t e l . ( z o 7 e ) ,月i 。 ` h i o . B i o户h y s . A ` ,: , 4 2 2 , 1 7。一1 , 9。
[ 1 1〕 R o o r i , e z , J . A . e t a l . ( 1 0 5 2) , z : , r . J . O s o c h。。 . , 1 4 , 6 0 6一6匀. 。
〔! 2〕 T o m i n o , s . a n d eM is l e r , M . ( l ,了5 ) , J . B言o l . c几。。 . , 2 5 0 , 7 7 6 2一 7 7 5 8。
C A T A L Y T I C P R O P E R T I E S O F 尽一 G A L A C T O S I p A S E
F R O M A S P E R G I L L U S P H O E N I C I S
Z e n g
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Y u 一 e h e n g Z h a n g , S h u 一 z h e n g
( I , s t艺t。 `。 o f M宕e , o b i o l o g梦, A c a ` e m 公a 厅f林艺e a , B o i j蓄: g )
A B S T R AC T
S u b s t r a t e s P e o i f i e i t i e s a n d i n h i b i t o r s o f t h e P u r i f i e d 刀一 g a l a e t o s i d a s e f r o m
A s p e r g `11“ 5 p h o e n `e `5 w e r e i n v e s t i g a t e d . T h e r e l a t i丫 e a e t i甲 i t y o f 尽 g a l a e t o a主d a s e
t o w a r d P一 n i t r o Ph e “ y l 刀一 g a l a c t o s i d e , l a e t o s e a n d P一 n i t r o Ph e n v l 刀一D 一 f u e o ` i d e w e r e
2 0 0 , 6 3
.
2 a n d 1 0
.
3
.
T h e K m a n d V 二 a x v a l u e s f o r P一 n i t r o Ph e n y l 刀一g a l a c t o s i d e
, e r e 1
.
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。 m o l / 1 a n d 1 5 9 拌m o l · m i n 一 ’ · m g一 ` . T h e e n z y m e a e t i v i t v w , 5 s t r o n g l v i n h i b i t e d b y
A g十 , H g Z十 , 4m o l / 1
u r e a , D 一 g a l a e t o s e a n d D一 g a l a e t o n o 一 y一 l a e t o n e
.
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e t o s e a n d D 一 g a l a e t o n o 一夕一 l a e t o n e w e r e a b o u t 4 . 0 a n d 0 . 9 m m o l / l , r e s P e e t i v e l y , a s
d e t e r m i n e d b y L i n e w e a v e r 一B u r k P l o t a n d D i x o n P l o t
.
K e y w o r d s
: 刀一 C a l a e t o s玉d a o e s 妞 b s t r a t e s P e o i f i e i t i e s I n h i b i t o r s A s p e r g f l l “ s
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