全 文 ：该 生 物 学 报 3 3 (3 ) : 1 8 2一 18 6, 19 9 3
A e t a M云e即 b公0 1叩 t e a 从几 `ca
海枣曲霉 口一 葡萄糖普酶的催化性质
曾宇成 张树政
(中国科学院徽生物研究所 . 北京 1 0 0 80 )
本文研究了海枣曲霉 ( A s那 , 丈`、 , p h oe o t “ 刃口一葡萄糖昔酶的底物特异性以及不同化学试
剂对醉活力的影响 。 该酶水解对一硝基酚基一口一 葡萄塘昔 、 纤维二糖和水杨素的相对活力分别
为 1 0 、 18 0 和 67 . 3 。 水解对一硝基酚基口一葡萄糖昔和纤维二糖的 K m 值分别为 .0 97 m , l/ L
和 1 . s m m o l /L, V m。 分别为 5 7 6料 m o l · m in 一 ` · m g 一 ` 和 5 9 5 “ m o l · m i n 一 1 · m g 一 1 。 A g + 、 D 一 葡
萄搪和纤维二搪对酶活力有强烈的抑制作用 。 iL ne w ae ve r 一 B ur k 作图法及 iD xo n 作图法表明
D 一荀萄糖对该酶显示竞争性抑制作用 , 其 K . 值分别为 .3 o m m o lL/ 和 3 . 4 m m o lL/ 。
关扭词 海枣曲霉 ; 口一 葡萄糖普酶 ; 底物特异性 ; 抑制剂
前文已报道了海枣曲霉 月一葡萄糖昔酶的提纯与性质 川 。 本文报道该酶的催化性质 。
材 料 和 方 法
(一 ) 菌种
海枣曲霉 (A缪粤`l坛 s p人o e n 葱e `, ) A s 3 . 3 14 3川 。
(二 ) 主要化学试剂
纤维二糖 , lF u ak 产品 。 水杨素 , .B D H 产品 。 D 一木糖 , .E M er k 产品 。 对一硝基酚
基一口一葡萄糖昔 ( p N P 一口一 gl c ) 及其它对一硝基酚基 一 。 或 月一糖昔 、 D 一葡萄糖 一邝一 内醋等
均为 is gma 公司产品 。 口一 1 , 2 一葡聚糖 、 昆布多糖 协一 1 , 3 一葡聚搪) 、 地衣多糖 沪 一 1 , 3 一 1 , 4
一葡聚糖) 及石脐素等为 M il es 公司何方先生赠送 。 其余均为国产试剂 。
(三 ) 曲的制备与提纯
按前文方法进行 {` } 。
(四 ) 曲活力测定
以 p N P 一 。 或 口一糖昔为底物时 , 测定方法同文献 lz[ , 水解不同底物的其余反应条件与
测定方法与文献 阁 相同 。
(五 ) 各种化学试荆对酶活力的影响
分别将各种金属离子或碳水化合物 ( 10一 l o o m m o l / L ) 等试剂 5 0拼l , p H S . 0 的 0 . l m o l / L
柠檬酸一 N aZ H P O 4 缓冲液 2 0 川 , 酶液 1 5 0川 混合 , 室温放置 30 分钟后 , 加 p N P 一口一 葡萄
搪昔 10 0川 , 按常法测定酶活力 。
本文于 1 9 , l 年 1 1 月 4 日收到 。
DOI : 10. 13343 /j . cnki . wsxb. 1993. 03. 010
3期 曾宇成等 :海枣曲霉 口一葡萄糖昔酶的催化性质
结 果 和 讨 论
( 一) 金属离子及其他化合物对酶活力的影响
在所测定的各种试剂中 , A g 十 对 口一葡萄糖昔酶有强烈的抑制作用 。 H g Z + 的抑制作
用较弱 , 4m o l / L 脉对酶活力也有一定的抑制作用 。 C u Z+ 、 p b Z+ 、 E D T A 和 S D S 等常
见的抑制剂对酶活力无明显影响 (表 1 ) 。 表明该酶对金属离子不敏感 , 其活力不需金属离
子 。
表 1 各种化学试荆对 口一钧萄抽普的活力的形响
1 、 ` b l e 1 E fe e t o f v a r i o u s e h e m i c a l s o n t h e a c t i v i t y o f 口一 g l u e o s i d as e
化学试剂 浓 度 相对活力
C h e m i
e a ls e o n e n
.
( m m
o l / L ) R e l a t i v
e a e t i v i t y (% )
对照 l 10 0
C o n t r o l 1 7
.
8
A g N O 3 l 5 3
.
8
H g C 12 l 1 0 1
.
9
A IC 13 1 9 7
.
1
B a C 12 1 9 6 3
C a C 12 l 9 0
.
3
M
n C 12 l 1 0 2
.
2
C u S O 谧 l 9 9
一
3
Z n S O 魂 l 0 9 2
.
4
P b A e Z 4 x 2 0 3 9 4
.
7
S D S 1 x 20 3 4 1
.
8
U r e a l 7 8 9
E D T A 9 8
.
0
(二 ) 碳水化合物对酶活力的影响
测定结果表明 , 口一 葡萄糖昔酶受其产物 D 一葡萄糖和底物纤维二糖的强烈抑制 。 水
杨素 、 D 一葡萄糖酸 一守一 内醋对该酶的抑制作用较弱 , 甘油及所测定的其他碳水化合物对
该酶活力无明显影响 (表 2 ) 。 据报道 , D 一葡萄糖对土曲霉 (A seP 勺 il o et 二。 ) [’] 、 齐整
小核菌 sI] ( sc le or t讯m o lfs 司口一葡萄糖昔酶均有较强的抑制作用 , 这与本试验结果一致 。 D
一葡萄糖酸巧 一 内醋对齐整小核菌 、 粉状侧饱霉 (即。 。 械hc o m p以。 、 l。 扭。 )国 等的 尽一葡
萄糖昔酶均有极强的抑制作用 , 我们所试的 D 一葡萄糖酸 一 守一 内醋对海枣曲霉 月一葡萄糖昔
酶的抑制作用则不大 。 后来又补测了 D 一葡萄糖酸 石一 内酷 , l m m ol / L 完全抑制酶活力 。
(三 ) 酶的底物特异性
以 口一葡萄糖昔酶水解 p N P 一尽一 gl c 的活力为标准 , 计算酶对其他底物的相对水解活
力 (表 3 ) 。 结果表明 , 口一葡萄糖昔酶对纤维二糖的水解活力最高 , 对 p N P 一口一 gl c 、 水
杨素等葡萄糖昔也有较高的水解活力 . 该酶对 p N P 一口一 x y l 、 p N P 一口一 ga l 等多种对 一硝
基酚基糖昔 , 对 C M C 、 口一 1 , 2 一葡聚糖 、 地衣多搪 、 昆布多糖 、 石脐素及木聚糖均无水解
作用 , 因而为一种专一水解寡聚 口一葡萄糖及 尽一 葡萄糖普底物中的 口一葡萄糖昔键的酶 。
该酶的底物特异性与粉状侧抱菌 同 、 黑 曲霉 (A sP . 瓜ge 州7 ] 等来源的对纤维二糖 、 p N P
一口一 gl c 均有水解作用的 口一葡萄糖昔酶相似 , 而不同于只能水解纤维二糖的如血痕韧革菌
微 生 物 学 报 3 3卷
( S t
e, 。 。 , a 。 , 。` o le o t、 。 ) 18 ]口一葡萄糖昔酶 , 或只水解芳基 口一葡萄糖昔的某些酵母 {9 ]口一葡
萄糖昔酶 。 葡萄穗霉 ( S : a e h , bo t印 s a : 、 ) l` o ] 、 三侧毛壳菌 (浇 a e t o二 i二二 t行 la t e、 l e ) l` ’ ]等来
源的 口一葡萄糖昔酶对纤维二糖 、 木二糖 、 p N P 一口一 gl c 、 p N P 一口一 xy l 等底物均有较高的
水解作用 , 这与海枣曲霉 口一葡萄糖昔酶的底物特异性不太相同 。 S t er n b er g 等也报道从海
枣曲霉中提纯到 口一葡萄糖昔酶 , 但该酶对地衣多糖等口一葡聚糖也有水解作用 lz[] , 比本
实验的 口葡萄糖昔酶的底物特异性要宽 。
衰 2 各种破水化合物对 . 活力的形晌
1 ’a b le 2 E fe e t o f v a r i o u
s c a r b o h y d
r a t e s o n t h e
碳水化合物
C a r b o hy d r a t e ( l o m m o l / L )
对照 C o n t r o l
n 一阿拉伯特 D 一 a r a b i n o 吕e
L 一阿拉 f白褚 L 一 a r a b i n o s e
D 一木褚 D 一 x yI O 8e
L
一岩燕抢 L 一 f u c o s e
n
一半乳梢 D 一 g a l a c t 0 8 e
o
一有萄箱 D 一 9 l u c o se
纤维二褚 C e l l o b i o se
乳褚 L a c t o s e
交芽掩 M a l t o se
木褚醉 x y l i t o l
lJ 梨醉 S o r b i t o l
半乳 . 醉 D u l e i t o l
水杨素 S a l i e i n
D 一荀萄特酸 一 , 一 内酷
D
一 g l u e o n o 一 , 一 l a e t o n e
D
一半乳褚酸 一 ,y 一 内醋
D
一 g a l a e t o n o 一 7 一 l a e t o n e
甘油 G l y e e r i n
ac t i v i t y o f口一 g l u e o s i d o e
相对活力
R
e l a t ive ac t i v i t y (% )
1 00
1 0 2
一
9
99 6
1 0 4
.
1
9 7
.
4
1 0 0
.
5
24
.
1
1 5
.
0
9 9
一
3
8 2
.
6
9 9
.
7
8 9
.
6
1 0 0
.
2
6 5
一
3
7 7
.
2
9 5 6
9 3
.
2
(四 ) 曲的动力学参数
分别于 60 ℃和 p H S . 0 的 0 . 05 m ol /L 柠檬酸 一 N a Z H P O ; 缓冲液中测定该酶水解不同浓
度的 p N P 一口一 gl c 和纤维二糖的活力 , 将测定结果按 叭沁ol f 法作图 (图 1一 2 ) 求得 口一葡萄
糖昔酶水解上述两种底物的 K 。 值分别为 0 . 9 7
~
l/ L 和 1 . 8~ ol / ;L 最大反应速度 v m ax分别为 576 拜mo .l 而n 一 ` ·m g 一 ’ 蛋白和 59 5拜m .ol 而n 一 ` · mg 一 ` 蛋白 。
农 3 . 的庄物特异性
T a b l e 3 S u b s t r a t e : p ec i6 e i t y o f 口一 g lu e o s id~
底 物 相对活力 (% )
}
S集。 t黑e 相对活力 (% )S u b 一 t r a t e R e l a t i v e ac t i v i t y R e l a t i v e ac t i v i t y
p N P 一口一 g l e 1 0 0
}
C
MC -
-一 0P N P 一口一 x y l 0 } 尽一 1 , 2厂匆粱褚 口一 ` , 2 一 g , u c a n 0
p N P
一口一 g a l 0 l 粤衣等竺 L* · h e n * n 0
p N P
一口一 f u e 0 l 垦更苦一 L a 【m 、 n a r , n 0
p N P
一 。 一 g a l 0 】今竺冬_了坚ul an _ 0
p N P 一。 一 g l e 0
} 兰冬甘些竺性_ G a , a c t o m a n n a n 0纤维二褚 C e l l o b i o s e 1 8 0 } 梢草木报褚 H。 0水杨索 s a l玉e i n 6 7 } R i c e s t r a w x y l a n H B
3 期 曾宇成等 : 海枣曲霉 口一葡萄糖普酶的催化性质
(五 ) D 一 葡萄枪的抑制类型与抑制常数
1
.
Li n ew ea ve r
一 B u kr 作图法 : 按测 K m 值的同样方法测定存在抑制剂与否时 (抑制剂
的终浓度为 2. sm m ol /L , p N P 一口一 g k 的浓度为 0 .卜 s m m ol / L ) 酶的水解活力 , 并计算反应
速度 。 将结果按 iL ne we va er 一 B u kr 法作图 (图 3 ) 。 反应体系中存在不存在 D 一葡萄糖时 ,
月一 葡萄糖普酶水解 p N P 一口一 gl c 的双倒数曲线显示 , D 一 葡萄糖对 尽一葡萄糖昔酶有竟争
性抑制作用 , 抑制常数 K : 为 3 . o m m ol / L 。
2
.
D议 o n 作图法 : 按常法于 65 ℃测定反应体系中存在 于 15 ~ ol / L D 一葡萄糖时 口一葡萄糖昔酶水解 1~ ol / L 和 Zm m ol / L p N P 一口一 gl 。 的活力
。 将结果按 D ix o n 法作图 (图
4 )
。 结果表明 , D 一 葡萄糖对 口一葡萄糖昔酶显示竟争性抑制作用 , 其 K : 值为 3 . 4~ ol / L
。
上述结果表明 , 由 iL n e w e va er 一 B u kr 作图法与 D ix o n 作图法所得结果基本一致 。
4 5 0 r .
4 5 0卜0 .
卜 30 0
15 0 30 0
,
/【5 1
4 5 0 即 0 10 0 15 0
v / [5 1
塑 ’
F 19
·
口一葡萄糖昔酶对 p N P 一 口一 gl c 水解的 、 v o o if 图 图 2 口一葡萄精曹醉水解纤维二褚的 w o o lf 图
W o o l f p l o t fo
r t h e h y d r o ly
s i s o f p N P 一口一 g l e F i g . 2 W 6 o l f P lo t fo r t h e h y d r o ly s i s o f e e l l u b io o e b y
b y 口一 g l u e o s id a s e 口一 g l u e o s id a s e
óa
,。工x
ǎ?。lxà工ó
一 1 0 2 3 4 5
「S ]一 ’ ( m m o l / L )一 ,
一 9 一 6 一 3 0 3 6 9 12 生5
图 3 D 一葡萄糖存在时 . 口一葡萄精曹酶水解 p N P 一口
一 g l e 的 L i n e w e a v e r 一 B u r k 图
F 19
.
3 L i n e we va
e r 一 B u r k p l o t fo r t h e h y d r o l y s i s o f
p N P 一口一 g l e b y 口一 g l u e o o id as e i n t h e p r e s e n e e o f D
一 9 l u c o s e
1
.
0 一葡萄掩 D 一 g l u e o o e ; 2 . 对照 C o n t r o l
[n ( m m
o l / L )
图 4
卜’ 19
D 一荀萄掩对 口一荀萄枪昔醉抑制作用的 D i x o n 图
4 D i x o n P l o t fo
r t h e i n h ib 宜t i o n o f D 一 g l u e o s e
o n 口一 9 l u e o s i d a s e
p N P 一口一 g l e e o n e e n t r a t i o n : 1 . l m m o l ; 2 . Z m m o l / L
参
【1 」 曾 ` 补成 、 张树政 : 徽生物学报 , , 州 s) , 19 5一
考
1 9 9
-
文 献
186 微 生 物 学 报3 3 卷
曾宇成 、 张树政: 至物化学杂志 , 3 , 5 5 2一 560 , 1 98 7 .
曾宇成 、 张树政 : 生物化学杂志 , 4 (2 ) , 1 0 9 一 1 1 5 , 1 9 8 8 ·
w压r k m a n . w . E . a n d n . F . o ay : 月 p p 一 召。 t, ` , 。 . 材` e , “ 0 1. , `一 : 1 2 5 9 一 1 2 9 5 , i g a 2 .
S h e m a le
, J
.
G
.
a n d J
.
C
.
S ad
a n a : A代 h s . B 愁o e h e m , B 坛o p h , s 、 2 0 7 : 1 8 5 一 1 9 6 , 19 5 1 .
D .e h P a n d e
, V
.
e t a l
.
:
E 钻 r
.
J
.
B坛o e h e m . , 9 0 : 19 1一 1 9 8 , 1 9 78
K i n g
,
K W
.
e t a l
.
: A p P己. 材垃e伪 b坛0 1. , 1 1 : 3 1 5一 3 1 9 , 1 9 6 3 .
B u e h t
,
B
.
a n d
.
K
.
E
. 召月儿. J o n : A沈h s . B 坛o e h e m . B 云o p 人, . , 1 2 9 : 4 19 一 4 2 0 , 196 9 .
W匕o d w a r d , J . : 名” z ,饥已 M坛e阳 b . 几 e h n o l . , 4 : 7 3 一 7 9 , 1 9 5 2 -
G u s se m
,
R
.
D 二 t a l . : B 板o e h `m B 饭o p h , 一 A e 亡a . , 肠2 9 : 14 2一 15 3 , 19 7 8 .
U z i i e
,
M
.
e t a l
.
: A , r
.
B `o l . C九e瓜 , 心9 : 1 1 5 9 一 1 1 66 , 1 9 8 5 -
S t e r n b e r g
, D
.
e t a l
.
:
C O 帷 . J
.
M 云e , b板0 1
.
, 2 3 : 1 3 9 一 1 4 7 , 1 9 7 7
23峨5670102
C A T A L Y T I C P R O P E R J
,
I E S O F 口一 G L U C O S I D A S E F R O M
A S尸 E R G I L L U S P H O E N I C I S
Z e n g uY
e h e n g Z h a n g Shu
z
he n g
(几 s t云to t e oj 桥 e 、 b`0 109 , , A e a d e二` a s 云。云ca , B e访。夕 1 00 0 80 )
S u b s t r a t e s P e e访 e i t i es a n d i n h ib i t o r s o f t h e P ur 访ed 口一 g l u e o s id as e fr o m A SP 。印葱11、 s
p h oe n `e幼 we r e in v es t i g a t e d
.
T h e r e l a t iv e a e t iv it y o f 尽一 g l u e o s i d as e t ow a r d 卜 n i t r o p h e叮 l
口一 g l u e o s i d e , e e l l u b i o s e a dn s a il e i n we r e 1 0 0 , 1 80 a n d 6 7 . 3 . T h e K m v a lue s fo r -P in t r o p he 叮 l
口一 g l u e o s id e a n d e e l u b i o s e we r e 0 . 9 7uon
l / L
a n d 1
.
s
mzn
o l / L
, r es p ec t i v e ly
.
T h e V m ax
va l
u
es we
r e 57 6拼m o l·而 n 一 1 ·毗一 1 a n d 59 5拼m o l·un 一 1
·
m g 一 1
, r es p e e t ive l y
.
T h e e n z y m e
ac t iv i t y was
i n h ib i t e d by A g
+ , D 一 g lu e o s e
, e e l u b i o s e
.
T h e K ` fo r D 一 g l u e o s e w as 3 0
uon
l / L (3
.
4
uon
l / L ) as d
e t e r而 n e d by L e en we vae r 一 B ur k p l o t (D ix o n p l o t ) . T h e e n z y me
was
s t r o n g ly i n h i b i t e d by D
一 g l u e o n o 一石一 lac t o n e .
K
e y
wo
r d s A , p e份葱l份 5 p h oe n `e`s ; 口一 g l u e o s i d as e : S u b s t r a t e s p e e iif e i t y ; In h ib i t o r s
与