全 文 ：书收稿日期:2013 － 04 － 15 修回日期:2013 － 06 － 20
基金项目:福建省科技厅资助项目(2009N0006、2011N5002)．
作者简介:黄树军(1989 －)，男，硕士研究生．研究方向:森林培育． Email:fjhsj1989@ 163． com．通讯作者郑郁善(1960 －)，男，教授，博士生导
师．研究方向:森林培育． Email:zys1960@ 163． com．
大明竹属部分植物 ISSＲ-PCＲ反应体系
优化及有效引物筛选
黄树军1，黄 婷1，肖永太2，荣俊冬1，杨 阳1，何天友2，陈凌艳2，郑郁善1，2
(1．福建农林大学林学院;2．福建农林大学园林学院，福建 福州 350002)
摘要:采用单因素试验方法，建立了适合大明竹属 25 个竹种的 ISSＲ-PCＲ 反应体系，优化了各影响因子的用量，筛选出 18
条有效引物，并确定它们的退火温度，最后对体系进行了检验．优化后大明竹属植物 ISSＲ-PCＲ的 20 μL反应体系含 2．0 μL
10 × PCＲ Buffer、2．5 mmol·L －1 Mg2 +、0．15 mmol·L －1 dNTPs、0．5 μmol·L －1引物、1．0 U Tap DNA聚合酶、50 ng模板 DNA、
10．6 μL灭菌 ddH2O．扩增程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 60 s，55 ℃复性 45 s，72 ℃延伸 90 s，循环 40 次;72 ℃延伸
7 min，4 ℃保存．该 ISSＲ-PCＲ反应体系可用于大明竹属部分植物的遗传多样性及遗传结构研究．
关键词:大明竹属;ISSＲ;影响因子;体系优化;引物筛选
中图分类号:S795 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2013)06-0616-07
Optimization of ISSＲ-PCＲ reaction system and selection of effective primers
for ISSＲ marker in some species of Pleioblastus
HUANG Shu-jun1，HUANG Ting1，XIAO Yong-tai2，ＲONG Jun-dong1，
YANG Yang1，HE Tian-you2，CHEN Ling-yan2，ZHENG Yu-shan1，2
(1． College of Forestry;2． College of Landscape，Fujian Agriculture
and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China)
Abstract:By using single factor test method，the ISSＲ-PCＲ reaction system suitable for 25 kinds of bamboo in Pleioblastus were es-
tablished;the availability of every influence factor was optimized;besides，18 effective primers were screened and their annealing
temperatures were identified to test the system． In conclusion，the optimizational ISSＲ-PCＲ 20 μL reaction system of bamboos in
some species of Pleioblastus was 2．0 μL 10 × Buffer，2．5 mmol·L －1 Mg2 +，0．15 mmol·L －1 dNTPs，0．5 μmol·L －1 primers，
1．0 U DNA polymerase，50 ng DNA template，10．6 μL sterile ddH2O;in the reaction process of 94 ℃ for 5 min，40 circles (94
℃ for 60 s，55 ℃ for 45 s ＆ 72 ℃ for 1．5 min)，72 ℃ for 7 min． The ISSＲ-PCＲ reaction system can be used in the study of ge-
netic diversity and genetic structure of 25 kinds of bamboo in Pleioblastus．
Key words:Pleioblastus;ISSＲ;influence factor;optimization system;screening of primers
大明竹属(Pleioblastus)植物隶属竹亚科(Bambusoideae)，我国有 20 余种，多分布于长江中下游各地，
分布零散［1］．该属竹子形态优美，生态净化能力强，为庭园景观绿化的优良植物．
竹类植物的生长发育规律都较为特殊，以花、果实等形态为主的传统植物分类方法对竹子进行分类较
为复杂、困难，竹子分类不一［2 － 4］，学术上颇有争议［5］．随着现代分子生物技术的飞速发展，分子标记技术
在竹子分类及遗传多样性研究方面得到了广泛应用［6 － 11］，从分子水平上辅助分类［12］，有助于解决分类争
议，对鉴定种质资源起重要作用． 简单重复序列间扩增(inter simple sequence repeats，ISSＲ)是由 Zietk-
iewicz提出，具有较好的稳定性及多态性［13］．近年来，ISSＲ 技术对竹类植物的研究报道较多，但关于大明
竹属植物的相关报道不多．目前大明竹属部分植物的分类还存在争议［14］，运用生物技术对大明竹属植物
的种间亲缘关系的研究报道较少．利用 ISSＲ技术可对大明竹属植物的遗传多样性进行研究． ISSＲ技术基
于 PCＲ的扩增，该扩增体系受诸多因素的影响［15］．为了确定 ISSＲ 分析的可靠性，对 ISSＲ-PCＲ 反应体系
及扩增程序优化选择是极有必要的．本试验利用单因素试验方法对大明竹属部分植物的反应体系进行了
DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2013.06.017
优化，建立了适合大明竹属植物的 PCＲ 反应体系及扩增程序，并筛选了 18 条对大明竹属植物有效的引
物，旨在为大明竹属植物的遗传多样性及鉴定分类等方面研究提供参考．
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 样品来源 选取栽植于福建农林大学百竹园大明竹属 25 个竹种(表 1)的嫩叶，每个品种取 3 － 5
株，用冰壶及变色硅胶迅速干燥，并在 － 80 ℃的低温下保存，以备提取 DNA．
表 1 大明竹属 25 个竹种的情况
Table 1 The 25 species of Pleioblastus in the present study
编号 竹种 拉丁名学名 引种地
1 长叶苦竹 P． china f． hisauchii 华安竹类植物园
2 大明竹 P． gramineus (Bean)Nakai 永安竹种园
3 垂枝苦竹 P． amarus (Keng)Keng f． var． pendulifolius S． Y． Chen 永安竹种园
4 光箨苦竹 P． amarus (Keng)Keng f． var． subglabratus S． Y． Chen 永安竹种园
5 庆元苦竹 P． qingyuanensis 永安竹种园
6 白纹东根世 P． chino f． angustifolius 永安竹种园
7 遂昌苦竹 P． suichangensis 永安竹种园
8 白纹女竹 P． simonii f． albostriatus 永安竹种园
9 硬头苦竹 P． longifimbriatus S． Y． Chen 永安竹种园
10 橙绿鞘苦竹 P． dokgyoamus 永安竹种园
11 油苦竹 P． oleosus Wen 华安竹类植物园
12 杭州苦竹 P． amarus var． (Keng)Keng f． var． hangzhouensis S． L． Chen
et S． Y． Chen
华安竹类植物园
13 苦竹 P． amarus (Keng)Keng f． 华安竹类植物园
14 黄条金刚竹 P． kongosanensis f． aureostriaus 华安竹类植物园
15 秋竹 P． gozadakensis Nakai 华安竹类植物园
16 仙居苦竹 P． hsienchuensis Wen 永安竹种园
17 云和苦竹 P． yunhoensis 华安竹类植物园
18 斑苦竹 P． maculates (McClure)C． D． Chu et C． S． Chao 永安竹种园
19 衢县苦竹 P． juxianensis Wen 永安竹种园
20 华丝竹 P． intermedius S． Y． Chen 永安竹种园
21 丽水苦竹 P． maculosoides Wen 永安竹种园
22 宜兴苦竹 P． yixingensis S． L． Chen et S． Y． Chen 华安竹类植物园
23 实心苦竹 P． longifimbriatus S． Y． Chen 华安竹类植物园
24 螺节竹 P． graminens f． manstopiral 安吉竹博园
25 皱苦竹 P． rugatus Wen et S． Y． Chen 华安竹类植物园
1．1．2 仪器 主要仪器有 LabCycler PCＲ 仪、DYY-8C 电泳仪、DYCP-31DN 电泳槽、JS-680 全自动数码凝
胶成像分析仪等．
1．1．3 试剂 10 × PCＲ Buffer、Taq DNA 聚合酶、ＲNA 酶、DNA Ladder Marker、dNTPs Mixture、MgCl2、100
条随机引物(哥伦比亚大学公布)、琼脂糖等购于上海生工生物工程技术服务有限公司;核酸染料 Gold
View购于上海赛百盛公司;液氮购于福州市第二化工厂;硼酸、无水乙醇、溴酚蓝、三羟基氨基甲烷、乙二
胺四乙酸二钠、蔗糖均为国产分析纯．
1．2 基因组 DNA的提取
大明竹属植物基因组 DNA采用杭州博日公司 Biospin植物基因组 DNA提取试剂盒(Cat#BSCl3S1)提
取［16 － 17］，所提取的 DNA的完整性、浓度、纯度经电泳及紫外分光光度计测定，满足试验要求，并保存于
－ 20 ℃的冰箱中供 ISSＲ分析．
1．3 ISSＲ反应体系及扩增程序的建立及优化
1．3．1 ISSＲ-PCＲ原初体系及扩增程序的建立 参考孙志娟等［18］的方法，将 PCＲ反应体积设定为 20 μL，
含 40 ng模板 DNA、0．5 μmol·L －1引物、0．5 mmol·L －1 dNTPs、2 μL 10 × PCＲ Buffer、1．0 U Taq DNA聚合
酶、2．0 mmol·L －1 Mg2 + ．筛选时所应用的扩增程序固定为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s，55 ℃复性
·716·第 6 期 黄树军等:大明竹属部分植物 ISSＲ-PCＲ反应体系优化及有效引物筛选
30 s，72 ℃延伸 90 s，循环 40 次;72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存．
1．3．2 ISSＲ-PCＲ反应体系的优化 以大明竹属 25 个竹种的 DNA样品为模板，利用 UBC811 引物在 Lab-
Cycler PCＲ仪上筛选 ISSＲ扩增体系．以建立的 ISSＲ-PCＲ原初体系为基础，设计不同浓度(用量)的 Mg2 +、
Taq DNA聚合酶、引物、dNTPs、模板 DNA(表 2) ，每次扩增改变其中的某一因子，研究此因子对 ISSＲ扩增
反应的影响，确定各因子浓度(用量)并综合检验体系的扩增效果．
表 2 ISSＲ扩增体系筛选1)
Table 2 Design of optimal ISSＲ reaction system
水平因子
Mg2 +
mmol·L －1
Taq DNA聚合酶
U
引物
μmol·L －1
dNTPs
mmol·L －1
模板 DNA
ng
1 1．0 0．50 0．1 0．05 10
2 1．5 0．75 0．2 0．10 20
3 2．0 1．00 0．3 0．15 40
4 2．5 1．25 0．4 0．20 50
5 3．0 1．50 0．5 0．25 60
6 － 1．75 0．6 0．30 80
7 － 2．00 0．7 0．35 100
1)－表示单因素试验处理不存在．
1．4 ISSＲ有效引物的筛选及反应体系的检验
用 100 条随机引物对任意一份 DNA样品进行 PCＲ扩增，在已优化的反应体系及扩增程序下进行．对
扩增产物进行电泳，并于凝胶成像分析仪上观察拍照，筛选有效的 ISSＲ 引物．有效引物需符合如下条件:
(1)条带清晰，不模糊，不弥散;(2)空白中无或少假带;(3)对所有样品均有质量好的条带．以大明竹属 25
个竹种提取的 DNA 作为模版，用筛选过的 ISSＲ 引物在已优化的反应体系及扩增程序下进行 PCＲ 扩增，
检验其效果及重复性．
1．5 ISSＲ有效引物退火温度的确定
对筛选过的随机引物，依据 Tm = 2 ×(A + T)－ 4 ×(C + G)确定引物的理论退火温度．式中，Tm 表示
DNA的溶解温度，A表示腺嘌呤个数，T表示胸腺嘧啶个数，C 表示胞嘧啶个数，G 表示鸟嘌呤个数．在比
引物 Tm低 5 ℃的基础上，设置 6 个退火温度梯度，在已优化的反应体系及扩增程序下进行 PCＲ 扩增，确
定引物的最佳退火温度．
2 结果与分析
2．1 ISSＲ反应体系的建立
2．1．1 扩增程序的优化 PCＲ扩增程序分为变性、复性和延伸 3 个阶段，对扩增时间、温度及循环次数进
行优化．不同物种的变性和延伸温度一般差别不大，变性温度为 94 － 95 ℃，延伸温度为 72 ℃;复性温度是
影响特异性的重要因子;循环次数对扩增量也有影响，一般在 35 － 40 个循环．经过 UBC811 引物的初步筛
选，在原扩增程序的基础上确定大明竹属植物的扩增程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 60 s，55 ℃复
性 45 s，72 ℃延伸 90 s，循环 40 次;72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存．
2．1．2 Mg2 +浓度的确定 Mg2 +是 Taq DNA聚合酶维持活性的重要因素． Mg2 +浓度不但对酶活性和忠实
性有影响，还影响产物的特异性、产物与模板的解链温度、引物退火、引物二聚体形成等．若 Mg2 +浓度过高
会增加非特异性扩增产物，使条带模糊;若 Mg2 +浓度过低则 Taq DNA 聚合酶的扩增效率较低，扩增产物
就少．从图 1 可以看出:Mg2 +浓度为 2．0 和 2．5 mmol·L －1时可扩增出较清晰的条带，其中以 2．5 mmol·
L －1扩增的条带多态性和亮度最好;当 Mg2 +浓度大于或小于 2．5 mmol·L －1时，条带的多态性和清晰度均
较差．可见，Mg2 +浓度对扩增结果有较大的影响，对 PCＲ扩增极为重要．
2．1．3 Taq DNA聚合酶用量的确定 Taq DNA聚合酶的作用是将 dNTPs 添加到双链 DNA 引物链上，使
聚合形成新 DNA链． Taq DNA聚合酶的用量由酶活性、反应体积、酶耐热性等因素决定．若 Taq DNA聚合
酶用量过高，容易造成非特异性扩增［1］，过低则造成扩增产物少．从图 2 可以看出，Taq DNA聚合酶用量低
于 1．0 U时，其扩增强度弱，而 0．5 U的用量则没有扩增结果．这可能是由于 Mg2 +浓度固定时，Taq DNA聚合
·816· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷
酶的减少会使 Mg2 +对酶的激活能力相对减弱，导致扩增量下降．当 Taq DNA聚合酶用量为 1．0 U时，扩增条
带最多;当用量大于 1．0 U时，条带变少，造成了非特异性扩增．可见，Taq DNA聚合酶的用量以 1．0 U为宜．
M:Marker;1 － 5:Mg2 +的浓度分别为 1．0、
1．5、2．0、2．5、3．0 mmol·L －1 ．
图 1 Mg2 +浓度对 ISSＲ扩增的影响
Fig． 1 The effect of concentration of Mg2 +
on the amplification of ISSＲ
M:Marker;1 － 7:Taq DNA聚合酶的用量分别为 0．50、
0．75、1．00、1．25、1．50、1．75、2．00 U．
图 2 Taq DNA聚合酶用量对 ISSＲ扩增的影响
Fig． 2 The effect of concentration of Taq DNA polymerases
on the amplification of lSSＲ
2．1．4 dNTPs浓度的确定 dNTPs是 PCＲ扩增的底物，dNTPs浓度对扩增条带的数量及亮度存在较大影
响． dNTPs浓度过低会导致引物与底物的酶促反应速度下降，扩增量减少;dNTPs 浓度过高，一方面会与
Mg2 +发生鳌合，使 Mg2 +浓度降低，从而影响 Taq DNA聚合酶的活性，另一方面会导致碱基错配，降低产物
的特异性．因此，确定 dNTPs的浓度是非常重要的．图 3 表明:dNTPs 浓度为 0．15 mmol·L －1时，扩增条带
清晰且带数多，效果最好;浓度高于 0．15 mmol·L －1时，扩增条带则变浅，部分条带消失，这可能是由于抑
制了 Taq DNA聚合酶的活性从而影响了扩增效果;浓度低于 0．15 mmol·L －1时，扩增条带数变少，且呈弥
散状，这可能是由于 Mg2 +不能有效激活 Taq DNA聚合酶，导致扩增量减少．可见，dNTPs浓度以 0．15 mmol
·L －1为宜．
2．1．5 引物浓度的确定 引物浓度偏高时容易导致引物之间形成二聚体，还容易引起非特异性扩增及错
配，同时引物之间会产生竞争，使扩增量大幅下降;引物浓度过低时，引物与模板 DNA结合的机率降低，反
应提前结束，使扩增条带变浅甚至没有条带．图 4 表明:引物浓度为 0．1 和 0．2 μmol·L －1时，没有出现扩
增条带;浓度为 0．3 和 0．4 μmol·L －1时出现不清晰条带;当浓度大于 0．5 μmol·L －1时，条带很亮但背景
模糊，这可能由非特异性扩增导致．经综合考虑，引物浓度以 0．5 μmol·L －1为宜．
M:Marker;1 － 7:dNTPs的浓度分别为 0．05、0．10、
0．15、0．20、0．25、0．30、0．35 mmol·L －1 ．
图 3 dNTPs浓度对 ISSＲ扩增的影响
Fig． 3 The effect of concentration of dNTP
on the amplification of lSSＲ
M:Marker;1 － 7:引物的浓度分别为 0．1、0．2、
0．3、0．4、0．5、0．6、0．7 μmol·L －1 ．
图 4 引物浓度对 ISSＲ扩增的影响
Fig． 4 The effect of concentration of primer
on the amplification of lSSＲ
·916·第 6 期 黄树军等:大明竹属部分植物 ISSＲ-PCＲ反应体系优化及有效引物筛选
M:Marker;1 － 7:模板 DNA的用量分别为 10、20、40、50、60、80、100 ng．
图 5 模板 DNA用量对 ISSＲ扩增影响
Fig． 5 The effect of concentration of DNA template on the amplification of lSSＲ
2．1．6 模板 DNA 用量的确定 PCＲ 扩增对
模板 DNA用量及纯度的要求不高，仅 2 个拷
贝模板或细胞粗提物即可进行 PCＲ 扩增． 但
为了确保扩增效率及特异性，仍需一定量的
模板 DNA，以避免交叉污染导致反应失败．图
5 表明，模板 DNA用量为 10 － 100 ng时，条带
的清晰度相似，表明模板 DNA 用量对扩增效
果的影响较小，较大范围的用量均能扩增出
清晰条带． 但当模板 DNA 用量不足时，会降
低扩增效率，引物与模板有效配对较难;若模
板 DNA 用量太大，引物耗尽过早，会造成退
火发生在 PCＲ 产物 3端与模板间或产物间，
导致延伸中止，条带呈弥散状．根据图 5 中条
带的清晰度，模板 DNA用量以 50 ng为宜．
2．1．7 ISSＲ-PCＲ反应体系各因子的终浓度(用量) 采用单因素试验方法，对影响 PCＲ扩增的 5 个因子
进行优化并检验，最终确立大明竹属植物 20 μL 反应体系含 50 ng 模板 DNA、0． 5 μmol·L －1引物、0． 15
mmol·L －1 dNTPs、2 μL 10 × PCＲ Buffer、1．0 U Taq DNA聚合酶、2．5 mmol·L －1 Mg2 + ．
2．2 有效引物的筛选
利用已优化的大明竹属植物 ISSＲ-PCＲ反应体系及扩增程序，对选取的 100 条随机引物进行筛选(图
6) ，最终筛选出 18 条条带清晰、多态性丰富且重复性高的有效引物(表 3)．
M为 Marker;1 － 20 为部分引物的样本号．
图 6 大明竹属植物部分引物的 ISSＲ扩增电泳图谱
Fig． 6 Electrophoretogram of ISSＲ amplification of some primers in Pleioblastus
2．3 退火温度的确定
退火温度会影响扩增条带的带谱，与引物及物种的序列相关［19］．退火温度一般设定比引物的理论退
火温度低 5 ℃，然后以 2 ℃的幅度逐级增大．退火温度较高时会影响引物二聚体和非特异性产物的形成，
可在设定的较高退火温度下先进行 5 个循环，再在较低的温度下进行余下循环来提高产物的特异性． ISSＲ
引物对退火温度的要求严格，每一条引物的退火温度不尽相同．退火温度越高，产物的特异性就越高，但扩
增量就会减少;反之，温度越低，则扩增量越高，但容易引起引物与模板错配．根据上述规律，确定已筛选的
18 条 ISSＲ引物的最适退火温度为 49．2 － 55．2 ℃(表 3)．
2．4 ISSＲ有效引物及优化体系的检验
以大明竹属 25 个竹种的 DNA为模版，用筛选过的 ISSＲ引物在已优化的反应体系及扩增程序下进行
PCＲ扩增，扩增条带清晰度高、多态性丰富、重复性高(图 7)．
·026· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷
表 3 大明竹属植物的 ISSＲ有效引物
Table 3 The sequence of ISSＲ primers in Pleioblastus
引物编号 碱基序列(5 － 3) 退火温度℃
扩增条带总数
多态位点数
UBC807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 52．8 9 /8
UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGA 54．5 8 /7
UBC811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 54．5 10 /9
UBC812 GAGAGAGAGAGAGAGAA 54．5 9 /8
UBC815 CTCTCTCTCTCTCTCTG 54．5 9 /9
UBC825 ACACACACACACACAC 54．5 8 /6
UBC826 ACACACACACACACACC 55．2 8 /7
UBC827 ACACACACACACACACG 54．5 8 /8
UBC828 TGTGTGTGTGTGTGTGA 52．8 7 /7
UBC835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 50．0 9 /7
UBC836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA 49．2 10 /8
UBC840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 51．9 11 /10
UBC841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 53．5 8 /7
UBC843 CTCTCTCTCTCTCTCTＲA 52．8 8 /8
UBC844 CTCTCTCTCTCTCTCTＲC 52．6 11 /9
UBC888 BDBCACACACACACACA 53．6 8 /7
UBC889 DBDACACACACACACAC 52．5 7 /6
UBC895 AGAGTTGGTAGCTCTTGATC 53．7 7 /6
M为 Marker;1 － 25 为大明竹属植物的样本号(与表 1 的编号对应)．
图 7 引物 UBC840 对大明竹属植物的 ISSＲ扩增电泳图谱
Fig． 7 The electrophoretogram of ISSＲ amplification by primer UBC840 for Pleioblastus
3 讨论与结论
影响 PCＲ扩增的因素很多，有效性、特异性及忠实性为检验扩增效果的指标，但高特异性的影响因子
可能与高扩增量的影响因子存在差异，因此在建立 PCＲ反应体系时，需要确定哪些参数指标最重要，并据
此优化反应条件．在 PCＲ 反应体系的建立及优化中，单因素试验方法得到了广泛的应用［20 － 21］，但因单因
素试验没有考虑各因子的交互作用，因此略有缺陷．正交试验恰好能弥补此缺陷，这种方法已逐渐在该领
域应用［22 － 24］．正交试验虽然可确定各因子影响的主次关系，但其对技术要求高，加样时间较长，可能易引
起模板断裂或 Taq DNA 聚合酶失活，影响扩增结果．本试验在前人研究的基础上，以大明竹属 25 个竹种
的 DNA为模板，UBC811 为引物，采用单因素试验方法，先对反应体系及扩增程序进行优化，确定各因子
浓度(用量)后进行扩增检验;在已优化反应体系及扩增程序的基础上，对有效引物进行筛选，并确定引物
的退火温度;以大明竹属 25 个竹种的 DNA为模版，用 18 条 ISSＲ引物在已优化的反应体系及扩增程序下
进行扩增．
本试验采用单因素试验方法，对影响大明竹属植物 PCＲ 反应的各因子及扩增程序进行了优化，建立
了 ISSＲ反应体系，并从初选的 100 条引物中筛选出 18 条条带清晰、多态性好、重复性高的有效引物，为
ISSＲ分析大明竹属植物的遗传多样性及遗传结构提供参考． 优化后的大明竹属植物 ISSＲ-PCＲ 的 20 μL
反应体系含 2．0 μL 10 × PCＲ Buffer、2．5 mmol·L －1 Mg2 +、0．15 mmol·L －1 dNTPs、0．5 μmol·L －1引物、1．0
·126·第 6 期 黄树军等:大明竹属部分植物 ISSＲ-PCＲ反应体系优化及有效引物筛选
U Tap DNA聚合酶、50 ng模板 DNA、10．6 μL灭菌 ddH2O．扩增程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 60 s，
55 ℃复性 45 s，72 ℃延伸 90 s，循环 40 次;72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存．
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(责任编辑:施晓棠)
·226· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷