全 文 ：23卷 6期 草　业　科　学 99　
Vol. 23 , No. 6 PRAT ACULT URA L SCIENCE 6 /2006
高羊茅愈伤组织诱导及植株再生的研究
王维飞 ,韩烈保 ,曾会明
(北京林业大学草坪研究所 ,北京 100083)
摘要:对高羊茅 Festuca arundinacea 4个品种的成熟种子进行了愈伤组织诱导及植株再生的研究 , 建立了
高羊茅的组织培养体系。结果表明:1)外植体种子的消毒程序以“次氯酸钠(活性氯≥5%)1 h+无菌水搅拌
去皮”最佳;2)4 个高羊茅品种以“千年盛世”在愈伤诱导中优势最突出;3)“千年盛世”愈伤诱导的适宜培养
基为:MS+9 mg /L 2 , 4-D+300 mg /L水解酪蛋白;4)愈伤组织再生培养基中 6-BA 的适宜浓度为 0. 05 mg / L ,
K T 的适宜浓度为 0. 2 mg / L。
关键词:高羊茅;愈伤组织;植株再生;培养基;2 , 4-D;6-BA;KT
中图分类号:S543+. 903. 53　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-0629(2006)06-0099-05
*　高羊茅 Festuca arundinacea 又称苇状羊茅 ,
是一种多年生冷季型草坪草。高羊茅具有许多的
优良性状 ,如耐干旱性 、耐盐碱性强等 ,可适应于
多种土壤和气候条件 。在城市绿化和运动场地的
建设中应用广泛 。但高羊茅也存在诸如叶片粗糙
等缺陷 ,因此迫切需要克服上述缺点 ,育成抗病 、
抗虫 、更美观的品种 。基因工程技术即将抗逆功
能基因有目的 、有针对性地导入特定品种的愈伤
组织或原生质体 ,获得改良的转基因植物 ,提高草
坪草的抗逆性[ 1] 。为此 ,通过转基因技术来达到
改良草坪草这一目的正强烈地吸引着国内外学者
的关注。用转基因技术来改良高羊茅的一个先决
条件是必须建立组织培养体系 ,高羊茅的组织培
养难点在于高羊茅共生着一种顶孢霉 Acre moni-
um coenophialum 真菌 。外植体诱导时容易污
染 ,出愈时间过长及分化率低等[ 2] 。本文旨在通
过改进外植体灭菌方法 、调节 2 , 4-D 等激素浓度
配比 ,优化愈伤诱导 、分化条件 ,建立较完善的组
织培养分化体系 ,为转基因研究做准备 。
1　材料与方法
1. 1 材料　高羊茅成熟种子:猎狗 5号(Hound-
og5)、交战 Ⅱ号(C ro ssfireⅡ)、凌志(Barlex as)和
千年盛世(Millennium)。其中猎狗 5号和交战Ⅱ
号由北京中种草业有限公司提供 ,凌志由百绿集
团提供 ,千年盛世由北京绿冠草业科技发展中心
提供 。
1. 2 方法
1. 2. 1外植体的消毒方法研究　取适量 4个品种
高羊茅种子分别于 50 mL 离心管中 ,然后用 3种
方式消毒:
A:成熟种子+适量次氯酸钠溶液(活性氯≥
5. 0%)+2滴吐温(Tw een20),消毒 2 h ,期间以
磁力搅拌器不断搅动 ,无菌水清洗 4 ～ 5次。
B:机械磨去种皮后的种子+适量次氯酸
钠溶液(活性氯≥5. 0%)+2 滴吐温 ,消毒1 h ,
期间以磁力搅拌器不停搅动 , 用无菌水清洗
4 ～ 5次 。
C:成熟种子+适量次氯酸钠溶液(活性氯≥
5. 0%)+2滴吐温 ,磁力搅拌器不停搅动过程中
消毒 1 h后 ,用无菌水清洗 4 ～ 5次 ,然后注入无
菌水以磁力搅拌器充分搅拌直至种皮脱落 ,无菌
水冲洗 4 ～ 5次 。
消毒完毕后将种子接种到愈伤组织诱导培养
基(MS基本培养基+9 mg /L 2 ,4-D +30 g /L 蔗
糖+7 g /L 琼脂)置于 26 ℃下暗培养 , 3 ～ 5 d萌
发后将芽从基部拔除 ,30 d后观察出愈情况 。
* 收稿日期:2005-05-15
基金项目:国家转基因植物研究与产业化专项项目(J2002-B-
006);国家“ 863”项目(2001AA244082);新世纪优
秀人才支持计划
作者简介:王维飞(1981-),女 ,山东滨州人 ,在读硕士生。
E mai l:sixiang810701@163. net
通讯作者:韩烈保　E m ail:han lb@public. bta. n et. cn
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1. 2. 2不同品种之间愈伤组织诱导间的差异　将
消毒后的 4个品种的种子在超净工作台中直接接
种在愈伤组织诱导培养基上 , 每盘 40 粒(图
1-A),置于 26 ℃下暗培养 , 3 ～ 5 d萌发出芽(图
1-B)后将芽去除 , 30 d 后统计出愈情况并继代培
养(图 1-C)。
图 1　种子在愈伤组织诱导培养基上的发育过程
1. 2. 3 不同浓度 2 ,4-D，6-BA及不同量水解酪蛋
白对愈伤组织诱导的影响　将消毒后的 4个品种
的种子在超净工作台中分别接种在按正交试验设
计[ 3]的 16 种愈伤诱导培养基上 。每盘接种 40
粒 ,每种培养基设 3个重复 ,置于28 ℃下暗培养 ,
3 ～ 5 d出芽后将芽去除 ,30 d后统计出愈情况并
继代培养 。2 ,4-D , 6-BA ,水解酪蛋白用量及品种
的正交设计表如表 1所示 。
1. 2. 4不同浓度 6-BA，KT 对愈伤组织再生植株
的影响　在 MS 基本培养基中分别添加浓度梯度
为 0 , 0. 05 , 0. 1 , 0. 2 , 0. 3 mg /L 的 KT 及浓度梯
度为 0. 05 ,0. 1 , 0. 2 , 0. 3 mg /L 的 6-BA 。共配制
成 9种再生培养基。将继代培养后的愈伤组织转
表 1　2 , 4-D , 6-BA水解酪蛋白用量及品种的正交设计
试号 2 , 4-D 浓度(mg / L)
6-BA
(mg / L)
水解酪蛋白
(mg /L) 品种
1 5 0 0 千年盛世
2 5 0. 1 100 交战Ⅱ号
3 5 0. 2 300 猎狗 5 号
4 5 0. 5 500 凌志
5 7 0 100 猎狗 5 号
6 7 0. 1 0 凌志
7 7 0. 2 500 千年盛世
8 7 0. 5 300 交战Ⅱ号
9 9 0 300 凌志
10 9 0. 1 500 猎狗 5 号
11 9 0. 2 0 交战Ⅱ号
12 9 0. 5 100 千年盛世
13 12 0 500 交战Ⅱ号
14 12 0. 1 300 千年盛世
15 12 0. 2 100 凌志
16 12 0. 5 0 猎狗 5 号
入上述培养基上 ,每种培养基设 5个重复 ,每个培
养基上挑取 40块愈伤 ,置于光下培养 ,光照时间
16 h /d ,温度 25 ～ 28 ℃,光强 2 000 ～ 3 000 Lx ,
20 d后统计再生情况。
1. 3 数据统计　试验对种子愈伤组织诱导率 、
胚性愈伤组织诱导率 、再生植株率进行了统计 ,如
下所示:
愈伤组织诱导率=(愈伤组织块数 /接种种子
数)×100%,即出愈率。
胚性愈伤组织诱导率=(胚性愈伤组织块数 /
愈伤组织块数)×100%。
再生植株率=(再生植株数 /愈伤组织块数)×
100%,即出苗率。
2　结果与分析
2. 1 种子消毒方法分析　由表 2可知 ,次氯酸
钠 2 h的出愈率仅 12. 5%,而次氯酸钠 1 h的出
愈率则高达 64. 5%,说明用次氯酸钠消毒 2 h已
对种子造成了伤害 ,使出愈率降低 。可见 ,次氯酸
钠消毒 1 h是较适宜的消毒时间 ,而处理 C 与处
理 B相比较 ,处理 C 的出愈率几乎接近处理 B的
2倍 ,这与种子去皮方式有关。处理 B中用机械
把种子的种皮磨去对种子损坏过大 ,观察发现有
些种子断裂 ,甚至被磨碎 ,使种子失去活性。而处
理 C中 ,经次氯酸钠消毒 1 h后种皮已变软 ,再用
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表 2　不同消毒方法的种子愈伤诱导情况
出愈数
A B C
出愈率(%)
A B C
重复 1 6 13 35 15 32. 5 87. 5
重复 2 6 8 31 15 20 77. 5
重复 3 2 18 26 5 45 65
重复 4 8 13 18 20 32. 5 45
重复 5 3 19 19 7. 5 47. 5 17. 5
平均 5 14. 2 25. 8 12. 5 35. 5 64. 5
无菌水搅拌很快就将种皮除去且对种子活力影响
不大 ,故出愈率高 。由上可见种子消毒处理方式
C“次氯酸钠(≥5%)1 h+无菌水震荡去皮”是较
好的消毒方法 。
2. 2 不同品种之间愈伤组织诱导间的差异
　高羊茅不同品种接种到同一培养基上 ,其出愈
率 、胚性愈伤诱导率及愈伤的状态都有很大的差
异 ,其结果见表 3 。
不同品种具有不同的基因型 ,而基因型又受
体内多种激素的控制[ 4] 。4个品种均诱导出愈伤
组织 ,并产生大量的芽和根 ,诱导出的愈伤组织因
基因型而异 ,不同程度的表现为松软 、水渍状 ,甚
至会呈现透明状。其中交战Ⅱ号与千年盛世的出
愈率及胚性愈伤诱导率均较高 ,而猎狗 5号的出
愈率及胚性愈伤诱导率最低。
表 3　不同品种愈伤组织诱导间的差异
品种 接种数 出愈数 胚性愈伤数 出愈率(%)
胚性愈伤
诱导率(%) 愈伤组织状态
交战Ⅱ号 880 708 16 80. 45 1. 82 直径大 ,白色至淡黄色 , 白色水 ,淡黄色致密颗粒状
猎狗 5 号 760 392 7 51. 58 0. 92 愈伤特小 ,透明水状
凌志 640 393 3 61. 41 0. 47 直径中等 ,白色至黄色 , 白色水状 ,黄色致密
千年盛世 960 685 24 71. 35 2. 50 直径大 ,白色至淡黄色 , 淡黄色多且致密颗粒状
2. 3 不同浓度 2 , 4-D , 6-BA 及不同量水解
酪蛋白对愈伤组织诱导的影响　对由表 1
所得的试验结果反正弦后进行极差分析可得图 2。
图 2　4 个不同因素与愈伤诱导率的关系
可以看出 2个正交设计的结果都可得出 2 ,4-
D的最佳浓度为 9 mg /L ,6-BA 的最佳浓度为 0 ,
品种用千年盛世最好 ,且高浓度 12 mg /L 2 , 4-D
对诱导产生抑制 ,6-BA 使愈伤诱导受限制 。
进行方差分析并做多重比较 ,如表 4所示 。可
以看出 2 , 4-D , 6-BA 及品种不同用量间的差异显
著 ,其中 2 , 4-D仅在 0. 05水平上差异显著。多重
比较结果表明 , 2 ,4-D 浓度达到 12 mg /L 时会对
愈伤的诱导产生抑制 ,而当浓度为 5 , 7和 9 mg /L
时 ,各浓度对愈伤组织的诱导的影响的差异性不
显著 ,由于 9 mg /L 时愈伤组织的诱导率的平均
值最大故选取其为最适宜的浓度 。随着6-BA浓
度的增加 ,愈伤诱导率受到抑制 ,当达 0. 5 mg /L
时 ,最明显 。4 个品种间 ,猎狗 5 号的出愈率最
低 ,与其他 3个品种之间存在着明显的差异。
2. 4 不同浓度 6-BA 对愈伤组织再生植株
的影响　6-BA和 K T 的浓度为 0的培养基上的
愈伤组织第 2天便有分化出绿点 ,并且在第 10天
左右最先成苗 ,其他在含有不同浓度 6-BA 的培
养基(K T 为 0)上的愈伤组织分化速度则较慢。
20 d后统计再生成植株的愈伤组织的块数及长白
化苗的愈伤数 ,计算出苗率 。如表 5所示 。
　　表 5数据反正弦后进行 6-BA 浓度对出苗率
的方差分析 ,可知 6-BA 浓度对出苗率影响显著。
经多重比较(表 5),表明 6-BA 浓度为 0. 05 mg /L
时效果最好 。
2. 5 不同浓度 KT 对愈伤组织再生植株的
影响　20 d后统计在不同浓度 KT 培养基上的
愈伤组织的出苗率见表 6。
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表 4　2 , 4-D浓度 、6-BA 浓度及品种的多重比较
2 , 4-D浓度
(mg /L) x
显著性
0. 05
6-BA 浓度
(mg / L) x
显著性
0. 05 0. 01 品种 x
显著性
0. 05 0. 01
9 67. 71 a 0 68. 63 a A 千年盛世 68. 81 a A
7 66. 97 a 0. 1 67. 21 a A 凌志 67. 89 a A
5 66. 52 ab 0. 2 66. 36 a AB 交战Ⅱ号 66. 54 a A
12 63. 24 bc 0. 5 62. 24 b BC 猎狗 5号 61. 20 b B
表 5　不同浓度 6-BA对愈伤组织再生植株的影响
浓度
(mg /L)
出苗率(%)
1 2 3 4 5
平均出苗
率(%)
显著性
0. 05
0 37. 5 30. 0 20. 0 17. 5 15. 0 24. 0 ab
0. 05 40. 0 17. 5 50. 0 42. 5 30. 0 36. 0 a
0. 10 10. 0 5. 0 7. 5 17. 5 25. 0 13. 0 ab
0. 20 7. 5 10. 0 55 12. 5 17. 5 20. 5 ab
0. 30 7. 5 2. 5 22. 5 27. 5 7. 5 13. 5 b
由表6可知 KT 浓度对出苗率影响显著 , KT 浓度
为 0. 2 mg /L 时效果最好。
3　讨论
3. 1 外植体的消毒　为了保证成功地进行培
养 ,在材料接种前必须消毒 。因为植物体的表面
常常带有各种微生物 ,一旦带入就会迅速滋生 ,从
而使试验前功尽弃 。故此 ,在接种前必须使材料
表 6　不同浓度 KT 对愈伤组织再生植株的影响
KT 浓度
(mg /L)
出苗率(%)
1 2 3 4 5
平均出苗率
(%)
显著性
0. 05 0. 01
0 37. 5 30 20. 0 17. 5 15. 0 24. 0 ab AB
0. 05 20. 0 10 10. 0 2. 5 5. 0 9. 5 a A
0. 10 22. 5 10 7. 5 32. 5 27. 5 20. 0 a AB
0. 20 37. 5 40 57. 5 27. 5 42. 5 41. 0 b B
0. 30 32. 5 15 40. 0 30. 0 15. 0 26. 5 ab AB
完全无菌 。消毒的一个基本原则 ,是既要将材料
上附着的微生物杀死 ,同时又不能伤及材料[ 5] 。
目前 ,常用的药剂有乙醇 、升汞 、次氯酸钠及漂白
粉等 。
高羊茅种子共生着一种顶孢霉属真菌 ,是组
织培养的一个障碍 。据报道 ,种子表面消毒方式
主要有以下几种:70%的酒精浸泡 20 min , 5. 25%
次氯酸钠和 0. 5%去污剂(Alconox)短时间浸
泡[ 6] ;对未成熟胚采用 0. 01%升汞处理 10 min ,
对成熟胚用盐酸酸化 15 min后采用 10%次氯酸
钠灭菌 10 min[ 7] ;但这些方法都存在不同程度的
污染 ,有的高达 44%。通过本试验的 3种方法的
对比得出消毒方法为“次氯酸钠(活性氯≥5%)浸
泡 60 min后无菌水搅拌去皮” 。而且通过试验证
明污染率很低达 10%以下且愈伤诱导率 60%以
上 ,说明次氯酸钠适当的浓度和适当的时间处理
可以在不伤害高羊茅种子的前提下有效地控制污
染率。
3. 2 基因型对愈伤组织诱导的影响　一般认
为 ,愈伤组织的发芽率与品种的基因型密切相关。
有些品种有很高的诱导率 ,有些却很难诱导出愈
伤组织[ 8] 。成熟胚是自养的 ,所以它的发育在很
大程度上受细胞固有因素的控制[ 9] 。而愈伤组织
是植物受伤后在本身内源激素及培养基中外源激
素的共同作用下 ,细胞反复分裂产生的[ 10] 。不同
的基因型其内源激素是不同的 ,故基因型对愈伤
诱导存在一定影响。
试验结果显示:不同基因型的高羊茅品种在
愈伤诱导上差异显著。千年盛世最易于愈伤诱导
而猎狗 5号则最差 ,说明品系间遗传背景不同其
诱导愈伤能力有很大差别。
3. 3 培养基中各种因素的选择及用量　研
究发现 ,2 ,4-D浓度达 9 mg /L 时愈伤组织诱导率
最高 ,且愈伤组织诱导率与 2 , 4-D浓度呈现一定
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的相关性 。开始随 2 , 4-D浓度升高愈伤组织诱导
率也在提升 ,当 2 , 4-D 浓度达 9 mg /L 时 ,愈伤诱
导率达最高。当 2 , 4-D 达 12 mg /L 时 ,对愈伤诱
导产生抑制作用。因此 ,试验得出在高羊茅愈伤
组织诱导过程中 ,2 ,4-D的最适宜浓度为 9 mg /L。
6-BA对愈伤组织的诱导存在一定的负效应 ,
在培养基中添加的 6-BA 浓度越高 ,愈伤组织诱
导率越受到抑制。6-BA 在促进愈伤组织的再分
化上要优于 KT ,但成苗率却不如 K T 。在愈伤组
织的分化再生试验中可得出 0. 05 mg /L 的 6-BA
或 0. 2 mg /L 的 KT 是适宜的 。
水解酪蛋白也是组织培养中经常用到的 ,它
是一种具有多种氨基酸的混合物 ,它可促进胚生
长 ,特别是在分化培养基中 ,加入一定量的水解酪
蛋白 ,可促进胚胎发生和多胚性出现[ 11] 。在培养
基中添加水解酪蛋白有利于促进胚性愈伤组织的
诱导[ 1] 。试验研究发现加入 300 mg /L 水解酪蛋
白有利于愈伤组织的诱导 。
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Callus induction and plantlet regeneration of Tall Fescue
WANG Wei-fei , HAN Lie-bao , ZENG Hui-ming
(Turf Research Institute ,Beijing Forestry U niversi ty , Beijing 100083 , China)
Abstract:In o rder to establish the tissue cul ture system o f tall fescue (Festuca arundinacea) fo r the
t ransgenic study , callus induction and plant le t regeneration of sterilized ma ture seeds o f tall fescue va-
riet ies w ere studied. The results indicated that:①The best surface sterilization process fo r seeds w as
st irred in NaClO(active chlorin≥5%) one hour and then in sterilized w ater fo r dissolving the skin of
seeds. ②M illennium perfo rmed bet te r than o ther lines o f tall fescue in callus induction. ③The suit-
able medium fo r callus induction o f Mi llennium was a basic MS salt mixed w ith 9 mg /L 2 , 4-D+300
mg /L Hydroly sate. ④The sui table concentration of 6-BA and K T in medium fo r plant le t regeneration
were 0. 05 mg /L and 0. 2 mg /L.
Key words:Tall fescue;callus;plant let reg eneration;culture media;2 ,4-D;6-BA;K T