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韩 山 师 范 学 院 学 报
Journal of Hanshan Normal University
Vol.34 No.6
Dec.2013
第34卷第6期
2013年12月
收稿日期：2013-04-10
作者简介：林燕如（1982-），女，广东揭阳人，韩山师范学院化学系实验师.
金丝草总黄酮的提取与抗氧化性研究
林燕如，陈宜菲，李粉玲
（韩山师范学院化学系，广东潮州 521041）
摘 要：在单因素试验的基础上，通过正交试验对超声波辅助提取金丝草总黄酮的工艺条件进行优化.
并采用水杨酸法测定其清除羟自由基能力、邻苯三酚自氧化法测定其清除超氧自由基能力和普鲁士蓝法测
定还原能力．结果表明，提取金丝草总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度50 %，料液比1∶35，超声波功
率70 W，超声时间35 min，超声温度47 ℃，总黄酮得率为3.08%.金丝草黄酮提取物对羟自由基和超氧自由
基呈现出清除作用，还原能力则随着浓度的增加而增强.
关键字：金丝草；超声波；总黄酮；抗氧化性
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1007-6883（2013）06-0058-06
金丝草为禾本科金发草属植物金丝草（Pogonatherum crinitum（Thunb.）Kunth）的全草，别名落
苏、墙头竹、猴毛草、猫毛草等，分布广，资源丰富．金丝草性寒、无毒，具有清热、解暑、利尿之
功效．金丝草中主要活性成分是黄酮[1]，但金丝草总黄酮的提取工艺及其抗氧化性的研究尚未见报
道，为此本文采用正交试验分析法对超声波辅助提取金丝草中总黄酮的工艺条件进行优化，并采用水
杨酸法测定其清除羟自由基能力、邻苯三酚自氧化法测定其清除超氧自由基能力和普鲁士蓝法测定其
还原能力，为金丝草的开发利用提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
金丝草购自潮州南桥市场，置于60 ℃烘箱内干燥24 h，充分干燥后粉碎，过40目筛备用．
芦丁对照品（国药集团化学试剂有限公司）、95 %乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、硫酸亚
铁、过氧化氢、水杨酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、抗坏血酸、邻苯三酚、磷酸氢二钠、磷酸
二氢钾均为分析纯．
KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），Spectrumlab 752S紫外可见分光光
度计（上海棱光技术有限公司）．
1.2 试验方法
1.2.1 标准曲线的制作
依据文献[2]的方法，以吸光度（A）为纵坐标，芦丁质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得
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芦丁标液质量浓度（C）与吸光度值（A）关系曲线的线性回归方程式为：A= 9.031 8C-0.004，R2 =
0.998 9.
1.2.2 金丝草中黄酮含量的测定
依据文献[2-3]的方法，取金丝草1 g，置于50 mL锥形瓶中，按一定的料液比加入乙醇溶液；采
用超声功率70 W，分别在不同乙醇浓度、料液比、超声温度和时间等条件下进行单因素实验，趁热
抽滤，滤液定容至 100 mL，为金丝草总黄酮提取液．以3 000 r/min，离心10 min后，取1 mL提取液
置于10 mL比色管中，于波长为510 nm处测定吸光度值，再根据标准曲线方程计算黄酮含量．在单因
素试验基础上，采用正交设计法优化金丝草总黄酮的超声波辅助提取工艺参数．
1.2.3 回收率试验
采用样品加标回收率试验法[4-5]．取4份金丝草总黄酮提取液各1 mL，其中3份加0.4 mg/mL的芦
丁标准溶液 1 mL，于波长为 510 nm处测定吸光值，每个样品平行测定 3次，计算回收率.回收率
（%）=（V1C1-V2C2） /V0C0×100%，式中：V0：加入芦丁标准溶液的体积（mL）；C0：芦丁标准溶液的
浓度（mg/mL）；V1：加芦丁的样品溶液的体积（mL）；C1：加芦丁的样品溶液的浓度（mg/mL）；V2：
未加芦丁的样品溶液体积（mL）；C2：未加芦丁的样品溶液浓度（mg/mL）．
1.2.4 金丝草总黄酮的抗氧化试验
（1）金丝草总黄酮对羟自由基（·OH）的清除[6-7]．在 5支 10 mL比色管中依次加入 2 mmol/L的FeSO4
溶液 2.5 mL和 2 mmol/L的H2O2溶液 2.5 mL，混合后加入 6 mmol/L水杨酸溶液 2.5 mL，摇匀．37 ℃水
浴15 min，在510 nm处测其吸光度值为A0（蒸馏水为参比液）．加入0.0143 mg/mL的金丝草黄酮提取
物液 0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，用蒸馏水定容至 10 mL，摇匀，在 37 ℃下水浴 15 min，在
510 nm处测其吸光度值为Ax（蒸馏水为参比液）．对羟自由基清除率的计算公式为：·OH清除率
（%）=（A0-Ax） /A0×100%．
（2）金丝草总黄酮对超氧自由基（O2-·）的清除[6-7]．在室温下，往6支比色管中加入66.7 mmol/L
的 PBS（pH 8.34）缓冲液 5.0 mL；再加入 0.014 3 mg/mL的金丝草黄酮提取物各 0、0.20、0.40、
0.60、0.80、1.00 mL（不加样品液为空白对照），最后加入2 mmol/L的邻苯三酚1 mL，取一定量缓冲
溶液使体系总体积达到9 mL，立即混匀；以蒸馏水作空白参照，在322 nm处测定吸光度值A322，每隔
30 s测 1次至反应启动后的第 4 min，把所得的数据以时间为横坐标，A322值为纵坐标进行线性回归，
得到直线斜率为反应速率V 自、V 样．清除率按下式计算：O2-·清除率（%） =（V 自-V 样） / V 自×100%
（V自：不加待测液的反应速率；V样：加入待测液的反应速率．）
（3）金丝草总黄酮的还原能力测定 [8-9]．在 6支 25 mL比色管中各加入 pH 6.6的磷酸盐缓冲溶液
2.5 mL，再依次加入浓度为0.014 3、0.028 6、0.042 9、0.057 2、0.071 5 mg/mL的总黄酮提取液2.5 mL，加
入1 %的铁氰化钾溶液 2.5 mL，混合物在50 ℃恒温20 min后，快速冷却，再加入10 %的三氯乙酸溶
液2.5 mL，然后以3 000 r/min离心10 min，静置片刻后，取上层清液5 mL加蒸馏水5 mL和0.1 %的三
氯化铁溶液1 mL，摇匀，静置15 min，待溶液从黄色变为蓝色，在700 nm处测定其吸光度A．用2.5 mL
的蒸馏水代替样品液做空白.
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇浓度对提取率的影响
由图 1A可知，乙醇浓度不同，其它条件相同（超声时间 30 min，超声功率 70 W，超声温度
30 ℃，料液比1∶25），总黄酮提取率开始随乙醇浓度的增大而增加．当浓度达到50 %时，总黄酮提
取率最高；但当乙醇浓度再增大时，杂质的溶出量增加，提取率反而开始下降，这给后续的处理带来
了很大的不便．故将乙醇浓度定为40 %～60 %左右较好.
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2.1.2 料液比对提取率的影响
由图 1B可以看出，料液比不同，其它条件相同（超声时间 30 min，超声功率 70 W，超声温度
30 ℃，乙醇浓度 50 %），提取率在料液比为 1∶10～1∶30时，随着料液比增大提取率较快地增大，
但当料液比大于1∶30后，提取率反而下降.因此，当料液比为1∶30时，就可以达到最佳的提取效果.
在实际操作中，当浸提的料液比过小时，提取液偏少，不利于过滤分离；当浸提的料液比过大时，旋
转蒸发转移溶剂时耗时长、耗能多.同时，料液比过大不但会增加溶剂的用量，而且会增大去除溶剂
所需负荷，故料液比定在1∶25～1∶35之间较合适.
2.1.3 超声温度对提取率的影响
如图1C所示，超声温度不同，其它条件相同（超声时间30 min，超声功率70 W，料液比1∶30，乙
醇浓度50 %），随超声提取时温度的升高，提取率不断提高；当温度为42 ℃时，提取率达到4.63 %；
继续升高温度，提取率增加缓慢；同时温度过高时，一方面其中的活性成分会被破坏，杂质的溶出量
增加，给后续的处理带来很大的不便，增加生产的成本；另一方面也会造成溶剂的损失.综合考虑，
超声温度应为37～47 ℃.
2.1.4 超声时间对黄酮提取效果的影响
如图1D所示，超声时间不同，其它条件相同（超声温度42 ℃，超声功率70 W，料液比1∶30，
乙醇浓度50 %），超声时间为30 min左右效果较佳，此后提取液内的有效成分含量下降，原因可能是
在长时间超声作用下，提取率逐渐向极限值靠近，致使提取率增幅降低；同时超声作用时间太长，
会使提取粗品中杂质含量增加，有效成分含量反而降低，影响提取物有效含量.考虑到尽量节约时间
的关系，将超声时间定在25～35 min.
图 1 不同提取条件下金丝草总黄酮的提取率
2.2 正交试验
选用乙醇浓度、超声温度、超声时间、料液比等四个主要因素进行正交试验，以全面研究这四个
因素的交叉作用对金丝草总黄酮提取率的影响.选用L9（34）正交试验表进行试验设计，以金丝草总黄
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酮提取率为试验指标.试验结果及极差分析见表1.
从表1与表2可知，各实验因素及其因素水平对金丝草中总黄酮的提取率大小的影响表现出一定
的差异性.影响金丝草总黄酮提取率的因素主次顺序为A>B>C>D，即乙醇浓度影响最大，其次是超声
温度和超声时间，料液比影响最小.综合以上因素得到金丝草中总黄酮提取的最佳工艺条件为
A2B3C3D3，即乙醇浓度为50%，超声温度为47 ℃，超声波功率为70 W，超声时间35 min，料液比1∶35.
在最佳工艺条件下进行验证实验，结果金丝草总黄酮提取率达3.08%，高于正交试验5的黄酮提取率
3.020 %.
2.3 回收率
由表3可知，提取液中的黄酮类化合物含量的加样回收率偏高，在106.750 %-112 %之间，相对
标准偏差为2.580%，因此该方法准确度较高.
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
k1
k2
k3
R
最优组合
A:乙醇浓度/%
40
40
40
50
50
50
60
60
60
2.687
2.913
2.697
0.226
A2
B:超声温度/℃
37
42
47
37
42
47
37
42
47
2.650
2.810
2.837
0.187
B3
C:超声时间/min
25
30
35
30
35
25
35
25
30
2.707
2.710
2.880
0.173
C3
D:料液比
1:25
1:30
1:35
1:35
1:25
1:30
1:30
1:35
1:25
2.713
2.790
2.793
0.080
D3
总黄酮提取率/%
2.460
2.700
2.900
2.770
3.020
2.950
2.720
2.710
2.660
因素
A:乙醇浓度
B:超声温度
C:提取时间
D:料液比
误差
偏差平方和
0.100
0.060
0.060
0.013
0.230
自由度
2
2
2
2
2
F比
1.717
1.030
1.030
0.223
F临界值
4.460
4.460
4.460
4.460
表 1 正交实验结果
表 2 方差分析结果
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表 3 金丝草总黄酮的回收率
2.4 金丝草总黄酮的抗氧化作用
2.4.1 不同添加量的金丝草总黄酮对羟自由基和超氧自由基的清除效果
由图2可知，在添加量为0.003~0.014 mg范围内，随着金丝草总黄酮添加量的增加，清除羟自由
基和超氧自由基的效果均出现逐渐增强．当添加量为0.014 mg时，其对羟自由基和超氧自由基的清除
率分别达到了57.380%和15.460%，表明金丝草总黄酮对羟自由基和超氧自由基有较好的清除效果.在
添加量为0.011~0.014 mg范围内时，金丝草总黄酮对羟自由基和超氧自由基的清除率随着添加量的增
加而趋于稳定．
2.4.2 金丝草总黄酮的还原能力
由图3可看出，金丝草总黄酮提取液具有较好的还原能力，是良好的电子供应者，其供应的电子
除可以使Fe3+还原成Fe2+外，还可与自由基成为较惰性的物质，以阻断自氧化链锁反应.在添加量为
0.036～0.179 mg范围内，样品的还原能力随着浓度的增加而增强．提示金丝草总黄酮提取液的抗氧
化能力随浓度的增加而增加.
图 2 金丝草总黄酮对羟自由基和超氧自由基的清除 图 3 金丝草总黄酮的还原能力
3 结论
本研究在单因素试验的基础上，通过正交试验法优化了金丝草总黄酮的超声提取工艺，确定了
金丝草总黄酮的最佳提取条件：乙醇浓度50 %、料液比1∶35、超声温度47 ℃、超声时间35 min、超
声功率70 W，在此条件下总黄酮的提取率为3.080%.
金丝草总黄酮含量较高，金丝草黄酮提取物对羟基自由基的清除效果较好，对超氧自由基有一
定的清除作用，具有较好的还原能力．由此可见，金丝草具有较高的药用价值.金丝草分布较广，来
源丰富，毒性低，价格低廉，值得在中成药方面开发利用．
金丝草中黄酮的含量/（mg·mL-１）
0.023
0.023
0.023
芦丁添加量/（mg·mL-１）
0.400
0.400
0.400
测出量/（mg·mL-１）
0.066
0.068
0.067
回收率/%
106.750
112
111.250
RSD/%
2.580
Extraction and Antioxidant Activity of Total
Flavonoids from Pogonatherum crinitum
LIN Yan-ru,CHEN Yi-fei,LI Fen-lin
（Department of Chemistry,Hanshan Normal University, Chaozhou 521041,China）
Abstract： On the base of the single factor experiments,the optimal processing conditions of ultra⁃
sound-assisted for the extraction of total flavonoids from Pogonatherum crinitum were obtained by orthogonal
experiments and the antioxidation of total flavonoids by the elimination capacity on hydroxyl radical with sali⁃
cylic acid method,superoxide anion radical with pyrogallol oxidation method and the deoxidize activity with
prussian blue method were studied.The results indicated that the optimum conditions were immersed in 47 ℃
50% ethanol with solid-liquid ratio 1∶35 for 35 min by ultrasonic power 70 W. Its yield was 3.080%.The ex⁃
traction had certain elimination effects on hydroxyl radical and superoxide anion radical.
Key words：Pogonatherum crinitum；ultrasonic；total flavonoids；antioxidant activity
责任编辑 杨培奎
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参考文献：
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（上接第19页）
Conjugate Gradient Methods Solving the Parameter Identification Problem
MA Yan-bo，QU Dan
（Department of Mathematics and Statistics, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China）
Abstract：In this paper ,we discuss the compution of the inverse problem of the stead-difusion equation.
After reducing the problem to a nonlinear ill-posed operator equation, conjugate gradient method were consid-
ered. Numerical exeriments for this method show the obvious advantages of the proposed method.
Key words：inverse problems；conjugate gradinet method；nonlinear ill-posed problem
责任编辑 朱本华