全 文 ：抗逆转 ABP9基因黑麦草和
高羊茅植株的鉴定
张 磊1 , 3 ,吴金霞1 , 3 ,董芳2 , 3 ,
梁 华1 , 3 ,叶兴国2 , 3 ,路铁刚1 , 3 ,赵 军1 , 3
(1.中国农业科学院生物技术研究所 ,北京 100081;2.中国农业科学院作物科学研究所 ,北京 100081;
3.国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程 ,北京 100081)
摘要:选取黑麦草(Lolium perenne)bar ti和 telstar 品系以及高羊茅(Festuca elata)追寻者品系作为相应的
受体材料 ,采用实验室克隆的玉米(Zea mays)抗逆相关转录因子 ABP9 通过农杆菌介导和基因枪轰击 2 种
方法进行遗传转化 , 获得再生植株;并对再生植株进行 PCR、Southe rn 和 Northern 杂交分子检测以及抗逆
性鉴定。试验结果表明 ,成功获得 ABP9 在基因组中整合并表达且抗逆性得到显著提高的转基因黑麦草和
高羊茅植株。
关键词:黑麦草;高羊茅;转基因;ABP9;抗逆性;转录因子
中图分类号:S543.034;Q943.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-0629(2010)07-0072-06
＊　黑麦草(Lolium perenne)是畜牧业中重要的饲
料 ,它含有丰富的矿物质 、蛋白质及多种维生素 ,
是奶牛饲养的重要草种;作为草坪草具有建坪速
度快 、抗病虫害能力强等优点 ,但其耐旱性较弱 。
而高羊茅(Festuca elata)常用于城市草坪绿化及
沿海护堤 ,具有耐酸 、耐践踏等优良特性 ,是城市
绿化的主力军 ,但其耐盐能力不强 。因此培育耐
逆性强的黑麦草和高羊茅品种已成为草业生产的
重大需求[ 1-3] 。
干旱 、寒冷 、盐渍等逆境信号经过一系列的传
导后 ,最终通过转录因子来调控逆境相关基因的
表达[ 4-6] 。近年来 ,一些调控干旱 、低温及盐渍相
关基因表达的转录因子相继从高等植物中得到分
离 [ 7-12] 。在转基因研究中 ,这些转录因子能明显
提高植物抗非生物逆境的能力;而且由于这些转
录因子能调控一系列抗逆相关功能基因的表达 ,
可以使植物的抗逆性得到综合地改良[ 13-15] 。随着
分子生物学和基因工程技术的不断成熟 ,在分子
水平上进行牧草和草坪草抗渗透胁迫新品系培育
成为可能[ 16] 。
中国农业科学院生物技术研究所实验室通过
酵母单杂交的方法克隆得到玉米(Zea mays)抗
逆相关 bZIP 类转录因子 ABP9基因 ,其编码蛋白
能够与玉米过氧化氢酶 Cat1 基因启动子中的
ABA应答元件 ABRE 特异性结合而且具有转录
激活功能[ 11] 。ABP9基因的表达受干旱 、高盐等
非生物逆境诱导 ,其在拟南芥(Arabidopsii thal i-
ana)中过量表达能够综合提高转基因植株耐受干
旱和高温的能力[ 17] 。
本研究构建了玉米 bZIP 类转录因子 ABP9
的植物表达载体 ,并采用基因枪和农杆菌介导 2
种方法遗传转化黑麦草(Barti和 Telstar)和高羊
茅(追寻者),获得了抗逆性显著增强的转 ABP9
基因植株 ,为我国草业育种改良提供了重要的种
质资源 。
1　材料与方法
1.1 材料和培养条件
遗传转化受体材料:野生型黑麦草(Barti 和
Telstar)、高羊茅(追寻者)的成熟种子 。
逆境处理材料的培养:采用分蘖拆分方法从
72-77
07/ 2010 草　业　科　学PRATACULTURAL SCIENCE 27卷 07 期Vol.27.No.07
＊收稿日期:2009-12-11基金项目:“ 973”国家重点基础研究发展计划项目(2007CB
108906);浙江省重大科技专项国际科技合作项目(2007C14021)作者简介:张磊(1981-),男 ,山东青岛人 ,在读硕士生 , 研究方向为植物抗逆基因工程。
E mail:zl101-ok@163.com通信作者:赵军　E mail:jun zhao@caas.net.cn
黑麦草 、高羊茅野生型和转基因植株分蘖簇中分
出长势基本一致的分蘖枝移栽到盛有等量土样
(泥炭土∶蛭石∶草炭灰为 1∶1∶1)的花盆中于
日光温室内进行无性繁殖 ,培养一定时间(黑麦草
14 d ,高羊茅 30 d)后开始逆境处理 。温室光照强
度为 50 000 ～ 70 000 lx ,温度为 20 ～ 30 ℃,空气
相对湿度 30%～ 40%。
1.2 基因建构和遗传转化　建构分别由组成
型表达启动子(Ubi 、35S)和 ABA 诱导型启动子
驱动 ABP9表达的植物表达载体 ,采用农杆菌介
导[ 1 8-19] 和基因枪轰击 2种方法以 bar 作抗性选择
标记基因对黑麦草和高羊茅材料进行遗传转化并
再生植株。
1.3转化再生植株的 PCR鉴定　以转 ABP9
基因植株的总 DNA 为模板 ,质粒 DNA 为阳性对
照 ,野生型植株作为阴性对照 ,用基因特异性引物
对转基因植株进行 PCR扩增(表 1)。
表 1　引物和 PCR扩增条件
类项 黑麦草 高羊茅
正向引物 5 TGATATGGCGTCGGAGACGA 3 5 AAGAAAAAGAAGCTGGAGAAG 3
反向引物 5 CAATCCTCCGTTCTCACC TGT3 5 TGCGGGACTC TAATCATAAAAACC 3
扩增条件 94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s , 62 ℃ 30 s , 72 ℃
1 min , 35 个循坏;72 ℃ 5 min , 4 ℃终止
94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min , 58 ℃ 40 s , 72 ℃
1 min , 35 个循坏;72 ℃10 min , 4 ℃终止
1.4 Southern 杂交检测　黑麦草和高羊茅的
基因组 DNA 提取采用 CTAB法[ 20] 。DNA 浓度
和纯度的测定 、酶切 、电泳 、转膜 、探针制备 、杂交
和洗膜参考 Sambrook 和 David[ 21]的方法 。
1.5 No rthern 杂交分析　黑麦草和高羊茅总
RNA用 TRIzol 试剂提取。 RNA 的变性 、电泳 、
转膜 、探针制备 、杂交和洗膜参考 Sambrook等的
方法[ 21] 。
1.6 干旱处理和统计方法　采用人工控水的
方法进行。将准备好的材料(见 1.1)浇 1次饱和
水后 ,停止浇水 。当处理至野生型植株大部分出
现整株严重失水萎蔫时 ,立即恢复浇水。复水生
长 2周后 ,以植株恢复生长为标准统计存活率 ,试
验设 3次重复 。
存活率= 存活植株试验总植株×100%
1.7 盐处理和统计方法　向长有材料的花盆
土中浇灌 NaCl溶液 ,以每天 50 mmol/L 的增幅
递增盐浓度至 550 mmol/ L。在此浓度下处理 10
d后 ,进行脱盐处理(将试验材料浸泡于清水中 10
min ,重复 3次以洗掉残余盐分),恢复 2周后以植
株恢复生长为标准统计存活率 ,试验设 3次重复。
2　结果与分析
2.1 黑麦草和高羊茅转化再生植株的 PCR
鉴定　黑麦草和高羊茅野生型用 ABP9 基因建
构遗传转化 ,经草胺磷筛选获得大量抗性再生植
株。对这些植株进行了 PCR鉴定 ,如图 1 、图 2所
图 1　黑麦草转化再生植株的 PCR 检测
　注:1-10 为黑麦草转化再生植株;11 为阳性对照;12为野生型对照;13 为水空白;M 为 100 bp Ladder。
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图 2　高羊茅转化再生植株的 PCR检测
　注:1 为水空白;2-11为高羊茅转化再生植株;12为野
生型对照;13 为阳性对照;M 为 100 bp DNA Ladder 。
示 ,黑麦草和高羊茅转化植株分别在 358 和 570
bp的位置上出现了预期大小的目标 DNA 条带 ,
初步证明已将 A BP9基因导入黑麦草和高羊茅获
得转基因植株 。
2.2 黑麦草和高羊茅 PCR阳性转化再生植
株的 Southern 杂交鉴定 　为了进一步证实
ABP9在基因组中的整合和拷贝数 ,对上述黑麦草
和高羊茅 PCR阳性植株进行 Southern杂交鉴定 。
用在 ABP9内部无酶切位点的 Hind III 对基因组
DNA 进行单酶切 ,以 32P 同位素标记的 ABP9特
异序列 DNA为探针进行Southern杂交。
如图 3所示 ,高羊茅转化植株 14#和 16#的
基因组 DNA 中都出现了区别于野生型的杂交
带 ,推测 14#植株中至少存在 1个 ABP9拷贝 ,而
16#至少含有 2 ～ 3个拷贝。
　　如图 4所示 ,黑麦草转化植株 2#A 、2#B 和
2
#
A 5都出现了区别于野生型的杂交信号 ,推测 ,
2#B 和 2#A5各至少含有 1 个 ABP9拷贝 ,而 2#
A 中至少存在 3个拷贝。
2.3转 ABP9黑麦草和高羊茅植株中 ABP9
表达的 Northern 杂交分析 　提取植株总
RNA , 用与 Southern 杂交相同的探针进行
Northern杂交检测 ,分析转基因植株中 ABP9的
表达。
如图 5所示 ,野生型对照都无杂交带 ,而转基
因黑麦草和高羊茅植株均有杂交信号 , 说明
ABP9在转基因植株中得到了表达 。并且 ,在转
基因黑麦草中 2#A 植株表达最强 ,2#B 、2#A5
图 3　转 ABP9 高羊茅 Southern杂交检测
　注:1为再生株系 16#;2 为再生株系 14 #;3 为高羊茅
野生型;P 为质粒 DNA 阳性对照。
图 4　转 ABP9 黑麦草 Southern杂交检测
　注:1 为再生株系 Bar ti 2 #B;2 为再生株系 Bar ti 2 #A;3
为黑麦草 Ba rti野生型;4 为黑麦草 Telstar野生型;5 为再
生植株 Telstar 2#A5;P为质粒 DNA 阳性对照。
表达较弱;转基因高羊茅中 14#表达较强 , 16#较
弱。
以上结果进一步证实 ,获得了 ABP9 整合到
基因组中的转基因黑麦草与高羊茅植株 。
74 PRATACULTURAL SCIENCE(Vol.27.No.07) 07/2010
图 5　转 ABP9 基因植株的 Northern杂交分析
　注:1 为转基因高羊茅 16#;2 为转基因高羊茅 14 #;3 为转基因黑麦草 2#A5;4 为转基因黑麦草 2#B;5 为转基因黑麦
草 2 #A;6 为高羊茅野生型;7为黑麦草野生型。
2.4 转 ABP9 黑麦草和高羊茅植株的抗逆
性鉴定
2.4.1 转基因黑麦草的耐旱鉴定　从转基因黑麦
草植株和野生型对照植株分蘖簇中拆分分蘖枝 ,
在土中生长 14 d后开始耐旱试验。当控水处理
至第 20天时 ,所有野生型植株出现了明显的叶片
干枯现象 ,而转基因植株只部分出现了叶片轻微
萎蔫;控水处理第 35天时 ,绝大多数野生型植株
表现整株干枯 ,而大部分转基因植株仍维持一定数
目的绿色叶片。恢复浇水后 2周(图6)观察并以恢
复生长为标准统计存活率 ,转 ABP9基因黑麦草旱
后存活率达 76%,而野生型对照只有29%。
2.4.2转基因高羊茅的耐盐鉴定　从转基因高羊
茅植株和野生型对照植株分蘖簇中拆分分蘖枝 ,
在土中生长 30 d 后开始耐盐试验 。向长有材料
的花盆土中浇灌 NaCl溶液 ,以每天 50 mmol 的
增幅递增盐浓度至 400 mmol/L 后 ,野生型植株
的叶片出现了较为明显的叶面卷曲 、失绿表型 ,而
转基因植株只部分叶片出现轻微卷曲;当盐浓度
到达 550 mmo l时处理 10 d ,发现绝大多数野生型
植株表现整株干枯 ,而大部分转基因植株仍维持
图 6　转 ABP9 基因黑麦草的抗旱试验
　注:1 为黑麦草野生型;2 为转 ABP9 基因黑麦草。
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一定数目的绿色叶片 。此时进行脱盐并恢复浇
水 ,2周后(图 7)观察并以恢复生长为标准统计存
活率 ,转 ABP9基因高羊茅盐后存活率达 100%,
而野生型对照只有 57%。
　　抗逆试验结果表明:与野生型相比 ,转 ABP9
基因黑麦草的耐旱性和转 ABP9基因高羊茅的耐
盐性都有很大提高 。
图 7　转 ABP9基因高羊茅的抗盐试验
　注:1 为转 ABP9 基因高羊茅 16 #;2 为转 ABP9 基因高羊茅 14#;3 为高羊茅野生型。
3　讨论
研究通过 PCR检测 、Southern和 Northern杂
交等分子生物学技术分析 ,结果表明:ABP9基因已
整合到黑麦草和高羊茅植株基因组中 ,并获得表
达。抗逆生理分析显示:转 ABP9基因黑麦草和高
羊茅再生植株在干旱和盐渍胁迫过程中叶片的卷
曲程度以及解除逆境后的植株成活率较野生型植
株都有了很大幅度地改善 ,成功获得了耐逆性显著
提高的转ABP9基因黑麦草和高羊茅植株。
中国农业科学院生物技术研究所实验室早期
研究表明 ,从玉米幼胚中克隆得到的 bZIP 类转录
因子 ABP9可以与过氧化氢酶基因 Cat1 启动子
ABRE 元件特异性结合并具有转录激活功能[ 11] ,
其在 ABP9转基因拟南芥植株中过量表达能显著
提高植株对干旱 、高温的耐受性[ 17] 。本研究的结
果与上述试验结果一致 , 再次证明 ,通过操作在
ABA途径发挥作用的 ABP9 基因的表达可以提
高转基因植物对多种非生物逆境的耐受能力。
中国是草地大国 , 草地面积占国土面积的
40%以上 ,但同时也是一个水资源相对贫乏 ,土地
盐碱化日益严重的国家 ,普通草坪正常生长需水
量大 ,盐碱地环境下生长不良的缺点早已不符合
我国的国情 。因此 ,创制耐逆性能强的优良草坪 ,
改良我国草种资源成为近年来亟待解决的课题。
本研究所获得的转 ABP9基因耐旱黑麦草和
耐盐高羊茅 ,将在牧草和草坪草改良中具有潜在
的重要应用价值和经济价值。
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tall fescue plants expressing ABP9 gene
ZHANG Lei1 , 3 , WU Jin-x ia1 , 3 , DONG Fang2 , 3 , LIANG Hua1 , 3 ,
YE Xing-guo2 , 3 , LU Tie-gang1 , 3 , ZHAO Jun1 , 3
(1.Biotechnology Research Institute , Chinese Academy of Ag ricultural Sciences , Beijing 100081 , China;
2.Inst itute of Crop Science , Chinese Academy of Ag ricultural Sciences , Beijing 100081 , China;
3.National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement ,
Chinese A cademy of Ag ricultural Sciences , Beijing 100081 , China)
Abstract:Plant expression vecto rs on which the maize bZIP transcriptional factor ABP9 w as under the
contro l o f ei ther a consti tutive promoter Ubi/35S or an ABA responsive promote r w ere constructed
and transformed into ryeg rass and tall fescue via Agrobacterium mediated t ransfo rmation o r particle
bombardiment , and the resulting reg enerated plants w ere analyzed by PCR , Southern and Nor thern
blot ting fo r integ ration and expression of ABP9 and tested for resistance unde r drought or high salinity
conditions.The results show ed that transgenic ryeg rass and tall fescue plants e xpre ssing ABP9 w ith
enhanced st ress tolerance have been obtained.
Key words:ryegrass;tall fescue;transgenic;ABP9;st ress resistance;transcript ional factor
7707/2010 草　业　科　学(第 27 卷 07期)