全 文 ：分子植物育种，2010年，第 8卷，第 5期，第 958-962页
MolecularPlant Breeding, 2010, Vol.8, No.5, 958-962
研究报告
A Letter
假毛竹和毛竹正反交杂种的 ISSR鉴定
娄永峰 1 方伟 1 彭九生 2 廖光庐 2 林新春 1*
1浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地,临安, 311300; 2江西省林业科学研究院,南昌, 330032
*通讯作者, lxc@zafu.edu.cn
摘 要 竹类植物杂交育种工作十分薄弱，杂种鉴定较难。本研究开展了假毛竹与毛竹的杂交育种工作，并
利用 ISSR分子标记分析了假毛竹与毛竹的正反交疑似杂种及其亲本的亲缘关系。结果表明：(1)父本的遗传
信息已渗入子代，证实了两个疑似杂种的真实性；(2) ISSR分子标记适用于竹类植物杂种的分子鉴定；(3)两
个杂种之间、杂种与父母本之间均存在丰富的遗传变异，并且两个杂种在亲缘关系上偏向于假毛竹，说明了
杂交育种是竹类植物遗传改良的有效手段。
关键词 竹类植物,杂交育种, ISSR,鉴定
Identification on Reciprocal Cross Offspring of Phyllostachys kwangsiensis
and P. edulis by Using ISSRMarkers
LouYongfeng 1 FangWei 1 Peng Jiusheng 2 Liao Guanglu 2 LinXinchun 1*
1 Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Linan, 311300; 2 Jiangxi
ForestryAcademy of Sciences, Nanchang, 330032
* Corresponding author, lxc@zafu.edu.cn
DOI: 10.3969/mpb.008.000958
Abstract Studies on bamboo crossbreeding are insufficient, and the bamboo hybrids identification is difficult. In
this paper, two suspected hybrids of Phyllostachys kwangsiensis and P. edulis were got through crossbreeding, and
the genetic relationships among the suspected hybrids and their parents were analyzed, the results showed: (1) The
validity of two suspected hybrids was confirmed because characteristic bands of male parent were detected in the
suspected hybrids; (2) ISSR markers could be used an effective molecular technique in bamboo hybrids identifica-
tion; (3) Abundant genetic variation had been determined among two hybrids and theirparents and genetic relation-
ship of two hybrids was near Phyllostachys kwangsiensis. These results showed that crossbreeding was a very ef-
fective method forbamboo breeding.
Keywords Bamboo, Crossbreeding, ISSR identification
www.molplantbreed.org/doi/10.3969/mpb.008.000958
基金项目：本研究由浙江省重大科技专项(2006C12008; 2004C12034)资助
竹类植物是禾本科(Gramineae)竹亚科(Bambu-
soideae)植物的总称，全世界约 90 属 1400 多种，主
要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲的热带地区(Wu et
al., 2006)。竹类植物作为陆地森林资源的重要组成
部分，具有很高的经济价值和生态效益。近年来，竹
类植物由于具有固碳能力强、一次造林、可年年采
伐等优点，有望成为生物质能源的新原料(Scurlock
et al., 2000)。
由于竹子很少开花结实，且开花后植株容易死
亡，很难像其它物种那样进行选育和多世代的遗传
改良研究，遗传改良方面的研究十分薄弱(Scurlock
et al., 2000)。杂交育种是遗传改良的有效途径之一。
为了加速竹子的育种进程，在 20世纪 70年代，广东
省林科所率先开展了竹类植物杂交育种研究，利用
麻竹(Dendrocalamus latiflorus)、撑篙竹(Bambusa per－
variabilis)、青皮竹(Bambusa textilis)和版纳甜龙竹(D.
hamiltonii)等的自然开花植株进行有性杂交，获得了
撑麻(Bambusa pervariabilis×Dendrocalamus latiflorus)、
撑麻青(B. pervariabilis×D. latiflorus or B. textilis)、版
麻(D. hamiltonii×D. latiflorus)、青麻(B. textilis×D. lat－
iflorus)等丛生竹杂种(张光楚和陈富枢, 1980,林业科
学, 16(S1): 124-126;张光楚和陈富枢, 1986,广东林业
科技, (3): 1-5;张光楚, 2000;王裕霞等, 2005)，宁材
强和戴启惠(1995,广西林业科学, 24(4): 167-168)则
得到了撑绿竹(Bambusa pervariabilis×Dendrocalamop－
sis grandis) 杂种，但散生竹杂种目前仅见卢江杰等
(2009)和 Lin等(2010)的报道。
传统上对杂种的鉴定，通常根据形态学特征、细
胞学标记等做出鉴定，但这些方法往往耗时长且亦
受植物生长环境的影响，对很少开花结实且形态差
异小的竹类植物应用更为困难(卢江杰等, 2009)。分
子标记技术则能够突破形态学和细胞学上的限制，
客观地分析杂种及其亲本 DNA的遗传差异，近年来
该技术已被广泛应用于植物杂交后代的鉴定(Huang
et al., 2000; Shasany et al., 2005;索志立等, 2005)。在
竹类植物杂种鉴定方面，目前主要有 SSR和 ISSR分
子标记的应用报道(卢江杰等, 2009;吴妙丹等, 2009;
Lin et al., 2010)。
本研究通过杂交得到了假毛竹 (Phyllostachys
kwangsiensis)和毛竹(P. edulis)的正反交疑似杂种 H1
和H2，并采用 ISSR(inter-simple sequence repeat) (Ziet
kiwicz et al., 1994) 分子标记技术对疑似杂种的遗传
距离进行分析，以期为刚竹属内种间杂种的真实性
鉴别提供分子证据。
1结果与分析
1.1杂种的获得
以毛竹(P. edulis)为母本，假毛竹(P. kwangsien－
sis)为父本，得到了疑似杂种 H1；以假毛竹为母本，以
毛竹为父本，得到了疑似杂种 H2。
1.2杂种鉴定
通常利用 DNA分子标记对亲子代关系的鉴定
图 1引物 ISSR-3的扩增电泳图谱
注: 1:假毛竹(母本); 2: H1; 3: H2; 4:毛竹(父本);M: 100 bp lad-
derplus
Figure 1 The result of ISSR amplification of primer3
Note: 1:Phyllostachys kwangsiensis (female parent); 2: H1; 3: H2;
4: P. edulis (male parent);M: 100 bp ladderplus
需要在杂交后代中检测到如下证据：(1) 与双亲共同
具有的位点(或扩增带)；(2)分别与亲本之一共同具有
的位点(或扩增带)，其中，又以子代与父本共有的条
带最为重要(Huang et al., 2000)。8个 ISSR引物，在
H1中共检测得到 57个位点，其中 H1与双亲三者的
共有位点有 37个，与母本毛竹共有的位点有 6个，
与父本假毛竹共有的位点有 4个，H1中新出现的位
点有 10个；在 H2中共检测得到 54个位点，其中 H2
与双亲三者的共有位点有 40个，与母本假毛竹共有
的位点有 3个，与父本毛竹共有的位点有 5个，在
H2中出现了 6个新位点(图 1)。
1.3遗传距离分析
H1、H2两个正反交疑似杂种与父母本的遗传距
离见表 2。由表 2 可知，4 个竹种间的遗传距离在
0.135~0.239之间，其中 H1和 H2两个疑似杂种之间
的遗传距离最近(0.135)，而 H1与毛竹的亲缘关系最
远(0.239)。通过聚类分析可以直观地看出 H1、H2、父
本和母本之间的相互关系(图 2)，其中 H1、H2与假毛
竹的遗传距离小于毛竹，说明两个杂种在亲缘关系
表 1疑似杂种的 ISSR条带分析
Table 1 Statistical analysis of ISSR bands of suspected hybrids
疑似杂种
Suspected
hybrid
H1
H2
与母本共有条带
Bands shared with
female parent
数量
No.
6
3
比例
Percentage
10.5%
5.6%
与父本共有条带
Bands shared with
male parent
数量
No.
4
5
比例
Percentage
7.0%
9.3%
与双亲共有条带
Bands shared with
both parents
数量
No.
37
40
比例
Percentage
64.9%
74.1%
子代特有条带
Bands owned by
hybrid only
数量
No.
10
6
比例
Percentage
17.5%
11.1%
假毛竹和毛竹正反交杂种的 ISSR鉴定
Identification on Reciprocal Cross Offspring of Phyllostachys kwangsiensis and P. edulis by Using ISSRMarkers 959
分子植物育种
MolecularPlant Breeding
表 2疑似杂种与父母本之间的遗传距离
Table 2 Genetic distances of the suspected hybrids and their par-
ents generated
杂种
Hybrids
毛竹
P. edulis
H1
H2
假毛竹
P. kwangsiensis
毛竹
P. edulis
0.000
0.239
0.182
0.219
H1
0.000
0.135
0.226
H2
0.000
0.165
假毛竹
P. kwangsiensis
0.000
上偏向于假毛竹。
2讨论
形态学特征是杂种鉴定最常用的手段。对竹子
而言，笋箨特征是属内种间分类的主要依据，在非笋
期对竹子杂种鉴定比较困难。对于父母本染色体倍
性数不同的杂种，用细胞学方法检测染色体数目是
一种准确可靠的鉴定方法(汤天泽等, 2006)。张光楚
和陈富枢(1986,广东林业科技, (3): 1-5)发现撑麻青
1号(B. pervariabilis×D. latiflorus or B. textilis)的染色
体数目为 68，母本撑麻竹的染色体数目为 64，因此
父本只能是麻竹(染色体数目为 72)，而不可能是青
皮竹(染色体数目为 64)。竹子通常可分为散生竹和
丛生竹两大类，根据目前有关竹类植物染色体数目
的报道，一般认为散生竹种的染色体数目为 48，而丛
生竹的染色体数目大多为 72，少数为 64、96和 104
(李秀兰等, 1999; 2001)。因此染色体计数方法无法分
辨父母本染色体数目相同的竹类植物杂种。然而分
子标记技术可以克服形态学和细胞学方法的缺陷。
卢江杰等(2009)利用从毛竹 GSS 序列中开发出来
的 19个 SSR标记，对 3个散生竹杂种的真伪进行
了鉴定；吴妙丹等(2009)采用 15个绿竹(B. oldhami)
EST-SSR标记，对撑麻 7号、版麻 1号、青麻 11号和
撑麻青 1号 4个丛生竹杂种的真伪进行了鉴定。
杂种的分子识别依赖理想的分子标记，理想的
分子标记通常是 SSR等共显性标记，但是 SSR标记
的开发费用高、工作量大、耗时长。而 ISSR分子标记
以锚定的微卫星 DNA为引物，即在 SSR序列的 3
端或 5端加上 2~4个随机核苷酸，可迅速扫描整个
基因组，且事先不需要知道基因组信息，也在杂种鉴
定得到广泛应用(Zietkiwicz et al., 1994; Wolfe et al.,
1998; Ruas et al., 2003;索志立等, 2005)。Lin等(2010)
采用 ISSR分子标记分析了假毛竹和桂竹(P. bambu－
soides)的杂交后代，结果表明 ISSR分子标记可以用
于竹子杂种的鉴定。本研究通过 ISSR分析，在假毛
竹和毛竹的杂交后代中检测到多条父本的特征谱
带，在基因组 DNA水平上证实了这些杂交后代中确
实已渗入了父本的 DNA，有力的支持了 H1、H2是假
毛竹和毛竹的杂交后代。同时本研究采用的 ISSR分
子标记多态性高、稳定性好、成本低，并且可以用琼
脂糖凝胶电泳检测，操作简便快速，证实了此标记比
较适合竹类植物属内杂种的鉴定。
由图 2和表 2可知，杂种 H1、H2在基因组水平
上与双亲之间存在明显差异，说明杂交育种是竹子
遗传改良的有效手段。应加强开展竹类植物开花生
物学特性和花粉贮藏研究及杂交育种工作，为加快
竹类植物遗传改良的进程奠定基础。
3材料与方法
3.1杂交育种
利用江西省兴国县毛竹和广西省融安县假毛竹
的自然开花机会，将自然开花植株分别引种至江西
省兴国县均福山林场。以假毛竹和毛竹为亲本材料，
于天气晴朗的早晨选择母本即将开花的健壮小穗，
去除部分小花，仅保留几朵即将开花的健壮小花；当
小花张开时，及时去除尚未开裂散粉的花药；从父本
竹株中收集即将开裂的花药，轻轻撕裂，将花粉撒在
母本去雄小花的羽毛状柱头上；20~30 min后，授粉
后的柱头出现萎缩；给授粉小花挂牌，注意观察，约
2~3个月后，种子成熟，及时采收，播种。
3.2引物筛选
参考加拿大哥伦比亚大学(UBC)的 ISSR引物序
列由上海生工生物工程有限公司合成了 60个 ISSR
引物，从中筛选出 8个重复性好、特异性高、谱带清
晰、多态性较高的引物用于正式 PCR扩增，其中
图 2疑似杂种和父母本 ISSR聚类分析树状图
Figure 2 Dendrogram of two suspected hybrids and their parents
by clusteranalysis (UPGMA) based on ISSRmarkers
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.008.000958960
假毛竹和毛竹正反交杂种的 ISSR鉴定
Identification on Reciprocal Cross Offspring of Phyllostachys kwangsiensis and P. edulis by Using ISSRMarkers
ISSR-74和 ISSR-76为四核苷酸重复序列，另外 6个
引物为二核苷酸重复序列。引物编号、序列分别为：
(1) ISSR-3：(AC)8TT；(2) ISSR-23：(AC)8TA；(3) ISSR-
33：(AG)8AT；(4) ISSR-34：(AG)8AA；(5) ISSR-35：
(AG)8TA；(6) ISSR-56：(AG)8TT；(7) ISSR-74：(ACTG)4；
(8) ISSR-76：(AGTC)4。
3.3 DNA的提取
采集亲本及其子代 H1、H2的叶片，用硅胶快速
干燥后，带回实验室，放入-70℃冰箱备用。采用改良
的 CTAB法提取疑似杂种 H1、H2及其亲本材料的
基因组 DNA (高志民等, 2006)，用 NanoDrop1000微
量核酸蛋白检测仪对 DNA进行纯度和浓度检测。用
0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量，最后将基因
组 DNA定量至 100 ng/μL，-20℃储存备用。
3.4 ISSR-PCR扩增实验
PCR反应体系如下：在 20 μL体积中，含 60 ng模
板 DNA，引物 0.5μmol/L，0.2mmol/LdNTPs，2mmol/L
MgCl2，1 U Taq酶，1×PCRBuffer。PCR程序为：94℃
预变性 3 min；94℃变性 45 s，50~55℃退火 45 s，
72℃延伸 90 s，循环 35 次；72℃延伸 7 min，4℃保
存。扩增产物在 1×TAE缓冲条件下，用 1.6%琼脂糖
胶进行电泳分离，EB染色，采用 Amersham Pharma-
cia的 Image MasterRVDS凝胶成像系统拍照。
3.5数据分析
选择重复性好、多态性强、扩增条带清晰的引物
记录。有扩增位点赋值为 1，无扩增位点赋值为 0，输
入 Excel 2003 中建立特征数据矩阵用于进一步分
析。利用 NTSYS-pc (version2.10e)分析软件对数据进
行分析，采用 Nei & Li 的遗传相似性系数(genetic
similarity, Gs)计算遗传相似系数与遗传距离(genetic
distance, GD, GD=1-GS)，并用 SAHN Clustering进行
不加权成对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析。
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