全 文 ：第1 8卷
1 98 8守 -
第 2期
5月
植 物 病 理 学 报
人C A P T l lY TO P A T l lO L O IC G A SI NI C A
V o l一 5 N o. 2
人 la 3产 1 8 8 9
卜卜 雀麦花叶病毒核酸特性的研究
魏宁生 安德荣
(西北农业大学植保系 )
R
.
K 6e n ig
( 联邦德国生物研究中心 )
提要 对用 两相酚 法提取 的雀麦花 叶病 毒 E株系和 G株系 的R A NS进行 了聚丙烯酞胺凝胶 电泳 , 其结果进一步证
明 R N A 3 a 是 B M V G 株系 中的一个新 RN A 组份 。 在 昆诺妻 _ L进行核酸侵染性测 定 , 也再次证明其核酸的侵 染需要
R N A I
、
R N A 2
.
R N乃 3 。 而 R N A 3a 和 RN A ` 对 其症状表现也有一 定的强作用 . 分别 用 B M V 一E 一 RN A s 和
R N人 a3 做 模板 , 合成其互补D N A ( C一 D N A ) . 采用 N o r t五e rn B l ot 杂交 分析 法分别 和 E株系 、 G株系 的R N A组份
进行分子杂交实验 , 发现 R N A 3泣和 R N A 介的核背酸序列有 同源性 . 这说 明 R N A 、 属于 RN A s 的亚菜组份 . 而不
是原来推测 的卫星 RN A .
1 9 4 2年 M e k i n n e y l ’ ] 等在美国 J甚萨斯州首次在无芒 雀 麦 ( B r o 。 ; 。 、 ￡, Ze r , , 21、 L e y s s ) 上
发现并报道了雀麦花叶病毒 ( B r o r n e M o s a i e V i r u s一 B M V ) . 1 9 7 2年 L a n 。 I Z J等用聚丙烯
酞胺凝胶 电泳证明自然的 B M V粒子中有 4种 R N A组份 , 分别以 R N A , 、 R N A Z 、 R N A 。 * `三种
情况被包 fnJ 在核蛋 自外壳 内 , 并且证明引起 B M v 的侵染需要 三 种 R N A 、 ( R N A , 、 R N A Z 、
R N A
:
)
。 作为球状病毒粒子的典型代表 , B M V比其它病毒产量高而稳定 , 易从植物组织 ,护
分离提纯 , 并且 BM V具有多组份的粒子和多组份的基因组 ( R N A ) . 因此对 B M V的深入研
究可为病毒的理化特性 、 遗传分析及多分体病毒的研究提供一个理想的模式 。 1 9 8 2年魏宁生
和 H 。比 闹 在西德联邦生物研究中心进行雀麦花叶病毒德国株系 ( B M V一 G ) 与 英 国 株 系
~ ( BM V一 E ) 病毒粒子的比较研究时 , 发现 B M V一 G中有 5个 R N A 组份 , 比典型株系 (B M V
一E )多一个 R N A 3 a , 其分子量为。 , 5 2 欠 x o 6 , 但R N A 3 a的属性尚未 能 确 定 。 从 x g 8 4一 19 8 7
作者分别在西北农业大学植保系病毒研究室和联邦德国生 物研 究 中 心 对 B M V 一 G和BM V
一E株系的多组份R N A做了进一步的研究 .
材料和方法
. 如卜
(一 ) 病毒的提纯
采用聚乙二醇沉淀和差速离心 ( 2 0 , o o o r p m , 5分钟及遵。 , o o o r p m , 。o分钟 ) 的方法分别得到 B M V 一G
和 B M Vwe E株系病毒粒子的精提纯制备物 。
(二 ) B M V总核酸 ( R N A s )的制备
用 S D S一皂土一酚法 slI 分别从提纯的B M V一G及 B M V一 E株系中提取 R N A s 。
(三 ) B M V一G 及 B M V 一 E株系各种 R N A组份的制备
用聚丙烯酞胶凝胶 电泳分离两株系 .为R N A s , 凝胶浓度为 2 . 5 %丙烯酞胺一双丙烯酞胺 。 电泳缓冲液为
P D缓冲液 ( z O . s g T r主s + 5 . 5 9硼酸 + 0 . :〕了Z g E D T A , 溶于 z 00 0m l蒸馏水中 , p H S . 4 ) 。 电泳后的 凝胶 用
。 , 1%醋酸固定 10 分钟 , 。 . 2%的甲基蓝或。 . 05 %的甲苯胺蓝染色 10 分钟或 30 秒 , 然后用蒸馏水褪色 , 观察
、洲|
4 7植 物 病 理 学 报 阳卷
色带 , 测出两株系各R N A 组份迁移的距离。
用薄刀片分另}{将凝胶上的各个 R N A 色带切下并捣碎 , 用 R N A 接种缓冲液 ( 10 m M N a A c + l m M M g
( A c ) : + 0
.
0 5% 皂二I: , p H S . 5 ) 在 o一 I O C下浸泡 2小时 , 并不停搅拌 , 然后离心 ( 60 0 0 r p m , 5分钟 ) , 分
别得到 R N A : + : 、 R N A 3 、 R N A 3 。和 R N A . 各组份的上清浓 。 然后 用 冰乙 醇沉 淀 各 R N A 组 份 , 再 离 心
( 6
, 。o o r p m , 10 分钟 ) , 收集各R N A组份的沉淀 , 然后用蒸馏水悬浮 , 紫外扫描测定各R N A 组份的浓度 。
(四 ) 核酸的俊染性测定
将上述收集的各R N A 组份进行不同组合 (见表 2 ) , 磨擦接种于 5一 6叶期的昆诺菜 ( C h en o p o d iu m
口iu n o a ) 土 , 每组合接种 10 个叶片 , 重复 2次 , 在室温 20 一 25 O C下培育 10 天 , 并统计枯斑数 。
(五 ) 互补 D N A杂交试验
1
. C一 D N A的制备 : 用低溶点琼脂糖凝胶电泳分离和制备作为模板的 R N A sa [’l , 用脱氧核糖核酸酶
( D N as el ) 裂解 10 m g牛胸腺 D N A 来制备随机引物 【` ] 。 取 6川溶化的低溶性琼脂糖 凝 胶 ( R N A 含 量 为
0
.
5协g) , 加 2 . 5 时 随机引物在 65 O C 水浴 中加热 5 分钟 , 随后加入以下各化合物 : 1 . 2 5时 随机引物缓冲
液 ( l o om M M g e l : 、 s o o m M K C I、 i o om M D T T 、 4 om M N a ` p Z o 7 ) 、 0 . 2协IR N A酶抑制剂 ( 7 . 5个单位 ) 、
反 应 底 物 ( s n M d A T p 、 d G T p 、 d T T p 及 4 0 0 p M d C T p ) 、 1林一a一 3 2 P一 d C T P ( 3 00 e s / m M , i o o e i /
川 ) , 最后加人 。 . 5川 (5 个单位 ) 禽类白血病毒 ( A M V ) 反转录酶 , 在 37 O C 保温 90 分钟 , 然 后 加入
6
.
5协1 z N N a 0 H 、 0 . 5协1 s o om M E D T A , 6 o o c 保温 6 0分钟 , 终止反应并水解模板 R N A , 加 l件1 I M T r i s -
H e l p H 7
.
o和 6 . 5 ;`1 I N H e l中和上面加入的N a o H , 使反应液呈 中性。
将上述反应混合液通过预先用 l o m M N a C I 、 z m M E D T A , l o m M T r i s H C I p H s . o平衡过的 S e p h a d e x
G 50 柱 ,用上述平衡液洗脱 1 5次 (舟次 10 川 ) 。 收集每次洗脱液 ,并用液休闪烁计数器测 c p m ,收集第一个放
射峰 。 以 E 一R N A s (0 . 5“ g) 做模板合成其 c D N A 的方法均同于上述。 2 .制备N or ht er n lB ot 一一即将两株
系的 R N A组份转移到硝酸纤维膜上 : 首先用 1%琼脂糖凝胶和 60 %去离子的甲酞胺 电泳分离两株系R N A组
份 I` 1 。 电泳后 ,在 2 0 x s s e (3M N a e l , o . 3M N a 一 e i t r a t e , p H 7 . o ) 溶液中通过滤纸吸附将凝胶上的各R N A
带转移到预先用 2 0 x S S e 平衡过的硝酸膜上 〔S e h ze i e h e r a n d S h a e l l , B A s s ) , 一般需要 22一 18小时 。
将硝酸纤维膜烘干 ( s o O C 、 2小时) 。 3 . e D N A 分子杂交 : 预 先用 忿% H C o N H : 、 s x S S C 、 0 . 2 % B S A 、
o
。
02 % F i c o l l
、
0
.
0 2% P V p
、
s om M N a 3 p o . p H 6
.
5 及2 50协g /m l变性蛙鱼精子 D N A 的缓冲液对 N o r t h e r n
B lo t进行预杂交 ( 4 2 ” C 3小时 ) 。 在 上述预杂交缓冲浓中加人 1 / 1 0体积的 变性 c D N A ( z o 0 O C 7 分钟后 ,
立即在冰永浴中冷却 ) 组成杂交缓冲液 , 和预杂交后的No r ht er n lB ot 进行c D N A 分子杂交 ( 42 O C 、 18 小
时 ) 。 4 . 杂交后的洗脱和检测 : 分别用 2 x s s c / 。 . 1肠 S D S和 。 . l x S S C / 。 . 1 % S D S溶液在室温下洗脱 20 分
钟及在 50 O C 下 洗脱 30 分钟 。 以除去非特异性杂交 休。 然后 烘千 ( 40 C 30 分钟 ) , 在 一 70 O C 下 ,
用放射自显影检查杂交结果 。
月月知日
试 验 结 果
(一 ) B MV的R N A组份
B M V一G和 B M V一 E株系的R N A s同时在凝胶板上的电泳结果表明 (表 l) : G 株 系 的
R N A s 电泳后为 5条色带 , 比典型的 E株系多一条带 , 其大小介于 R N A 3与R N A `之间 , 分子量
为 o . 5 2 X l o 6 , 称为R N A 3 a 。 G株系的其它 4条色带R N A , 、 R N A Z 、 R N A 3 、 R N A `的迁移率
均与E株系相同 , 说明R N A a3 是 B M V 一 G株系中的一个新核酸组份 . 这一结果在后来进行大
量制备G株系和 E株系的各R N A组份时 , 无一出现例外 ,
. 曰 . .
}
2 期 魏宁生等 .雀麦花叶病毒核酸特性的研究
表 1BMV 一 RA N s在P A G上的迁移距离
G 株 系 E株 系
叫州洲黔` 1角川
2 …` · “ …“ · 32 …2 · 2 。 …“ …’ · 7。 …2 · ” {
:`
{
“ · 0’
{
“ · 9。 …” · 8 0 13{ “ · ` 0{ 2 · 。 o…
` 】2 · 2 6】 3· 6` 】 3· 5 。 … 】 】 1二二里兰上兰二二笠 · 。。 {
重 复
l
2
`
0 1
2
.
2 2
2
,
9 1
(二 ) 核酸的傻染性侧定
用凝胶 电泳制备的各种R N A 组份 进 行
不 同组合后接种于昆诺黎上 , 10 天后统计枯
斑数见表 2 。 从表 2可 以看出 : 1 . B M V 核酸
的侵染需要三个大分子的核酸组份 : R N A , 、
R N A
Z
、
R N A
。 , 缺乏 R N A 3的核酸组合没有
侵染性 . 2 . R N A a3 和 R N A `不能决 定 其 核
酸侵染性 ,但其对症状的表现却有加强作用 。
此外 , R N A 3 a 也不能单独发生侵染 .
表 2 R N A不同组合的侵染性测定
、心·羚…一…一11之二黔 : ……: …
l十 2十 3+ 4
·一…· · · 1十 2一…一l 7 2 2
2 2 2 7
3 9 4 9
注 : 每组份R N A 浓度为 2卜g加 1: 每数据均代表 10 个半叶的平均枯斑 数
(三 ) c O N A分子杂交试验
凝胶 电泳后 , 两个株系的各R N A 组份通过滤纸吸附转移并固定在N o r t h e r n lB ot 上 , 用
分别以 E 一 R N A s ( R N A I 、 2 、 3 、 4 、 )不r[R N A 3 a 为模板反转录合成 的 e D N A 进 行 N o r t h e r n B l o t
杂交分析 , 放射性自显影结果见图 l 。 1 . 以E 一 R N A s 为模板反转录合 成 的 。 D N A 和 G一 R N A s
( R N A I
、
2
、
3
、
4
、
)
、
E一 R N A s 各个核酸组份杂交后 ,其 e D N A 和每个核酸组份包括R N A 3 a都
有杂交反应 , 说明 R N A a3 和 R N A I 、 2 、 3 、 4中某一组份具有核昔酸序列同源性 。 2 . 以R N A a3 为
模板的 c D N A 和 G 株系的 R N A I 、 2 、 a3 、 4各个组份杂交后 , 其 。 D N A 仅和 R N A 3 、 R N A 3a 有
很强的杂交反应 . 很明显 , R N A : a 和R N A 3具有核昔酸序列同源性 , 证明这一新的核酸组
份是属于 R N A 3的亚基因组份 .
讨 论
1
. 本实验采用凝胶 电泳对 B M V一 G株系的核酸进行多次重复试验以后 , 进一步证实 R N A
a3 是 B M V一 G株系中的新R N A 组份 . 这一结果和魏宁生等的报道一致 。` 1 . 核酸的侵染 性结
果表明 , R N A 的侵染需要 R N A , 、 R N A : 、 R N A 3 . 缺乏 R N A : 的 R N A 。则不能发生 侵染 , 过
去的研究证明 R N A ,具有编码外壳蛋白的基因序列 s[] 。 它对侵染和症状表现起着 决 定 的 作
用 , 而对 R N A I 、 RN A : 的许多研究 t7 ,尚未得出一个明确的统一结论 。 R N A a3 在 病毒的遗
传 , 侵染、 繁殖 、 传播等中所起的作用尚不清薄 , 需要进一步研究 ,
、J|叫|7 6植 初 病 理 字 难 , 8卷
!
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||州l
e
R N人卜 R加A z
R N人 s
R N A s a ( G )
R N A `
图 1 N o r t h e r n B l o t e D N A杂交 白显影结果
1
.
G一 R N A s 各 组份和 以 R N A 3 a 为模板的 c D N A杂交结果 ,
R N人 s 及 R N A 3 a 和c D N A形成杂交体 , 它们具有核背酸序列同源性
2
.
3
.
G 一R N人 s及 E一 RN A s和以 E一R N人 s为模板 的cD N A杂交结果
?
日J月习
2
. 互补D N A杂交技术的出现和利用 , 为病毒的检测 、 鉴定 、 分类等方面提供了 一 个 强
有力的工具 s`] , 特别是利用“ D N A研究多组份基因病毒中不同 RN A组份之间序列同源 性 方
面 , 它更具有快速 、 准确等特点 。 本文采用随机引物合成的放射性标记 。 D N A , 其 a 一 。 Z P 的
结合率〔I解or p or at io n 〕达 20 肠 。分别用E 一 R N A s和 RN A 3a 为模板合成的 c D N A和各个 核酸
组份进行分子杂交 , 首次证明G株系中新核酸组份 R N A a3 属于 R N A 3的亚基因组份 , 从而排
除了 R N A a3 做为卫星R N A的可能性 le .
3
. 作者在和W . H ut h教授 (联邦德国生物研究中心 )的合作研究中发现 , 如果将G 一 R N A s
(包括 1 、 2 、 3 “ 、 4 ) 接种到昆诺黎上 , 接种后每隔 2天对植物组织中的R N A组份进行检测 (两
相酚抽提病毒 R N A后 , 进行 1呱琼脂糖凝胶和 60 呱去离子的甲酞胺 电泳 ) , 发现 RN A a3 在 昆
诺蔡上消失 。然后再将昆诺蔡上的德国株系转接到大麦上 , 则 RN A a3 在 4 , 6周 后 又 逐渐 出
现 , 在大约 10 周后 , 其分子量逐渐稳定为 0 . 52 x 1 .0 。 在对这一重新出的RN A 一 a3 和 原 来 的
RN A a3 进行 c DN A杂交试验表明 , 它们完全是属于同一种R N A , 都是R N A a3 的 亚 基 因 片
段 二 这一现象可能是由于大麦组织内某些大分子物质在病毒R N A进行复制时 , 引起 R N A a3
的降解所致 . 另外 , 这一发现还提示我们以上变化在一些植物病毒与不同寄主组合的相互关
系中决不仅是个别现象 , 而可能具有一定的代表性 . 换言之 , 不 同寄主植物对 病 毒 的R N A
组份是会有影响的 。这种影响作用到底有多大的普遍性尚有待今后的进一步研究加以证实 ;但
是在研究病毒 R N A 组份及其机制时必须考虑到这种影响作用却是不容置疑的 。
(
’
19 8 7年9月 1 6 日收稿 )
2期 魂宁生 等 :雀麦 花 叶病毒核酸特性 的研芜 7了
参 考 文 献
.、 1 .入 la k ie n ny , 壬1 . -1I . o t a l . z o 4 2 . P h y t o P a t o o lo g y 3 2 : 3 3 1 .
2
.
L a n e
,
L
.
C
.
e t a l
.
19 了1 . N a t u r e N e w B io lo g y 2 32 : 峨。一 4 3 ,
3
. 康 良仪等 . 王98 4 . 微生物学报 2 4 ( 2 ) : 13 4一 23 习.
4
.
G
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l l i t
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,
D
.
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.
l o s s
.
V i r o l
.
M e t h o d s x l
: x 4 1一 l 叹4 .
5
.
T a y l o r
,
J
.
M
.
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.
l o 7 6
.
B i o e h e m
.
B i o P h y s
.
A
e t a 4 4 2
: 3 2 4一 3 30 .
6
. 魏 宁生等 . 1 0 5 4 . 植物病理学报 1 4 ( 2 ) : 7 1一 7 5 .
7
.
B o e k s t a h l e r
,
J
.
E
.
a n d K a e s h e r g
,
1
’ 一。 135 . V i r o lo g y Z 了 : 选一s一在2 8 ,
8
.
B
“ r g e r m e i , t o r , w . e t a 工. 1 9 s 6 . P h y 亡o p a th o lo g y 2 15 : 刃￡。一君4召 .
. 臼臼
S T U D IE S O N R N A C HA RAC T E RIZ AT IO N O F T HE B ROM E M O S AIC V IR U S
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e i 卜l i n g s h e :一g A n D c r 。 且 g
( D e 户a r t m e z :亡 〔 ,了 P不a 。盆 P r o t e一: t玄。刀 , N o r t人一 w e s t o r r : A g r 云e “ 不t u r a 乙 U ” 乞v c r : 云t y o f P R C )
R
.
K 瓦 1 9
( I o s t止r u t e 。了尸乙a r: t 、 , i r o 不0 9夕 , B i o不0 9玄e a 工 R e s c a r e 几 C 。 , :七。 r r o f F R G )
. 门卜
D i f f e r e n t e o m p o n e n t s o f t l l e t w o B M V s t r a i n卜 R N A a r e i s o l a t e d b y m e a n s
0 f t w o p h a s e s p h e n o l m e t七o d i n t h e p r e s e n e e o f b e n t o n i t e a n d S D S . T h e
r e s u l t s o f p o l y a e r y l a m i d e g c i
一
e l e e t r o p h o r e s i s o f B人在V 一 R N A s f u r t h e r e o n f i r x n
t h a t B M V
一 G 11 a s a n e w e o 皿 p o n e n t R N A 3 a . T h e i n f e e t i v i t y o f m i x t u r e s o f
d i f f e r e n t RN A
e o m p o x i e n t s h a : b e e n i n v e s t i g a t e d o n C h口 n o夕 o d i “ m a u i n o a . T h e
i n o c u l a t i o n r e s u l t s r e v e a l t h :
: t t li e 、 h r e e l a r g e : t n u e l e i e a e i d e o n一p o n c n t s a r e
r e q u i r e d f o r i n f e e t i o n
, a n d : h e a d d i t i o n o f R N A 3
a a l d R N A 4 e a n i n e r e a s e t h -
e 1 r i n f e e t i v i t y
.
T h e e D N A s t o t h e B人叹V 一E 一 R N A s a n d R N A 3 a w e r e p r e p a r e d
b y r e v o r s e t r a n o e r i p t i o , 1
.
N c r t h e r z: b l o t h y b r i d i z a t i o n w i t h E一 R N A s a n d G -
R N A s r e v e a l t h a t t ll o n u e l e o t i d e s e q u e n e e il o m o l o g y b e t w e e n R N A
5 a n d
R N A 3 a 至5 p r e : e n t . R N A 3 a b e l o n g s t h e s u b g e n o m i e R N A o f R N A 3 .
. `