全 文 ：Vol. 36 No. 5
May 2016
第 36卷 第 5期
2016年 5月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
收稿日期：2015-02-02
基金项目：国家科技支撑计划课题（2011BAI01B06）
作者简介：李单琦，硕士研究生 通讯作者：郑郁善，教授；E-mail：zys1960@163.com
引文格式：李单琦，谢德金，王汉琪，等 . 福建柏遗传多样性 ISSR 分析 [J]. 中南林业科技大学学报，2016, 36(5): 63-67, 78.
Doi:10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.05.012 http: //qks.csuft.edu.cn
福建柏 Fokienia hodginsii 又称建柏，为裸子
植物门柏科纲福建柏属的单一种植物 [1]。从福建柏
叶片中提取出的精油，具有杀灭蚊虫作用 [2]。福
建柏是一种古老的孑遗植物，也是我国珍贵的濒
危物种，被列为国家Ⅱ级保护树种，为福建省乡
土树种 [3]。现阶段福建柏研究主要集中在群落研究、
造林研究、育苗研究、种源研究等方面，对其遗
传多样性仅从过氧化物同工酶角度进行粗略的分
析 [4]，为了研究福建柏致濒机理以及提出切实可
行的保护策略，有必要从 DNA 分子水平上对其遗
传多样性进行深入研究。
ISSR DNA 分子标记技术（简单重复序列 inter
simple sequence repeat）[5] 最早于 1994 年由加拿大蒙
特利尔大学的 Zietkiewicz 教授等人提出 [6]。这种标
记根据广泛存在于植物中的微卫星序列（SSR）[7]，
在其 3′ 或 5′ 端加上 2 ～ 4 个非重复随机的核苷酸
序列作为 PCR 反应引物 [8]，引起特定位点退火并
对间隔不大的重复序列间 DNA 片段进行 PCR 扩
福建柏遗传多样性 ISSR 分析
李单琦 a，谢德金 b，王汉琪 b，周少卿 b，荣俊冬 b，何天友 b，郑郁善 b
（福建农林大学 a.艺术园林学院；b.工业原料林研究所，福建 福州 350002）
摘 要：采用 ISSR 分子标记技术，对我国濒危植物福建柏的 7 个种群进行遗传多样性分析。结果显示：17 个引
物共扩增出 202 个位点，多态性位点 167 个，占总位点的 82.67%；引物 UBC849 可以将 24 份福建柏样本完全
鉴别出来；7 个福建柏种群的多态位点百分率在 17.82% ～ 54.95% 之间；群体总观测等位基因数 Na 为 1.821 8，
有效等位基因数 Ne 为 1.431 3，Nei 指数为 0.258 2，Shannon 指数为 0.394 0；种群内平均 Na 指数为 1.372 0，平
均 Ne 指数为 1.289 2，平均 Nei 指数为 0.160 0，平均 Shannon 指数为 0.203 5；基因分化系数 Gst 为 32.41%，种
群间基因流 Nm 为 0.878 0；7 个种群遗传相似度在 0.668 3 ～ 0.806 9 之间，遗传距离在 0.214 5 ～ 0.404 3 之间；
利用 UPGMA 法进行聚类，将泉州市、福州市和龙岩市种群分为第一类，将南平市、三明市和漳州市种群分为
第二类，将宁德市种群分为第三类。
关键词：福建柏；ISSR；遗传多样性；聚类分析
中图分类号：S791.43 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2016)05-0063-05
ISSR analysis on genetic diversity of Fokienia hodginsii
LI Dan-qia, XIE De-jinb, WANG Han-qib, ZHOU Shao-qinb, RONG Jun-dongb, HE Tian-youb, ZHENG Yu-shanb
(a.College of Arts & Landscape Architecture; b. Industrial Raw Material Forest Institute, Fujian Agriculture and Forestry University,
Fuzhou 350002, Fujian, China )
Abstract: This paper studied the genetic diversity of 7 populations of endangered plants Fokienia hodginsii by using ISSR markers
technique. The results showed that 17 primers amplification 202 loci, 167 polymorphic loci, accounting for 82.67%. The 24 samples
could be identified efficiently by primer UBC849. The percentage of polymorphic loci was between 17.82% and 54.95%, at species level
the observed number of alleles was 1.8218, the effective number of alleles was 1.4313, Nei’s genetic diversity was 0.2582, Shannon’s
index was 0.3940, at population level they were 1.3720, 1.2892, 0.1600 and 0.2035. The gene differentiation coefficient was 32.41%
and gene flow was 0.8780. The genetic identity was between 0.6683 and 0.8069, the genetic distance was between 0.2145 and 0.4043.
Through cluster analysis by UPGMA, the 7 populations of Fokienia hodginsii were classified into 3 groups, the first group including
populations of Quanzhou city, Fuzhou city and Longyan city, the second group including populations of Nanpin city, Sanming city and
Zhangzhou city, the last group was population of Ningde city.
Key words: Fokienia hodginsii; ISSR; genetic diversity; clustering analysis
李单琦，等：福建柏遗传多样性 ISSR分析64 第 5 期
增 [6]，再根据谱带类型对各样品的遗传多样性等进
行分析 [9]。ISSR 标记以其引物设计简单、产物具
有较好的稳定性与多态性 [10]、重复性好 [11]、DNA
用量较小、安全性高 [12]、技术难度和复杂度较低、
耗时少、成本低等特点已广泛应用于我国特有濒
危植物的研究 [13-16]。本实验对福建省 7 个福建柏
种群的 24 个样本进行 ISSR 分子标记研究，旨在
揭示福建柏遗传多样性水平，研究其致濒原因，
为福建柏种质资源保护提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
本实验所采用的福建柏样品于 2013 年 3 月至
4 月在福建省内各福建柏天然林、人工林和古树进
行采集。7 个福建柏种群信息详见表 1。
表 1 福建柏种群信息
Table 1 The population information of Fokienia hodginsii
序号 种群 样本编号 序号 种群 样本编号
1 泉州市 1 ～ 6 5 龙岩市 17 ～ 19
2 南平市 7 ～ 8 6 宁德市 20 ～ 22
3 三明市 9 ～ 13 7 漳州市 23 ～ 24
4 福州市 14 ～ 16
1.2 实验方法
1.2.1 DNA提取与检测
福建柏基因组 DNA 采用天根试剂盒提取，
并在胡迪科等人 [17] 的基础上加以改进；提取产
物分别经 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳和 NANODROP
2000 C分光光度计分析质量和浓度，于 -20℃保存。
1.2.2 扩增体系
对影响 ISSR-PCR 反应体系的各因素进行梯度
实验筛选，最终确定福建柏 ISSR-PCR反应体系为：
总体积为 20 mL，其中 10´PCR buffer 2 mL，Mg2+
浓度 1.8 mmol·L-1，dNTPs 浓度 0.25 mmol·L-1，Taq
酶浓度 0.25 U，引物浓度 0.7 mmol·L-1，模板 DNA
用量 50 ng，最后用灭菌蒸馏水补齐至 20 mL[18]。
扩增体系为：94 ℃预变性 5 min，接着 94 ℃变性
30 s、48.6 ℃退火 40 s、72 ℃延伸 2 min，此 3 步
进行 40 个循环，最后 72 ℃延伸 7 min，反应完毕
后于 4 ℃环境保存 [19]。
1.2.3 数据处理
对 24 份福建柏样品 DNA 进行 ISSR-PCR 扩
增，根据凝胶成像分析仪观察电泳图上是否有条
带，将同一位点上有条带的记为 1，无条带的记为
0，对每一引物扩增结果建立二元数据矩阵，统计
总位点数和多态性位点数并构建指纹图谱；运用
POPGENE 32 基因软件对此 0、1 矩阵进行分析，
分析指标主要有：多态位点百分率（PPB）、观
测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、
Shannon 多样性指数、基因多样性指数（I）、遗
传分化系数（Gst）、种群总基因多样性（Ht）、
种群内基因多样性（Hs）、基因流（Nm）、遗传
距离与遗传相似度。根据种群间遗传距离，运用
UPGMA 法对福建柏各种群间亲缘关系进行聚类分
析，构建树状聚类图。
2 结果与分析
2.1 引物筛选结果
对 100 条 ISSR 引物进行筛选，最终确定 17
条条带清晰、明亮度好、多态性丰富的引物进行
福建柏 ISSR 研究，同时对每一引物筛选最佳退火
温度。筛选出的 17 条引物占所有引物的 17%，对
供试的 24 份福建柏材料共扩增出 202 个重复性好、
清晰稳定的位点，其中多态性位点 167 个，占总
位点的 82.67%；各个引物扩增出的位点在 9 ～ 16
个之间，平均 11.88 个位点；多态性位点在 5 ～
14 个之间，平均 9.82 个；各个引物检测出的 DNA
片段大小范围在 200 ～ 4 500 bp 之间，说明福建
柏有较长的基因组；各引物扩增结果的多态位点
百分数在 50.00% ～ 100% 之间，平均为 82.09%。
结果显示，17 条 ISSR 引物均能扩增出高多态性的
位点，由此显示了福建柏具有非常丰富的多态性
（详细数据见表 2）。
2.2 指纹图谱的构建
种质资源鉴别是 ISSR 分子标记技术的重要作
用之一，根据引物扩增结果显示的特殊条带，可
以快速有效地进行种质资源鉴别，因此筛选出最
少的引物以获得最大的鉴别能力，对于种质资源
鉴别尤为重要。通过对 17 个引物扩增结果进行仔
细筛选比较后发现，引物 UBC849 可以将供试的
24 份福建柏样本完全鉴别出来，表现出较好的鉴
别能力，扩增结果见图 1。将扩增结果进行数字转
化（有条带记为 1，无条带记为 0），形成特有的
分子身份证编码，为福建柏构建一个基于 ISSR 分
析的 DNA 指纹图谱（见表 3）。
2.3 福建柏遗传多样性分析
多态位点百分率（PPB）指标对于衡量植物种
65第 36 卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
表 2 引物检测结果
Table 2 Test results of primers
引物名称
最佳退火
温度 /℃ 总位点数 多态位点数
多态位点
百分数 /% 引物名称
最佳退火
温度 /℃ 总位点数 多态位点数
多态位点
百分数 /%
UBC815 51.9 16 14 87.50 UBC850 53.2 14 11 78.57
UBC820 52.6 11 10 90.91 UBC851 53.2 9 7 77.78
UBC827 52.2 9 8 88.89 UBC854 54.6 16 13 81.25
UBC835 55.1 9 6 66.67 UBC856 52.2 10 5 50.00
UBC836 48.6 10 7 70.00 UBC857 55.9 14 14 100.00
UBC840 82.6 16 11 68.75 UBC860 52.8 11 9 81.82
UBC843 53.9 13 12 92.31 UBC873 47.2 11 10 90.91
UBC845 54.2 11 11 100.00 UBC895 53.8 9 7 77.78
UBC849 52.8 13 12 92.31
图 1 引物 UBC849 扩增结果
Fig.1 The amplification results by primer UBC849
表 3 24份福建柏样本ISSR身份证编码
Table 3 The ISSR ID code of 24 samples of Fokienia hodginsii
样本编号
标记位点 /bp
330 400 450 570 650 700 850 1 000 1 100 1 250 1 400 1 700 2 000
1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1
2 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1
3 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1
4 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1
5 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1
6 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 1
7 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1
8 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1
9 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1
10 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1
11 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1
12 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1
13 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1
14 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1
15 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1
16 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1
17 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 1
18 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1
19 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1
20 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1
21 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1
22 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0
23 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0
24 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1
李单琦，等：福建柏遗传多样性 ISSR分析66 第 5 期
群间遗传变异水平的高低非常重要，若一个植物种
群的 PPB 值高则说明该种群对于当前环境有较强
的适应能力，可以继续繁衍下去；若 PPB 值低则
说明其环境适应能力较弱，有灭绝的可能性，需要
及时对其采取适当的保护措施。由表 4 可知，7 个
福建柏种群多态位点百分率有较大差异，PPB 值在
表 4 福建柏7种群遗传多样性分析
Table 4 Genetic diversity statistics within 7 populations of Fokienia hodginsii
种群编号 样本数 多态性位点 多态位点百分率 /% Na Ne h I Ht
泉州市 6 111 54.95 1.549 5 1.347 4 0.205 2 0.305 7 0.205 2
南平市 2 42 20.79 1.207 9 1.207 9 0.104 0 0.144 1 0.104 0
三明市 5 101 50.00 1.500 0 1.356 3 0.202 8 0.296 3 0.202 8
福州市 3 83 41.09 1.410 9 1.328 7 0.182 6 0.261 5 0.182 6
龙岩市 3 73 36.14 1.361 4 1.289 1 0.160 6 0.230 0 0.160 6
宁德市 3 80 39.60 1.396 0 1.316 8 0.176 0 0.252 1 0.176 0
漳州市 2 36 17.82 1.178 2 1.178 2 0.089 1 0.123 5 0.089 1
种群水平 3 75 37.20 1.372 0 1.289 2 0.160 0 0.230 5 0.160 0
物种水平 24 166 82.18 1.821 8 1.431 3 0.258 2 0.394 0 0.258 2
福建柏种群基因多样性 Nei 指数分析
Ht Hs Gst Nm
0.258 2 0.174 5 0.324 1 1.042 6
图 2 福建柏 7 种群遗传多样性比较
Fig. 2 The comparison among 7 populations of F’s genetic
diversity
17.82% ～ 54.95% 之间，平均为 37.20%。其中多
态位点百分率最高的为泉州市种群，其次为三明市
种群，说明这两个种群福建柏适应性强，遗传多样
性丰富，遗传基础较宽，是良种选育的最佳种源地；
多态位点百分率最低的为漳州市种群，其次为南平
市种群，说明这两个种群的福建柏适应环境能力较
差，需要加强保护，否则会导致灭绝。
利用 POPGENE 32 软件分别对 7 个福建柏
种群的遗传多样性进行总体和单独分析，结果显
示：7 个种群总体观测等位基因数为 1.821 8，
有效等位基因数为 1.431 3，Nei 遗传多样性指数
为 0.258 2，Shannon 信息指数为 0.394 0，显示了
7 个福建柏种群间丰富的遗传多样性；7 个群体
的总遗传多样性为 0.258 2，种群内遗传多样性为
0.174 5，种群间分化水平为 0.324 1，表明在总遗
传多样性变异中，有 32.41% 的变异存在于种群间，
有 67.59% 的变异存在于种群内；种群间基因流为
0.878 0，表明各种群间存在较小的基因交流，有
增加种群间遗传变异的可能性 [20]。
由表 4、图 2 可知，7 个种群的 Na 指数在
1.178 2 ～ 1.545 9 之间，平均为 1.372 0；Ne 指数在
1.787 2 ～ 1.356 3 之间，平均为 1.289 2；Nei 指数在
0.089 1 ～ 0.205 2 之间，平均为 0.160 0；Shannon 指
数在 0.123 5 ～ 0.305 7 之间，平均为 0.203 5。种群
间遗传多样性由大到小排列为泉州市＞三明市＞福
州市＞宁德市＞龙岩市＞南平市＞漳州市。
2.4 种群间亲缘关系
由表 5 可知，7 个种群遗传相似度在 0.668 3 ～
0.806 9 之间，平均为 0.765 5，遗传距离在 0.214 5
～ 0.404 3 之间，平均为 0.289 5；其中亲缘关系最
近的是福州市与龙岩市种群，亲缘关系最远的是
泉州市和宁德市种群。
表 5 7个种群间遗传相似度(对角线上方)和遗传距离(对角
线下方)
Table 5 Genetic identity (above diagonal) and genetic
distance (below diagonal) among 7 populations
居群 泉州市 南平市 三明市 福州市 龙岩市 宁德市 漳州市
泉州市 **** 0.782 2 0.772 3 0.787 1 0.782 2 0.668 3 0.757 4
南平市 0.245 7 **** 0.802 0 0.767 3 0.782 2 0.707 9 0.797 0
三明市 0.258 4 0.220 7 **** 0.787 1 0.772 3 0.707 9 0.777 2
福州市 0.239 4 0.264 8 0.239 4 **** 0.806 9 0.693 1 0.742 6
龙岩市 0.245 7 0.245 7 0.258 4 0.214 5 **** 0.688 1 0.787 1
宁德市 0.403 0 0.345 4 0.345 4 0.366 6 0.373 8 **** 0.722 8
漳州市 0.277 8 0.226 9 0.252 0 0.297 6 0.239 4 0.324 7 ****
采用UPGMA法构建基于遗传距离的聚类图（见
图 3），7 个种群可以分为三类：第一类包括泉州市、
福州市和龙岩市种群；第二类包括南平市、三明
市和漳州市种群；第三类包括宁德市种群。
67第 36 卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
建柏 7 个种群的基因流为 0.878 0，小于 1，表明
种群间存在一定的遗传分化。
综上所述，导致福建柏成为濒危植物的主要
原因是人为对其生长环境的破坏，导致其居群规
模不断减小，生境片段化，使种群间基因交流减
少，增加了近交和遗传漂变作用。因此，需要及
时采取相应保护措施，抑制福建柏种群的衰败趋
势。首先，应该对现有的福建柏资源进行就地保
护，建立保护区，禁止乱砍乱伐，保护其生长环境；
其次，对福建柏生态学特性进行研究，制定科学
的保护方法；第三，加强人工繁育力度，运用组
织培养或扦插等方式进行大量培育；第四，加大
种群间基因交流，将各种群采集的大量种子和幼
苗进行交换种植，人为增加基因交流，以便更好
地保持、提高福建柏遗传多样性水平。
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图 3 7 个福建柏种群的聚类树状图
Fig. 3 Dendrogram of 7 populations of Fokienia hodginsii
3 讨 论
植物遗传多样性是其所携带遗传信息的总和，
是植物种群生存、发展进化的基础。遗传多样性
水平可以反映出一个植物群体在其生长环境中基
因的丰富程度，也决定其对于环境变化的适应能
力。因此对植物遗传多样性进行研究，可以清楚
地了解到不同地区种群的适应性与生长发展趋势，
对植物种质资源的良种选育工作以及濒危植物的
致濒机理研究等具有重要意义。
多态位点百分率（PPB）指标是衡量植物种群
对环境适应能力的重要指标之一，本研究对福建
省的 7 个福建柏种群的 PPB 进行研究发现，各种
群间有较大差异，表明不同地区环境因素对福建
柏生长有较大影响，其中环境适应力最差的为漳
州市和南平市种群，因此应及时对其进行加强保
护，防止在自然选择过程中被淘汰。
本研究结果表明，福建柏种群间和种群内均
具有较高的遗传多样性 [21]，7 个种群总体观测等
位基因数为 1.821 8，有效等位基因数为 1.431 3，
Nei 遗传多样性指数为 0.258 2，Shannon 信息指数为
0.394 0；种群内观测等位基因指数平均为 1.372 0，
有效等位基因指数平均为 1.289 2，Nei 指数平均
为 0.160 0，Shannon 指数平均为 0.203 5[22]。由此
表明，导致福建柏濒危并非由于遗传多样性的缺
乏，而是受到其他因素影响。
一个植物种群的遗传结构在很大程度上决定
了其进化潜力，而遗传结构主要通过种群间分化
水平体现的，若一个植物种群间遗传分化系数较
高，说明需要保护较多的种群，反之则仅需保护
较少种群。福建省内的福建柏种群间分化水平为
0.324 1，表明遗传变异主要存在于种群内，只需
要对部分种群进行保护。
导致种群间出现遗传分化的主要原因是自然
选择的作用，而基因流是对抗自然选择的重要因
素。一般认为，当植物种群间基因流大于 1 时，
可以防止近交衰退而保持较高的遗传多样性；若
基因流小于 1，则会引起种群间遗传分化 [23]。福 （下转第 78页）
张 妮，等：林地区位等级的确定方法探讨——以长沙市为例78 第 5 期
为《规范》中虽然提出使用区位等级调整林地评
估价格，但未给出具体的调整办法。本研究用层
次分析法量化了影响林地区位等级的影响力，对
长沙市林地区位等级按行政区划进行大体的划分，
得到了长沙市各区县林地区位等级评定结果基本
为一级、二级水平，这与长沙市在湖南省内的社
会经济发展水平最高是相吻合的。可根据实际情
况采用划小区域的方式，更准确地确定林地区位
等级的划分，并编制相应的森林经营数表，以便
更好地为林地资产评估服务。
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[本文编校：谢荣秀 ]
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