全 文 ：　　收稿日期: 2004-01-12
　* 基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30371181) ,浙江
省自然科学基金青年人才培养资助项目 ( R303420)
通讯作者:汤定钦 , E-mail: tang@ zjfc. edu. cn
小佛肚竹和螺节竹总 RNA的提取*
周明兵　汤定钦
(浙江林学院　浙江省现代森林培育技术重点实验室 ,浙江 临安 311300)
摘　要　首次提出了一种适用于小佛肚竹 (Bambusa ventricosa)和螺节竹 (Pleioblastus gramineus)
等竹类植物总 RN A提取方法。 用该方法提取叶片和笋尖的总 RNA具有正常的光谱吸收 , OD260 /
OD280比值为 1. 96～ 2. 0, OD260 /OD230比值为 2. 96～ 4. 11;琼脂糖电泳后 , 28 SRNA的亮度基本为
18 SRN A的亮度的 2倍 ;这说明提取的 RNA很完整 ,未降解 ,质量高。 同时该方法操作简便、无
DNA污染 ,且产率高 ;提取的 RN A可用于 RT-PCR、 Nor the rn杂交、 cDNA文库的构建等。
关键词　小佛肚竹 ;螺节竹 ; RN A提取 ;改良 CT AB法
Extraction of RNA fromBambusa ventricosa and
Pleioblastus gramineus
Zhou Mingbing　 Tang Dingqin
( Zh ejiang Fo res try College, Provincial Key Lab fo r Modern Silvicultural Tech nology,
Linan 311300, Zhejiang, Ch ina)
Abstract　 A RNA ex traction method applicable to Bambusa ventricosa and
Pleioblastu gramineus leav es and tips of bamboo shoo ts w as developed for the fi rst
time. The results show ed that the total RN A from leaves and tips o f bamboo shoo ts
of B . ventricosa and P. gram ineus had the normal spect rum of the ult raviolet ab-
so rption, the value o f OD2 60 /OD280 varied betw een 1. 96～ 2. 0 and O D260 /OD230 varied
betw een 2. 96～ 4. 11 by spectrophotometer, and the brightness of 28SRN A was ap-
proxima tely two times as light as tha t of 18SRN A in maps of elect ropho resis. These
indicated that the to tal RN A was very complete and did no t deg rade. With this
method the pure RN A could be obtained simply, amply , economically w ithout DN A
contaminated, and be used fo r RT-PCR, No rthern blo t and const ruction of cDN A
library.
Key words　Bambusa ventricosa; Pleioblastu gramineus; RN A ex traction; Modi fied
CTAB method
　　竹子作为重要的观赏植物 ,以其秆挺拔秀
丽、叶潇洒多姿、形千奇百态 ,深受人们的喜爱 ,
成为我国园林中不可缺少的组成部分。对众多观
赏竹而言 ,秆形变异与叶颜色变异是其重要的观
赏性状。特形秆作为观赏竹最为常见的变异类型
之一 ,其中又以节间短缩肿胀如小佛肚竹 (Bam-
busa ventricosa cv. nana ) ,秆形扭曲成螺旋状如
螺节竹 ( Pleioblastus gramineus f. monstr . )等
为代表类型 [1 ]。为了从分子水平上 ,研究小佛肚
竹和螺节竹的秆形变异分子机理乃至利用转基
因技术实现观赏竹种的定向化培育 ,我们对该两
竹种总 RNA提取方法进行了探讨。
第 23卷　第 3期
2 0 0 4年 8月　　　　　　　
竹　子　研　究　汇　刊
JOU RNAL OF BAMBOO RESEARCH
　　　　　　　　V ol. 23, No. 3
Aug. , 2 0 0 4
1　材料和方法
1. 1　材料
以小佛肚竹和螺节竹 9、 10月份长出的新
叶和刚萌发出的笋尖为实验材料。
所用试剂均购自于上海生工 ,为新开封的
或专门用于提取 RN A的。无 RNase的水和 Li-
Cl 溶液 经 DEPC 处 理 ( DEPC 终浓 度为
0. 1% ) ,然后高压灭菌。提取缓冲液的成分为:
2% ( W /V 下同 ) CT AB, 2% PV P, 100 mM
Tris-HCl( pH 8. 0) , 25 mM EDTA, 2. 0 M Na-
Cl, 0. 5 g /L Spermidine,混匀 ,灭菌 ,使用前加
入 2%的巯基乙醇并混匀 ; SSTE缓冲液成份
为: 1. 0 M NaCl , 0. 5% SDS, 10 mM Tris-HCl
( pH 8. 0) , 1. 0 mM EDT A。
作为参照的 RNA提取试剂盒 ( RNeasy
Plant Mini Kit )购于 QIAGEN公司。
玻璃器皿在 180～ 200℃烘 6 h左右 ,塑料
器皿和枪头最好用一次性的 ,经 0. 1% DEPC
处理灭菌后待用 [2, 3 ]。
1. 2　方法
取 4～ 5 g小佛肚竹和螺节竹新叶和笋尖 ,
加液氮研磨 ,至粉状后 ,转移到 50 mL离心管
中 ,加入 65℃预热的提取缓冲液 15 mL,颠倒
混匀 , 65℃处理 5 min, 10 000 rpm离心 5 min,
取上清 ,用等体积苯酚 ( pH 7. 8) /氯仿 /异戊醇
( 25∶ 24∶ 1)抽提一次 ,再用等体积的氯仿 /异
戊醇 ( 24∶ 1)抽提两次 , 10 000 rpm,室温 ,离心
5 min,取水相至另一个 50 mL离心管 ,加入 1 /
4体积 10 M LiCl,混匀 , 4℃沉淀至少 6 h。然
后 , 4℃ , 10 000 rpm,离心 20 min,用 2 mL
SSTE溶解沉淀 (或 0. 5% SDS) ,用等体积苯
酚 ( pH 4. 2) /氯仿 /异戊醇抽提一次 ,再用等体
积的氯仿 /异戊醇抽提直至无界面物质为止 ,最
后加入 2倍体积的无水乙醇 , - 70℃沉淀至少
30 min, 10 000 rpm,离心 10 min,去上清 ,用
75%乙醇洗一次 ,干燥沉淀 ,用已灭菌的 DEPC
处理过的水溶解 RNA。
试剂盒 RNeasy Plant Mini Ki t的使用按
附带的操作说明书进行。
2　结果与讨论
利用此方法分离的小佛肚竹和螺节竹新叶
和笋尖 RNA,具有正常的光谱吸收 , OD260 /
OD280比值为 1. 96～ 2. 0, OD260 /OD230为 2. 96～
4. 11,说明纯化的 RNA很完整 (图 1: 1, 2, 3, 4
泳道 ) ,适合于 RT-PCR(图 2)等基因表达调控
研究的需要。 1 g鲜重的叶片可提取 39. 56～
41. 33μg , 1 g笋尖可提取 39. 11～ 42. 22μg总
RNA(表 1)。 总结多次抽取小佛肚竹和螺节竹
总 RNA的实验结果发现 ,叶片总 RNA产率平
均为 40. 10μg· g- 1 ,笋尖总 RN A产率平均为
40. 70μg· g- 1。该方法的整个操作过程可以在
普通实验台上进行 ,方法简便、经济 ,且无 DNA
污染。 此方法同 QIAGEN公司的 RNeasy
Plant Mini Ki t的提取效果相比 ,能有效的克服
DNA的污染 (图 1: 5, 6, 7, 8泳道 ) ,并能达到大
量提取 RNA的目的 ,可应用于 mRNA差异显
示、 cDN A文库的构建等。
图 1　 RNA电泳图谱 (各泳道说明见表 1)
Fig. 1　 Formaldeh yde ag aros e gel of total RN A.
( li sted in tab. 1 in details )
图 2　 RT-PCR M泳道为 Size marke r, 1, 2泳道
为经 RT-PC R扩增出来的 1, 4, kb和 0. 9 kb左
右的片段。
Fig. 2　 RT-PCR of total RN A is olated w ith modi fied
CT AB method. M: 100-bp lad der, line 1, 2: 1. 4 kb and
0. 9 kb DN A frag men ts amplif ied b y RT-PCR.
8　　　 竹 子 研 究 汇 刊 23卷　
表 1　提取 RNA样品的纯度和质量比较
Tab. 1　 Compa rison in amount and purity of t ota l RN A
泳道
Elect ro-
phoresis
path
采用方法
M ethod
提取材料
Materia l
材料鲜重
Fresh weight
of mat erial
( g)
定容体积
Const ant
v olume
(μl)
O D值
OD va lue
( 260/230)
O D值
OD va lue
( 260 /280)
浓度
Concentration
(μg /μl)
RN A总量
Tot al amount
of RN A
(μg )
RN A产率
RNA
productivit y
(μg /g )
1
改良 CTAB法
Improved CTAB
method
小佛肚竹叶片
Leaves of Bambusa ventri-
cosa
4. 50 200 3. 51 1. 98 0. 89 178. 00 39. 56
2
改良 CTAB法
Improved CTAB
method
小佛肚竹笋尖
Ti ps of bamboo shoo ts of
Bambusa ventricosa
4. 50 200 2. 96 2. 00 0. 88 176. 00 39. 11
3
改良 CTAB法
Improved CTAB
method
螺节竹叶片
Leaves o f Pleioblast us-
gram ineus
4. 50 200 3. 10 2. 00 0. 93 186. 00 41. 33
4
改良 CTAB法
Improved CTAB
method
螺节竹笋尖
Ti ps of bamboo shoo ts of
Pleioblastus gram ineus
4. 50 200 4. 11 1. 96 0. 95 190. 00 42. 22
5
试剂盒法
Reagent box
method
小佛肚竹叶片
Leaves of Bambusa ventri-
cosa
0. 10 30 2. 86 1. 89 0. 11 3. 30 33. 00
6
试剂盒法
Reagent box
method
小佛肚竹笋尖
Ti ps of bamboo shoo ts of
Bambusa ventricosa
0. 10 30 3. 34 1. 89 0. 12 3. 60 36. 00
7
试剂盒法
Reagent box
method
螺节竹叶片
Leaves o f Pleioblast us-
gram ineus
0. 10 30 3. 65 1. 94 0. 11 3. 30 33. 00
8
试剂盒法
Reagent box
method
螺节竹笋尖
Ti ps of bamboo shoo ts of
Pleioblastus gram ineus
0. 10 30 3. 80 1. 86 0. 13 3. 90 39. 00
　　从植物组织中提取 RNA是进行植物分子
生物学方面研究的必要前提 , cDN A文库的构
建 , RT-PCR, No rthern杂交都需要高质量的
RNA。因此 ,从植物组织中提取纯度高 ,完整性
好的 RNA是顺利进行上述研究的关键。 由于
RNA易降解 ,纯化完整的 RNA和 m RNA比
较困难。竹类特别是木本竹类植物 ,不同于栽培
植物 ,多生长于野外 ,易受干燥、强光等环境胁
迫。因而应用于栽培植物 RNA提起的常规方
法 ,如 Phenol /SDS法、 G TC法很难满足提起
高质量的 RNA要求。针对实验材料小佛肚竹
和螺节竹的叶片和笋尖含有较高酚类、糖类及
色素的特点 ,我们尝试了改良木本植物常用的
CT AB提取 DNA的方法 [4, 5 ] ,来提取小佛肚竹
和螺节竹的 RNA,获得了较好的效果。
酚类物质是干扰植物 RNA提取的一大障
碍之一 ,在植物材料匀浆时 ,酚类物质会释放出
来 ,氧化后使匀浆液变为褐色 ,并随氧化程度的
增加而加深 ,这一现象被称为褐化效应
( brow ning ef fect)。被氧化的酚类化合物 (如醌
类 )能与 RNA稳定地结合 ,从而影响 RNA的
分离纯化 ,本实验方法在提取的初始阶段成功
地使用 pH值较高的提取缓冲液 ,利用提取缓
冲液中的还原剂 -巯基乙醇和螯合剂 -聚乙烯吡
咯烷酮 ( PV P)有效的防止多酚类物质氧化 ,阻
止了酚类氧化物与 RNA的结合。然后通过 Li-
Cl沉淀 RNA的方法可以将未被氧化的酚类化
合物去除。与 PV P、不溶性 PV PP结合的多酚 ,
可以直接通过离心去除掉 ,或在苯酚、氯仿抽提
时除去。
多糖的污染是提取植物 RN A时常遇到的
另一个棘手的问题 ,糖类物质的许多理化性质
与 RNA很相似 ,在去除多糖时 RNA也被裹携
走 ,造成 RNA产量的减少 [6 ]。 在常规的方法
中 ,通过 SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多
糖 ;通过 LiCl沉淀 RNA也可以将部分多糖留
在上清液中 [7 ]。 但即使通过这些步骤仍会发现
有相当多的多糖与 RNA混杂在一起 ,所以还
需要用更有效的方法来解决植物 RNA分离纯
化时多糖污染的问题。本实验结合竹类植物的
9　 3期 周明兵等　小佛肚竹和螺节竹总 RNA的提取 　 　
这一特点 ,增大提取缓冲液中的 NaCl的浓度
至 2. 0 M和 1. 0 M ,通过氯仿抽提和乙醇沉淀
RNA将 RNA与多糖分离。
另外 ,本实验方法通过在提取缓冲液中的
添加 EDTA和 Spermidine成分有效的抑制了
内源 RNase的活性 ;用 SST E溶解沉淀物后再
用酸酚 ( p H 4. 2)抽提除去残余少许的 DNA,
就能获得非常纯的 RNA。本实验方法与其他提
取 RNA的方法相比 ,需要费用低、简单、快
速 [5 ]。
经研究发现 ,本实验方法适用于糖类和酚
类含量高的植物材料的 RNA的提取 ,故对竹
类 (小佛肚竹、螺节竹 ) RN A的提取能获得较好
的效果。 对于糖类、酚类物质含量低的植物材
料 ,采用此法提取 RNA,反而会导致 RNA的
产率降低。
参 考 文 献
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咏竹诗词选
初食笋呈座中
(唐·李商隐 )
嫩箨香苞初出林 ,於陵论价重如金。
皇都陆海应无数 ,忍剪凌云一寸金。
春日山中竹
(唐·裴说 )
数竿苍翠拟龙形 ,峭拔须教此地生。
无限野花开不得 ,半山寒色与春争。
秋日白沙馆对竹
(唐· 许浑 )
萧萧凌雪霜 ,浓翠异三湘。
疏影月移壁 ,寒声风满堂。
卷帘秋更早 ,高枕夜偏长。
忽忆秦溪路 ,万竿今正凉。
咏　竹
(唐·郑谷 )
宜烟宜雨又宜风 ,拂水藏村复间松。
移得萧骚从远寺 ,洗来疏净见前峰。
侵阶藓拆春芽迸 ,绕径莎微夏荫浓。
诬赖杏花多意绪 ,数枝穿翠好相容。
10　　　 竹 子 研 究 汇 刊 23卷