全 文 ：小佛肚竹（!#$%& ’()*+,-.&）是以特形 秆作为观赏性状的重要观赏竹之一。小佛肚竹 具有正常和畸形2种秆形，正常秆小佛肚竹高 可达 8!10m，径 5!7cm，节间长 20!35cm；畸 形秆小佛肚竹高 25!60cm，径 0.5!2cm，节间 只有2!5cm，短缩肿胀呈花瓶状。在一些特殊 的条件下，通过改变环境因子甚至人为方法，能 够促成畸形秆的形成。 cDNA文库是以mRNA为起始材料建立而 成，代表一定时期正在表达的基因，因此从cD- NA文库比直接从基因组克隆基因要简单得 多。为了从分子水平上研究小佛肚竹秆形变异 的分子机理，本研究构建了小佛肚竹正常杆笋 和畸形杆笋的cDNA文库。 1 材料和方法 !! 材料 以浙江林学院智能温室培养的小佛肚竹笋 尖为实验材料。经过人为调控，在一丛小佛肚竹 内能够萌生杆形正常和畸形两种不同单株。经 过多次观察和验证，在笋期（笋高10cm以上） 分辨秆形分化的特征依据是：畸形杆笋为笋箨 小佛肚竹cDNA文库的构建与分析 周明兵 王晓飞 汤定钦 （浙江林学院浙江省现代森林培育技术重点实验室，浙江临安311300） 摘 要 以同一丛小佛肚竹新萌生的正常杆笋尖和畸形杆笋尖为材料，分别提取总RNA，经纯化成mRNA 后，合成cDNA双链，以Uni-ZAPXRvector为载体，构建了两个cDNA文库。正常杆笋和畸形杆笋cDNA 文库的滴度分别为7.4109pfu·mL-1和8.7109pfu·mL-1，含插入片段的频率均达到是99%以上，插入片段 的大小均在500!3000bp。这两个cDNA文库的成功构建为探究小佛肚竹秆形变异的分子机理奠定了基础。 关键词 小佛肚竹；秆形变异；cDNA文库 ConstructionandAnalysisofcDNALibraries in!#$%& ’()*+,-.&
ZhouMingbing WangXiaofeiTangDingqin
（ProvincialKeyLabforModernSilviculturalTechnology，ZhejiangForestryColege，Linan311300，Zhejiang，China）
#$%&’()& ThetotalRNAwasextractedfromthebambooshootsofnormalandabnormalinternodeof!#$%&
’()*+,-.& respectively.AftermRNAwaspurified，cDNAlibrarieswereconstructedwithmRNAusingUni-ZAPXR
vector.ThecDNAlibrariesofnormalandabnormalinternodeconsistedof7.4109pfu·mL-1and8.7109pfu·mL-1
respectively.BothcDNAlibrariescontainedover99%recombinantphages，inwhichinsertsrangedbetween500bpand
3000bpinsizes. ThesuccessfulconstructionofthecDNAlibrarieshasestablishedabaseforthestudyonthe
molecularmechanismofinternodalelongationin!#$%& ’()*+,-.&. *+, -.’/% !#$%& ’()*+,-.&；Internodalvariation；cDNAlibrary
收稿日期：2005-06-07
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30371181），浙江
省自然科学基金青年人才培养资助项目（R303420）
通讯作者：汤定钦，tang@zjfc.edu.cn
竹 子 研 究 汇 刊
JOURNALOFBAMBOORESEARCH
第24卷 第3期
2005年 8月
Vol.24，No.3
Aug.，2005
第 !卷竹 子 研 究 汇 刊
疏散、有花瓶状肿胀手感；正常秆形笋为笋箨
紧实、手感顺直。
mRNA纯化试剂盒 polyATtractamRNA
IsolationSystemsKit购自 Promega公司，cDNA
文库合成试剂盒ZAP-cDNAaSynthesisKit和
ZAP-cDNAaGigapackaII均购自 Stratagene
公司，其他试剂除特别说明外购自上海生工生
物工程公司。
!# 方法
!#! 总RNA的提取和mRNA的纯化 总
RNA的提取采用改良CTAB法，该方法已成功
地提取了几个竹种总 RNA [1]。总 RNA经
polyATtractRmRNAIsolationSystemsKit试剂
盒纯化为mRNA，具体的操作按照试剂盒附带
提供的说明进行，其原理是通过生物素标记的
Oligo（dT）引物和mRNA复性，利用SA-PMPS
磁珠富集 mRNA，从而达到纯化 mRNA的目
的。
!## 合成双链 cDNAcDNA的合成参照
Stratagene公司的ZAP-cDNARSynthesisKit试
剂盒附带提供的操作说明进行，略作改良。主
要 的 操 作 步 骤 是 以 mRNA为 模 板 、以
5`GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCT
CGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3`为引物（引物
内有一个XhoI酶切位点）合成第一链cDNA，
然后用RNaseH处理mRNA-cDNA杂交分子，
使mRNA断裂为小片段，再以这些片段为引
物，由DNApolymeraseI合成cDNA第二条链。
!#$cDNA文库构建 双链 cDNA在 T4DNALigase作用下，两端连上 EcoRI Adaptors，加臂的连接产物经XhoI酶切后通过 SepharoseCL-2BGelColumn进行分级分离，收 集大于500bp的cDNA。再将片段大小合适的 cDNA与Uni-ZAPXRvector载体相连，连接产 物用包装蛋白包装，即为初级文库。取1!#初 级文库经$%&$、$%&!稀释后，各取$!#上述稀释 物加入 !%%!# 经过夜培养的大肠杆菌 ’#$&
()*+， 让 其 在 ,-. 下 温 浴
,% /01，加入 ,23 /# 融化的 456 789
:;<=8>+ ?456 培养基：$@ 45&:/01+，%23@
6+<>A BCA=颠倒混匀后并迅速倒在 ,-.预热的 K% //
的 456 :;<= 平板上，室温中放置 $% /01 后，在 ,-.下倒置平板温育$%L$!M后，计数噬 菌斑，计算初级文库的库容量。 根据初级文库的库容量，分别将正常笋初 级文库和变异笋初级文库分成$N等份和!%等
份，转染于大肠杆菌 ’#$&()*+，用 FE O*PP+= Q3% /E 7=0> &HI) （9H -23），$%% /E
4回收噬菌体，最后分装于 $23 /#的离心管中， 加 -@ XEFG成 DX4:次级文库，于&-%.下 保存。 !#% 滴度的测定 取$!# DX4:次级文库
经 $%&-、$%&N、$%&K稀释后，采用与检测初级文库 库容量的相同方法，计数噬菌斑，计算文库的滴 度。 !#& 插入片段大小的检测 从检测初级文 库库容量的NZYAgar平板上随意挑取10个单 噬菌斑，释放到SMbufer，取1!#过夜培养物 为模板，以 M13（+/-）为引物进行 PCR扩增， PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳，分析插入 cDNA片段的大小。 2 结果与讨论 #! 双链 ’()*的合成及分级分离 从小佛肚竹正常杆笋和畸形杆笋提取总 RNA，在1.2%琼脂糖凝胶电泳上检测，可观测 到28srRNA、18srRNA等条带，且28srRNA条 带的亮度基本上为18srRNA的两倍，无拖带现 象，表明所提取的RNA完整，基本无降解（见 图1A）。纯度较高，具有正常的光谱吸收，正常 杆笋 RNA的 OD260/OD230为 3.1，OD260/OD280为 1.9；畸形杆笋 RNA的 OD260/OD230为 3.0， OD260/OD280为2.0。经纯化后的mRNA依然具有 正常的光谱吸收，正常杆笋 mRNA的 OD260/OD280 为 1.84； 畸 形 杆 笋 mRNA 的 OD260/OD280为1.91，符合文库构建的质量的要 求(见图1，B)。 反转录合成的cDNA双链主要集中在500 bpL3000bp之间（见图 1C），双链 DNA通过 SepharoseCL-2BGelColumn分级分离后，用 1.5ml离心管收集cDNA，将片段长度在500bp 以上的cDNA混合，用GigapackIIXLpackaging 6 A.AgarosegelelectrophoresisofRNAfrombambooshoots（1.normal；2.abnor al） B.AgarosegelelectrophoresisofmRNAfrombambooshoots（1.n r al；2.abnormal） C.AgarosegelelectrophoresisofcDNA（1.normal；2.abnormal） D.InsertedfragmentsincDNAlibrary（1-10:DNAfragmentsamplifiedbyPCR） 1 2 28s 18s 1 2 M 3kb 500bp M 1 2 3kb 500bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M ——3.0kb ——500kb extract包装，建成初级文库。 !! cDNA文库质量检测 初级文库构建完成后，检测其库容量，正常 杆笋cDNA文库的库容量为9.4#105pfu，畸形 杆笋的库容量为1.0#106pfu。文库的重组率均 达到为99%以上。以文库中分别随机挑取10 个单噬菌斑为模板，以M13（+/-）为引物PCR， 扩增片段长度处在0.5~2.0kb（见图1，D）。 将初级文库放大后即为次级文库，检测其 滴度，正常杆笋cDNA文库的滴度为 7.4#109 pfu·mL-1，畸形杆笋cDNA文库的滴度为8.7# 109pfu·mL-1，达到文库构建的要求。 !$ 讨论
在构建 cDNA文库时常出现下列问题：
（1）cDNA第一链太短或产量太低，这些问题
一方面可能是出自于cDNA第一条链合成中的
任一组分（酶、缓冲液）的质量及加入量的精确
性，但更多情况下，是由于用作模板 mRNA的
! #
D
图1 cDNA文库的质量检测(M为DNAsize marker)
A.RNA电泳（1.正常杆笋，2.畸形杆笋） B.mRNA电泳（1.正常杆笋，2.畸形杆笋）
C.cDNA的合成（1.正常杆笋，2.畸形杆笋） D.cDNA文库插入片段检测（1-10为扩增片段）
Fig.1 AnalysisofcDNAlibrary（M:100-bpDNAladder）
周明兵等 小佛肚竹cDNA文库的构建与分析第3期 7
第 !卷竹 子 研 究 汇 刊
质量低劣；（2）文库中cDNA插入片段的长度
小于期望值，该问题一般是由cDNA第二条链
的合成效率不足，以致产生含有部分mRNA的
cDNA双链或者小片段DNA的污染等造成。
因而获得高质量的 mRNA是构建高质量
cDNA文库的基础。RNA易被RNA酶所降解，
而RNA酶广泛存在，且不容易失活，因此建立
一个无 RNA酶的环境对于制备优质 RNA非
常重要[2]；另外mRNA在体外很容易降解。本研
究采用在技术较为成熟的改良CTAB法提取了
总RNA，用polyATtractRmRNAIsolationSystems
Kit纯化了mRNA，整个实验在低温（4#）下，
在尽可能短的时间内完成操作，确保了mRNA
的质量。
建立cDNA文库的目的是为了筛选所需要
克隆的基因，因此插入片段大小非常重要。为
了保证文库中cDNA插入片段的质量，本研究
一方面通过确保RNA在操作过程中不被降解
和第二条cDNA链在合成过程中被充分延长来
提高cDNA链的合成效率，另一方面通过增加
SepharoseCL-2BGelColumn分级分离 cDNA
片段的次数来避免小片段DNA的污染。
参 考 文 献
[1]周明兵，汤定钦.小佛肚竹和螺节竹总RNA的提取[J].竹子
研究汇刊，2004，23（3）：7$10 [2]卢圣栋等.现代分子生物学实验技术[M].北京：中国协和医 科大学出版社（第二版），1999，319$327
[3]萨母布鲁克J，弗里奇EF，曼呢阿蒂斯T.分子克隆[M].北
京：科学出版社（第二版），1999，396$451
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