全 文 ：文章编号: 0465-7942( 2013) 02-0088-06
用丙环唑杀除羽茅内生真菌
朱敏杰 ,　张丽红 ,　任安芝 ,　高玉葆
( 南开大学 生命科学学院 , 天津 300071 )
　　摘要: 一些带菌禾草能导致取食动物产生中毒症状 .在内蒙古草原上 ,羽茅 ( Achnatherum sibiricum )带菌率
高且稳定存在 ,而同属带菌植物能导致取食牲畜产生中毒症状 ,带菌羽茅也可能会来危害 .因此 ,选择了一种有
效的杀真菌剂丙环唑 ( Pr opicona zole) ,在种子、幼苗和成株 3个层次上进行处理 ,探索适合杀除羽茅内生真菌的
方法 .结果显示 ,用 4. 00 a. i. μL /g种子的丙环唑浸种 4 h可有效降低羽茅种子中内生真菌感染率 ;用 4. 00～ 6. 00
a. i. g /L丙环唑进行叶片喷施 ,处理萌发 7 d的幼苗和成株 ,能获得较高的存活率和杀菌率 .这为控制羽茅内生
真菌提供了几种可行的方法 .
关键词: 内生真菌 ; Neotyphodium ; 丙环唑 ; 杀菌 ; 羽茅
中图分类号: Q948　　　　　　　　　　文献标识码: A
0　引　　言
内生真菌是一类广泛存在植物细胞间隙 ,并在其中度过全部或大部分生命周期 ,而不引起植物产生明
显病害症状的真菌 [ 1] .包括子囊菌纲 ( Ascomycetes)、麦角菌科 ( Clav icipi taceae)、瘤座菌族 ( Balansieae)的
一些种类 [2 ] .目前 ,研究最广泛、深入的内生真菌是与冷季型禾草共生的 epichloё(包括 N eotyphodium属和
Epichloё属 )真菌 [ 3] .研究发现 , epichloё内生真菌能增强宿主禾草养分吸收能力、生长能力、抗旱能力 ,还
能产生次生代谢物达到驱虫、拒食作用等 [4 ] .然而 ,自 20世纪 60年代起 ,因家畜取食带菌禾草 ,发生呕吐、
发热、蹒跚等夏日综合症或蹒跚症 [5- 7 ] ,甚至死亡 ,导致当地的畜牧业减产 ,造成巨大经济损失 [8 ] .如何有
效控制这些能产生有毒生物碱的内生真菌 ,成为了草业科学研究者关注的重点问题 .
已报道的杀菌方法 ,主要有室温存放法 [9 ]、加热杀菌法 [10- 11 ]和杀真菌剂处理法 [12- 15 ] .但前 2类方法都不能
用于灭活植株体内共生的内生真菌 ,而杀真菌剂法可对带菌的种子进行浸泡处理 ,或对带菌植株进行水培或叶
片喷施杀菌.一些研究表明丙环唑 ( Propiconazole)可以有效的降低带菌种子和带菌植物内菌丝活力 [14, 16 ] .
2003～ 2009年期间 ,对内蒙古草原禾草内生真菌资源进行了多次调查 .通过调查 ,发现羽茅
( Achnatherum sibiricum ( L. ) Keng )带菌率一直很高 ( 98. 2% )且比较稳定 [17 ] .进一步研究发现 ,主要有
Neotyphodium sibiricum和 Neotyphodium gansuense两种内生真菌 ,分布于羽茅种子和植株体内 [17- 18 ] .在
同属植物中 ,已有醉马草 ( Achnatherum inebrians )和睡眠草 ( Achnatherum robusta)两种带菌禾草被报道牲
畜采食后表现出中毒症状 .因此 ,带菌羽茅可能会给取食的牲畜带来危害 .
本研究选择带菌羽茅种子和植株为实验材料 ,通过采用丙环唑泡种或喷施处理 ,探索适合杀除羽茅内
生真菌的方法 ,并用对杀菌效果进行评价 .
1　材料与方法
1. 1　实验材料
实验用羽茅种子 ,为 2007年采集自内蒙古自治区海拉尔市呼伦贝尔草原 ;实验用的羽茅植株是用种
第 46卷　第 2期
2013年 4月 南 开 大 学 学 报 (自然科学版 )Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Nankaiensis 　Vo l. 46　№ 2　 Apr. 2013
收稿日期: 2013-03-15基金项目: 国家重点基础研究专项基金 ( 2007CB106802) ;国家自然科学基金 ( 30970460, 31270463) ;教育部高等学校博士学科点专项科研基金 ( 20090031110026) ;教育部留学回国人员科研启动基金 ( 2009-2011年 )作者简介: 朱敏杰 ( 1984- ) ,男 ,湖南衡东人 ,博士研究生 .通讯作者: 高玉葆 ( 1955- ) ,男 ,山西左元人 ,教授 ,主要从事植物生理生态学研究 . email: y bgao@ nankai. edu. cn
子提前播种的 ;实验用的杀真菌剂:丙环唑 ( Propiconazole,商品名 Til t ,有效浓度 25% ) .
1. 2　实验方法
1. 2. 1　种子杀菌实验: 选取饱满羽茅种子放入 5 mL小量杯中 ,每杯中放置25颗 .设置 Prop.处理浓度 ( 0.
00, 2. 00, 4. 00, 6. 00, 8. 00, 10. 00 a. i. μL /g种子 )与处理时间 ( 2, 4, 6, 8, 10 h)正交实验 .处理时 ,每个量
杯中预先加入 750μL蒸馏水 ,再加入相应量的 Prop.进行处理 .处理结束后 ,将种子转入带湿润滤纸的培
养皿中 ,于 25℃培养箱暗处避光发芽 .从转入 25℃培养箱中开始计时 ,第 21 d统计各处理种子的发芽数
量 .种子萌发结束后 ,每种处理挑取长势良好的种子各 15颗 ,转入装满蛭石的盆中 (口径 180 mm×深度
190 mm) ,每盆种 5颗 , 3盆重复 .每 5 d浇水 1次 , 3个月后 ,每个个体随机取 3个分蘖 ,用苯胺蓝染色法 [7 ]检
测叶鞘带菌情况 .被测 3个分蘖中 ,只要有 1个检出有菌 ,则此个体记为带菌 ;若 3个分蘖全未检出菌 ,则记
为无菌 .最后用无菌个体数除以总个体数 ,计算各处理杀菌率 .
1. 2. 2　幼苗杀菌实验: 选择饱满羽茅种子 ,经过表面灭菌后 ,用无菌水浸泡 4 h.浸泡结束后 ,转入带湿润
滤纸的培养皿中 ,于 25℃培养箱中避光发芽 .挑选同一时段发芽的种子 1 000颗 ,种入装满蛭石的盆中 (口
径 180 mm×深度 190 mm) ,每盆种 5颗 ,共种 200盆 .到发芽后第 5 d时 ,选择长势良好且均一的苗 ,开始实
验处理 .实验设计为丙环唑 .处理浓度 ( 0. 00, 0. 20, 0. 40, 0. 60, 0. 80, 1. 00 a. i. g /L )和处理时刻 [ (Ⅰ )发芽
后第 5, 5和 10, 5和 15; (Ⅱ ) 7, 7和 14, 7和 21; (Ⅲ ) 9, 9和 18, 9和 27 d ]的随机区组实验 ,每种处理 3盆重复 .
处理时 ,用相应浓度的丙环唑 .溶液对幼苗叶片进行喷施 ,直至叶缘有液滴出现 .所有喷施处理结束后第 10
d,剪除地上部分 .此后 ,每 5 d浇水 1次 ,待新生分蘖长出足够大时 ,检测带菌率 (方法同 2. 1所述 ) ,并计算
各处理杀菌率 . 4个月后 ,统计存活的个体数 ,计算存活率 .
1. 2. 3　成株杀菌实验: 选择 200个长势良好的羽茅成株个体 ( 6～ 8个分蘖以上 ) ,每个个体比较均匀的一
分为二 ,分别种入装满蛭石的盆中 (口径 180 mm×深度 190 mm) ,组成一对 ,缓苗 2星期 .缓苗结束后 ,选择
长势均一良好的 150对个体 ,开始实验 .实验设计为丙环唑 .处理浓度 ( 0. 20, 0. 40, 0. 60, 0. 80, 1. 00 a. i.
g /L)单因素实验 ,每个处理 30盆重复 .实验时 ,每一对个体 ,取其中 1盆进行喷施 (方法同 1. 2. 2所述 ) ,另 1
盆作为对照用无菌水进行喷施处理 .处理结束 1周后 ,剪除植株所有地上部分 .待新生分蘖长出足够大时 ,
检测带菌率 (方法同 1. 2. 1所述 ) ,并计算各处理杀菌率 .实验结束时统计存活率 .
全部实验于 2008年 9月～ 2009年 7月 ,在南开大学生命科学学院温室中完成 .实验获得的数据 ,用
SPSS 18. 0进行方差分析 ,用 Excel 2013做图 .
2　结果与分析
2. 1　种子杀菌
随着丙环唑处理时间增长 ,羽茅种子发芽数逐渐降低 .处理时间在 4 h以下的发芽数 ,显著高于 4 h以
上的处理组 ( P < 0. 05) .当处理超过 6 h后 ,发芽数降为总数的 50%左右 (图 1a ) .随着丙环唑处理浓度的升
高 ,羽茅种子发芽数也逐渐降低 .对照组几乎全部正常发芽 , 2. 00～ 4. 00 a. i. μL /g种子处理组发芽数与
对照组差异不显著 ,但显著高于 6. 00 a. i. μL /g种子以上的处理组 ( P < 0. 05) . 10. 00 a. i. μL /g种子处理
组发芽数显著低于其它处理组 ( P < 0. 05) .当处理浓度大于 6. 00 a. i. μL /g种子时 ,发芽数减少到总数的
半数以下 (图 1b) .随着丙环唑处理时间的增长 ,杀菌率先增高后降低 .处理 4～ 6 h的杀菌率为 20%左右 ,
杀菌效果显著好于处理时间更短或更长组 ( P < 0. 05) (图 2a ) ;不同丙环唑浓度处理的杀菌率也是先增加
后减少 .浓度为 4. 00～ 6. 00 a. i. μL /g种子的杀菌率为 25%左右 ,杀菌效果好于更低或更高浓度组 (图
2b) .
2. 2　幼苗杀菌
对照组羽茅幼苗存活率为 100% ,而经过丙环唑处理 ,存活率都有不同程度降低 .从不同处理时刻来
说 , 发芽后第 7 d进行处理 ,幼苗存活率最高 ,而Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ组内各处理之间羽茅幼苗的存活率没有显著差
异 (图 3a) .此外 ,随着丙环唑处理浓度的升高 ,幼苗存活率逐渐降低 . 4. 00 a. i. g /L以下处理组 ,其幼苗存
活率与对照组差异不显著 (图 3b) .
·89·　第 2期 朱敏杰等:用 Propiconazole杀除羽茅内生真菌
浓度为 0. 00 a. i. μL /g种子的处理组为对照组
图 1　不同丙环唑处理时间 ( a)和处理浓度 ( b)的羽茅种子发芽数
Fig. 1　 The numbers of germinated A. sibiricum seeds treated by Propiconazole at dif f erent time span ( a) and
concentration ( b)
浓度为 0. 00 a. i. μL /g种子的处理组为对照组
图 2　不同丙环唑处理时间 ( a)和处理浓度 ( b)对羽茅种子内生真菌的杀菌率
Fig. 2　 The sterilization rate of endophytes in A. sibiricum seeds treated by Propiconazole at dif ferent t ime
span ( a) and concentration ( b)
总的来说 ,在发芽后第 7和 14 d进行 2次处理的杀菌率最高 ,而Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ组内各处理之间杀菌率没有
显著差异 (图 4a ) .随着丙环唑处理浓度的增加 ,杀菌率逐步提高 . 8. 00 a. i. g /L以上的处理组 ,杀菌率为
80%左右 ,显著高于低浓度处理组 (P < 0. 05) (图 4b) .
2. 3　成株杀菌
对照组羽茅成株的存活率为 100% ,而随着丙环唑处理浓度的升高 ,羽茅成株存活率逐渐下降 (图 5a ) .
2. 00 a. i. g /L处理组存活率为 85%左右 ,与 4. 00和 6. 00 a. i. g /L两个处理组 ( 50%左右 )差异不显著 ,但
显著高于浓度为 8. 00和 10. 00 a. i. g /L两个处理组 ( P < 0. 05) ; 4. 00和 6. 00 a. i. g /L两个处理组存活率
也显著高于 8. 00和 10. 00 a. i. g /L两个处理组 ( P < 0. 05) (图 5a ) .
随着处理浓度不断增高 ,丙环唑对羽茅成株内生真菌杀菌率先增高后降低 . 6. 00 a. i. g /L处理组杀
菌率最高 ,为 95. 8% ,显著高于其它处理组 (P < 0. 05) ;而 10. 00 a. i. g /L处理组最低 ,显著低于其它处理
组 ( P < 0. 05) (图 5b) .
3　讨　　论
Neotyphodium属内生真菌是以无性垂直传播的一类内生真菌 [4, 19 ] .在自然条件下 ,从带菌种子成熟
·90· 　南 开 大 学 学 报 (自然科学版 ) 第 46卷
浓度为 0. 00 a. i. g /L的处理组为对照组
图 3　不同丙环唑处理时刻 ( a)和处理浓度 ( b)的羽茅幼苗存活率
Fig. 3　 The survival rate of A. sibiricum seedlings treated by Propconazole at diff erent time ( a) and
concentration ( b)
浓度为 0. 00 a. i. g /L的处理组为对照组
图 4　不同丙环唑处理时刻 ( a)和处理浓度 ( b)对羽茅幼苗内生真菌的杀菌率
Fig. 4　 The ster ilizat ion rate of endophytes in A. sibiricum seedlings treated by Propiconazole at dif ferent time ( a)
and concentration ( b)
到萌发形成新的个体的这个过程中 ,内生真菌有可能会失活 ,即垂直传播失败 [ 20] .研究表明在一定温度条
件下放置超过一段时间 ,种子内的内生真菌也会失去活性 . W el ty等人 [21 ]发现随着温度的升高、湿度增大、
存放时间更长 ,种子的带菌率逐渐减低 . La tch等人 [11 ]发现用 57℃热水处理 15～ 30 min或 59℃热水处理
10 min可以杀死多年生黑麦草 (Lol ium perenne )种子中的内生真菌 .李夏等人 [10 ]发现 60℃温箱烘烤能有
效杀灭羽茅种子内的内生真菌 .然而 ,通过这几种物理方法进行杀菌 ,处理周期较长或降低了植物种子活
性 .本研究采用不同浓度和处理时间的丙环唑浸种杀菌 ,发现用 4. 00 a. i. μL/g种子的丙环唑处理 4 h ,可
以有效降低羽茅种子带菌率 ,且对种子的萌发没有明显影响 . Ha rv ey等人 [ 14]发现用丙环唑对黑麦草种子
进行杀菌处理时 ,短期内将降低种子长出的幼苗的高度 ,但这种负面影响一段时间后将逐渐消失 .
用丙环唑对羽茅幼苗进行处理 ,结果显示 ,每个处理时刻小组内部的各处理之间的杀菌率和存活率无
显著差异 .也就是说 ,丙环唑处理 1次或 2次 ,杀菌效果和幼苗存活率差别都不大 ;两次处理间隔 5～ 18 d,
差别也不大 .与处理次数相比 ,处理时刻的影响更大 . Hill等人 [22 ]研究结果表明 ,随着幼苗苗龄增大 ,丙环
唑进入叶的通透性降低 .这可能说明了对幼苗进行处理有效性较高 .本研究也发现 ,在羽茅种子萌发后第 7
·91·　第 2期 朱敏杰等:用 Propiconazole杀除羽茅内生真菌
图 5　不同丙环唑处理浓度下羽茅成株存活率 ( a)及对羽茅成株内生真菌的杀菌率 ( b)
Fig. 5　 The survival rate of A. sibiricum adult plants ( a) and sterilization rate of endophyte ( b) treated by Prop.
at dif ferent concentrat ion
d,用 4. 00～ 6. 00 a. i. g /L丙环唑进行叶片喷施 ,能获得较高的幼苗存活率和较好的杀菌效果 . Hill等 [ 22]
研究发现 ,用 4. 00 a. i. g /L丙环唑对发芽 7 d的高羊茅 (Festuca arundinacea )幼苗进行处理 ,可以使得带
菌率降到 10%以下 .
在羽茅成株上的杀菌结果显示 ,用 4. 00～ 6. 00 a. i. g /L的丙环唑进行叶片喷施 ,可以获得 78%～
96%杀菌率 ,然而存活率降到了 50%左右 .究其原因 ,可能是实验用苗经过分苗后 ,缓苗时间过短 ,或者由
于喷施处理结束后 ,需要剪去所有地上部分 ,导致植株失水过多 ,死亡率增大 .因此 ,配合延长缓苗时间 ,剪
苗后及时补水等措施 ,用 4. 00～ 6. 00 a. i. g /L的丙环唑进行成株叶片喷施 ,可能会取得更好的效果 .
综上所述 ,用 4. 00 a. i. μL /g种子的丙环唑浸种 4 h,可有效降低羽茅种子中内生真菌感染率 ,且不影
响种子的萌发用 4. 00～ 6. 00 a. i. g /L丙环唑对萌发 7 d的幼苗和成株进行叶片喷施 ,能获得较高的植株
存活率和杀菌效果 .这为羽茅内生真菌的控制提供了几种可行的方法 .
参 考 文 献
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Eliminating the Endophytic Fungi in
Achnatherum sibiricum by Propiconazole
Zhu Minjie,　 Zhang Lihong ,　 Ren Anzhi,　 Gao Yubao
( College of L if e Sciences , N ankai University , Tianjin 300071, China )
　　 Abstract: Some g rasses could bring the gra zers tox ici ty syndromes due to alkaloids
produced by the endophytes, at tracting much a ttention. In the Inner Mongo lia steppe,
Achnatherum sibiricum ( Linn. ) Keng w as found harbo ring endophy tes a t a high ra te. It w as
reported that the grasses in Achnatherum genus wi th endophy tes could cause “ summer
syndrome” and “ staggers disease” to the g razers, so A. sibiricum w ith endophy tes may also
have toxicity at po tential ri sks. Therefo re, in this study , an ef fective fungicide, Propiconazole
( Prop. ) , w as cho sen to treat the A. sibiricum on the seed, seedling and adul t plant lev els. The
resul ts show ed that at the concentration o f 4. 00 a. i. μL /g seed, Prop. can significantly reduce
the vi tali ty of the endophy tes in seeds af ter being dipped for 4 h. When sprayed on the leaves a t
4. 00～ 6. 00 a. i. g /L, Prop. can most effectiv ely eliminate the fungi out o f 7 days old seedling s
and adult ramet w ith a high surv iv al rate.
Key words: endophy te; Neotyphodium ; Pr opicona zo le; eliminate; Achnatherum sibiricum
·93·　第 2期 朱敏杰等:用 Propiconazole杀除羽茅内生真菌