全 文 ：上海农业学报 1 9 9 2, 8 ( 2 ) : l 一 4
A吻 A尹 i邵 lt 岭 ae hs 战妙ia
旱芹人工种子人工胚乳成分的筛选 ’
倪德祥 谢文凯 林 峰 蒋如敏 岑益群 邓志龙
(复旦大学生物系 ,上海 2 0 0 4 33)
摘 要 试验对人工胚乳中一种大量元素和一种微量元素的含量分别进行了筛选 。 改良了大
量元素的 M s 一 2人工胚乳 ,可使人工种子的转株率提高到 92 % , 微量元素的试验显示 M s Z为最优 。
对人工胚乳中糖成分及浓度也进行了筛选 。 在葡萄糖 、蔗糖 、麦芽糖三种寡糖中 ,麦芽糖 6 %浓度时
人工种子转株率最高 , 为 94 % ;蔗糖略低 ;葡萄糖最低 。 糖浓度为 3% 、 1 %时转株率下降较多 。 旱芹
胚状体在马铃薯提取液或可溶性玉米淀粉为唯一碳源的人工胚乳中不能成苗 。
关键词 人工种子 ; 早芹 ; 人工胚乳 ; 转株率
人工种子技术是在植物组织培养基础上发展起来的一门新兴生物技术 , 人工种子在结构
上与天然种子相似 ,是由水凝胶包裹胚状体形成的 。其中 ,水凝胶除了起保护作用外 ,还必须提
供胚状体一定的营养 , 以满足其最初成长阶段的需求 。
关于人工胚乳营养方面的报道甚少 。 tS icr kl an d 等川曾于 1 9 8 6 年发现在半量的 sH 培养基
中 , 以 .1 5%麦芽糖代替蔗糖显著地提高了首楷人工种子的转株率 。 1 9 8 7 年 R ed en ba ug h 等阁也
证实麦芽糖代替蔗糖 ,首楷人工种子 的成株率可达 50 % 一 70 % ;并在多糖类碳源中 , 用 1 . 5%
马铃薯淀粉 、 1 . 5%玉米淀粉和 1 . 5%可溶性马铃薯淀粉 ,所得转株率均低于 1 . 5%麦芽糖对
照 。 他们还对 s H 培养基中的主要盐分进行了研究〔, ’ ,认为人工胚乳中缺乏这些盐分 ,胚状体
就不会发育成植株 。 旱芹人工胚乳营养方面的研究还未见报道 , 我们进行了一系列的试验 , 并
初步得到了一些结果 。
1
. 材料与方法
上海地区栽培的旱芹臼产 u ln 尹。 。口交况。 L . ) , 品种名 “ 药芹” 。 取其成熟种子 。料法材方
.1 .2 1 胚状体的发生 参见文献〔4 ] 。
1
.
2
.
2 人 工种子的制作 子叶期胚状体悬浮于含海藻酸钠和养分的人工胚乳溶液中 ,用
滴珠法制作人工种子 , 固化剂为 aC 1C 2 溶液 ,无菌水冲洗 。
1
.
2
.
3 产` 工种子的萌发试验及统计 人工种子在 1/ 2M S 固体培养基上无菌培养 , 室温 25
士 1℃ ,光照 12 h d/ ,光强 2 0 0 0 L x 。 1 d0 后统计发芽率 (突破种皮 l m m 以上 ) , 4 d0 后统计转株率
(突破种皮 5 m m 以上 ) 、 苗高 (真叶突破种皮垂直距离的加权值 ) 、 平均真叶数 。 试验中每个处
理接人工种子 3一 10 瓶 , 每瓶 30 一 40 粒 。 样本数均大于 1 0 0 。
2
. 结果与分析
2
.
1 人工胚乳中大量元素的改良对人工种子转株率的影响 改良了 M S 基本成分中某种大
本文于 1 99 1年 7 月 2 5 日收到 , 1 9 9 2年 l 月 1 9 日收到修改稿 。
. 植物学博士点基金资助项目
2 上 海 农 业 学 报 8 卷
量元素含量的培养基 M S 一 l 、 M S 一 2 、 M S 一 ( 3均附加 3%蔗糖 ) 作为人工胚乳 , 其人工种子 4 d0 后的
转株率如表 1 。
表 l 人工种子大量元素改良后的萌发对比试验结果
T a b l e 1 R es
u l t s o f g e r m in a t o n tes t s a f t e r a m a e r on
u t r i e n t w a s i!n Pr o v ed
人工胚乳种类 ( K sn d o f a r t i f i c i a l e n d os 解 r m )
人工种子蓦数 (孩 ) ( rA ` i f i c i a l s e ed s , es ` e d )
转株数 (颗 ) ( p la n t一 f or m i n g eS de s )
转株率 (% )仁P l a n t l e t f o r m a t ion r a t e ( % ) ]
M S
一
l M S
一
2 M S
-
2 3 0 2 3 5
1 9 0 2 0 6
2 1 0 2 3 5
1 9 3 2 1 2
8 2
.
6 1 8 7
.
6 6 9 1
.
9 0 9 0
.
2 1
由表 l 的统计数可见 , 人工胚乳大量元素含量的不同 ,对于人工种子的转株率有一定的影
响 ,但差异不明显 。 将 M S 加以改良的人工胚乳比 M S 本身效果好 ,转株率提高 5% 一 9% , 其中
以 M s 一 2 为最优 ,转株率可达 91 . 9 % 。
由于 M s 的改良 ,使人工种子的耐压强度有大幅度提高闭 , 以上的萌发试验又显示其没有
负作用 , 因而 M s 一 2 人工胚乳具有一定的研究应用价值 。
2
.
2 人工胚乳中微 l 元素的改变对人工种子发芽势及转株率的影响 M s 一 a2 , b2 , c2 , d2 是
在 M s 一 2 基础上改变某种微量元素含量的人工胚乳 (附加 6%麦芽糖 ) , 表 2 的统计结果显示 ,
改变的 4种胚乳均未优于 M S 一 2 。 但是 , M s 一 2 、 M S 一 b2 、 M S一 e2 之间差异不显著 。 在改变后的胚乳
成分中 , M s 一 c2 是发芽势和转株率最高的 , M S一 b2 略低于 M S一 c2 ; M S 一 a2 和 M S 一 d2 在发芽 、 转株
和发育状态上都比前述三者差 ,可能存在一定程度的微量元素缺乏或毒害作用 。
表 2 M s 一 2微量成分改变后人工种子萌发生长情况
aT b l
e 2 In f lu e n e e Of e h a n g ign r
r a e e e l e m e n t i n M象 2 o n g e r m in a r i o n o f se e d s
人工胚乳种类 ( k i n u o r a r t i f i e sa l e n d , 沐 rm ) M S一 2 M S一 Za M s 一 Zb M s 一 Ze M s Zd
人工种子总数 (颗 ) ( r^ t s r se i a l s e心 t es r e d ) 1 9 0 1 8 0 1 4 5 1 7 0 1 0 0
发芽数 (颗 ) ( se de s g e r m in a t司 ) 1 5 0 1 1 2 1 1 0 2、 5 3 5
发芽势 (% ) , (G e r m . % ) 7 8 . 9 5 6 2 . 2 2 7 5 . 8 6 7 9 . 4 1 5 5 . 0 0
转株数 (颗 ) ( p fs . 二 , ) 1 7 0 1 3 3 1 2 2 1 5 2 7 3 .
转株率 (% ) ( p r . % , , , ) 8 9 . 4 7 7 3 . 8 9 8 4 . 1 4 8 9 . 4 1 7 3 . 0 0
, 指发芽的人工种子占人工种子总数的百分比 。 M ae n s th e 沐 r c e n t a g e o f g e r m in a tde s e e d s ·
资 朴 p f s
.
~ p lan
t l e t
一
fo r m sn g s e de s
. 关 关 资 p f r
.
% = p l
a n t l e t f or m a t i o n r a t e
.
2
.
3 选用葡萄糖 、 蔗糖或麦芽桩作为人工胚乳寡糖类碳源对人工种子发芽成苗的影响 萌
发情况见表 3 。 从 1 d0 发芽结果看 , 无论三种糖中哪一种 , 6% 的浓度是人工种子在无糖基质上
快速整齐地萌发所必需的 , 其发芽率 比 3%糖浓度高 n 驳一 16 % ,效应很 明显 , 其中以 6%麦
芽糖为最好 。 4 d0 转株率结果也颇相似 ,所不同的是两种贰糖 (蔗糖 、 麦芽糖 )在 6% 浓度上显示
出对单糖 (葡萄糖 ) 的相对优势 ,在数值上高于后者 8 % 一 n % , 另外 , 成苗 的质量 , 如平均苗
高 、平均真叶数等方面 , 6%麦芽糖也显示了较为全面的促进效应 。
2
.
4 马铃 , 提取液或玉米淀粉作为人工胚乳多糖类碳源的试验结果 用马铃薯提取液或玉
米淀粉作为人工胚乳中唯一碳源所制得的人工种子 , 在萌发过程中都呈现不同程度的营养饥
饿症状 , 1 d0 时胚状体突破种皮的 比例与 3写蔗糖对照差异尚不大 , 但此后胚状体生长缓慢甚
至停滞 。 若以突破种皮 2 m m 以上作为转株的标准 ,那么只有 2% 、 4%淀粉组有近 1/ 4 的转株
2 期 倪德祥等 :早芹人工种子人工胚乳成分的筛选
率 , 8%淀粉组更低 , 可能存在淀粉凝结后对胚状体呼吸 、光合等生理过程的不利影响 (表 4 ) 。
表 3 · 三种寡枪成分作人工胚乳碳源对人工种子萌发成苗的影响
T a lbe 3 I
n f l u e n e e o f d i f f e r e nt 0 119佣 a c c h a t id es f o r a r t宝f i e i a l e阅始讲 r m on g er m in a t o n Of se ed s
培养 1田 后 培养 4 d0 后
人工种子总数
(颗 )
eS ed
s tes ted
fA t
e r 1 0 d
a y s
` e u l t u r e fA t
e r 4 0 d
a y sl e u it u r e
处 理
T了ea tm e n t 发芽数 (颗 ) 发芽势
eS ed
s (% )
g e r m in a t目 G e r m . %
转株数
(颗 )
p fs
.
转株率
( % )
fP r
.
%
苗 高
P la n t
he i g h t
( m n , )
真叶数
N U m he r o f
l e a V e S
八J只ù八U20`O.J性ù.0么3.1..4压`ó1卜」
;
.
,1咬口肉匕
,J00
J.1OQō日
.…咭口产O八
ō
J工óùXà
0918532.3074.829725649810
,乙口工1.飞`工z
, L
l
641857哭390.4.84.13092,`勺j任Od曰声,勺口J马八七58634709217能2403185%姚
,.二,O户011,J八O心.IQ曰几b葡萄糖
G lu c o se
蔗 糖
S U C r 0 S e
麦芽糖
M a l t璐 e
T a b l e 4
表 4 马铃薯提取液或玉米淀粉作唯一碳源的萌发试验结果
R es u l t s o f s e ed g
e r m in a t ign tes t
s u s i叱 t o m a t o e x t r a e r o r m a iez s t a r e h as th e so l e ca r b o n so ur 沈
培养 1d0 后 培养 4d0 后
处 理 人工种子总数
(颗 )
泉 e ds tes ted
fA t
e r 1 0 d a y s
, e u l t u r e A f t er 4 0 d
a 邓` e吐 t u r e
介 e a tm e n t 发芽数 (颗 ) 转株数 (颗 )
eS
e d s ge r m in a r ed
发芽率 (% )
G e r m
.
% p fs
. 共
转株率 (纬 )
fP r
.
%
19
061934对照 C K , 33 . 3 3 8 2 . 92
11C心0U0O白今ù lùU11,产八匕Jq…马`7.ǐUOD以nó巧`,`9ó1.12
O
J怪,`六O,口OUO乃曰ó一卜口óJ怪八匕峪
J马ùUō乙巴JnU八曰9一丹Uù匀三兮,óJ勺弓乙20山0曰%,ù`峪ù吕O`j悦八邑马铃薯提取液
T o 们n a l o e x t r a e卜
玉米淀粉
M a iZ e s t盯 e h
0
0
0
2 4
。
90
2 9
.
0 6
1 7
.
0 8
` 对照为 3 %蔗糖处理 , e K 55 3% s u o r , 。 t r ae t m e n t .
· ` 指突破种皮凝胶 nzZ m 以上 . , , M ea sn th a t b u d 匕r o k e a 一g sn a t o g e l u p t o a加 v e Zm m .
马铃薯提取液的三组处理在 25 d 后出现胚状体逐渐变黄死亡的现象 , 4 0d 后全部死亡 。 原
因可能是营养饥饿或提取液中某些物质的有害影响 。
3
. 讨 论
对于光合作用能力极弱的胚状体来说 , 碳源是人工胚乳中比较关键的成分 。旱芹人工种子
在麦芽糖接近最适浓度时 ( 因为转株率已高达 94 % ) 比蔗糖好 ,更优于葡萄糖 。 这与 st icr k lan d
等川和 R e de bn au hg 等闭的结论相一致 。 但在麦芽糖的浓度上有很大不同 ,旱芹以 6%为最好
(无糖基质 ) ,首楷则是 1 . 5%最好 (未说明基质性质 ) 。 可能 , 一是因为基质不同 ,二是因为糖分
泄漏程度上的差异 , 而最重要 的原因可能如美国植物遗传公司的人工种子专家 D r . K iet h R e -
d e n ba u hg 19 89 年所指出的 [5〕 : 芹菜是一种有胚乳植物 ,其人工种子中必须有人工胚乳 , 以提供
4 上 海 农 业 学 报 8 卷
萌发与成苗所必需的养分和碳源 ; 而首楷则是一种无胚乳作物 ,从理论上讲不需要胚乳 。
首楷人工种子利用多糖类碳源看来已成功有望 , R ed en bau hg 等试验 了 7 种淀粉 5[] , 得到
17 % 一 2 7%的转株率 。而我们在旱芹人工种子试验中的结果表明 , 马铃薯的水提取物 (淀粉 、 无
机离子和可溶性有机成分 )不能为胚状体萌发带来有利影响 。市售玉米淀粉 (水溶性 )也只得到
了很低的转株率 ,其中还不排除含有寡糖成分的 可能性 。 因此 ,旱芹胚状体对碳源的要求 比首
楷高 。
多年的研究认为 ,人工种子强度与胚状体生活力 、 萌发能力是很难处理的一对矛盾圈 。 我
们的试验从无机营养出发 ,使这一矛盾有所缓解 。 在确定耐压强度可有所提高的前提下 , 对胚
状体转株能力进行了测试 ,认为经合理组合后的人工胚乳使转株能力反而有所提高 。
微量元素的筛选在本实验中只是初步的尝试 ,进一步的试验还可与糖处理相配合 , 以期求
得两者间的相互影响 。设想今后这方面的研究会有一些令人感兴趣的发现 , 因为多种微量元素
对于包括有机营养 (如糖的利用 ) 、 代谢调节 (如酶的激活 、代谢调节物的形成 ) 、合成代谢等方
面都会产生重要影响 。 而人工种子正是建立在这些生理生化基础上的技术之一 。 ’
参 考 文 献 ( R e f e r e n ce s )
〔 i〕 s t r ic kl a n d , 5 . , c . M e c a l一, J . N i e h o l a n d D . s t u ar t , 助 h a n e比 s o m a t i e e m b r y o朗 n e s i s in 几几 d ic a go sa t滋,二 b y 初-
d i t i o n o f m a l tos e a n d i t s h ig h e r h o m o 10 g s t o th e e u l t u r e m de i um
,
In
: V l nI t e r n a t i o n a l C o n gl 七5 o f P l a n t T哪 u e
an d C
e l l C u i r u r e A加 t r a e t s , U n i v e r s i t y o f M in n es o r a , M in n ea po l i s , M N . , D . s om e r s e t
.
a l
.
e d s
.
1 9 8 6
,
1 8 8
.
〔2〕 R目 e n恤 u g h , K . , P . v i s s , D . s , a d。 。 n d J . F u ji i : E n ca 讲 u za t i o n o f s o m a t i e e m份 y os sn s y n th e t i e 妄de e ao t s二
H o r t
.
cS i
.
1 9 8 7
,
2 2
:
8 0 3一 8 0 9 .
〔3」R de en ha gu h , K . 高频率体细胞胚胎发生 . 人工种子 . 北京 :高等教育出版社出版 , 陈正华和 eK iht . er d en -
比 u g h 主编 , 1 9 8 9 , 2 8一 4 4 .
「月 倪德祥 ,蒋如敏 ,张蓓等 , 旱芹人工种子的研究 . 复旦学报 ( 自然科学版 ) , 19 9 1 , 30 : 368 一 3 74 .
[ 5 ] R ed en ba
u
hg
,
K
. 体细胞胚的包裹及人工胚乳 . 人工种子 . 北京 :高等教育出版社出版 , 陈正华和 eK i th.
R ed e n比u g h 主编 , 1 9 5 9 , 1 3一 2 7 .
S E L E C I
,
I O N S O F N U T R IE N T S F O R E N D O S P E R M
O F C E L E R Y A R T IF IC I A L S E E D
N i D e x i a n g X i e W e n k a i L i n F
e n g J ia n g R u m i n g C h e n g Y i q u n D e n g Z h i lo n g
( D。尹t . o f B动 10 夕夕, 而建a : U , i。 · , S ha 此夕h a 云 2 0 0 4 3 3 )
A b st r公 e t S e l e e ti o n s o f e o n e e n t r a ti o n s o f a m a e r o n u it e n t a n d a t r a e e e l e m e n t i n s o m e a r t i f i e la l
e n d es ep r m s s h o w ht a t M S
一 Z e 15 t h e be s t o n
e
.
aC
r b o n h y d r a tes f o r th e a r t if i e iia
e n d o s ep
r m h a v e a l s o b e e n s e le e t e d
.
A m o n g g l u e o s e
, s u e r os
e a n d
m a lost
e , t h e h ig h es t p f r
.
9 4% e m e r g
e d w h e n 6% m a l t o s e w a s u s
e
d f o r e n d o s ep r m o f t h
e a r t if ie ia -
s o ds
.
T h es e e a r b o n h y d r a tes e o u ld b
e a r r a n g e d i n o r d e r o r p f r a n d f r o m h lhg to z o w
: 6% m 时 to s e , 6%
s uc r ose
,
6% 以 u e os e ; a n d w h il e s u g a r o o n e e n t r a ti o n s w e r e r e d u ce d t o 3线 o r l % , t h e p f r . d e e r ca s记
盯ea t l y . A n o t h e r r e s耳I t s h o w e d th a t e m b r y o i d e o u l d n o t f o r m s e e id i n g w h e n i t w a s e o a t ed in e n d os P e r m
u s豆n g t o m a t o e x t r a e t o r m a i z e s at r e h a s th e s o le e a r b o n s o u r e e .
K e y w o r d s A r t if i e i a l s e e d
,
C e l
e r y
,
E n d o s ep
r m
,
P l a n t l e t f o r m a t io n r a t e