全 文 ：海南省教育厅高等学校科研资助项目，项目编号：Hjkj200321
郭志凯 男，1983年生，在读硕士。研究方向：内生菌资源的研究与利用。
*通讯作者：黄贵修，男，1968年生，博士。电话：0898-23307796，E-mail：hgxiu@vip.163.com
收稿日期：2006-07-26修回日期：2007-02-02
热 带 作 物 学 报
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS
Vol.28 No.2
Jun.2007
第 28卷 第 2期
2007年 6月
臂形草内生真菌菌株HND5的分离、
抗性评价及其初步鉴定
郭志凯 王 蓉 蔡吉苗 黄贵修 *
中国热带农业科学院环境与植物保护研究所
海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室
海南 儋州 571737
摘 要 对我国主要臂形草（Brachiaria sp.）种质内生菌进行了活体检测、内生菌分离纯化、抗性评价及其初步
鉴定。利用改良的苯胺蓝染色法对臂形草内生菌活体检测结果发现，内生真菌广泛存在于供试的 9个臂形草
品种中；通过组织块培养法从供试材料叶片中分离获得内生真菌菌株 HND5；体外抗性分析实验结果表明，
HND5菌株对多种重要病原真菌具有明显的抑菌活性和较强的耐盐碱性；经初步鉴定，该菌株属于半知菌类
（Fungi Imperfecti）从梗孢目（Moniliales）从梗孢科（Monillaceae）枝顶孢属（Acremonium）真菌。
关键词 臂形草 HND5抗性评价 初步鉴定
中图分类号 S482.292
内生菌普遍存在于目前已研究过的各种植物中，尤其在臂形草属（Brachiariasp.）植物中广为分布[1~3]。
近几年，国外对植物内生菌的研究和利用已成为热点[4~12]，对臂形草属牧草内生菌的分离、鉴定和抗性分
析也有一些报道[10，11，13]。但是，对于我国热区特殊地理环境发展的臂形草产业来说，臂形草内生菌资源
的研究与利用尚未见报道。笔者对我国主要臂形草种质内生菌资源进行了调查、分离、抗性评价及其初
步鉴定，发现臂形草广泛存在着内生真菌，并从其叶片中分离获得了 1株对多种重要病原真菌具有明
显的抑菌活性和较强的耐盐碱性的内生真菌菌株 HND5，旨在分离获取具有体外抗病菌活性的内生真
菌，为今后进一步研究臂形草与内生真菌互作机理及其开发应用奠定基础。
1 材料和方法
1.1材 料
供试的 9个臂形草品种由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所刘国道研究员、易克贤研
究员提供，供试菌株水稻稻瘟菌（Magnaporthegrisea）Y34菌株由中国热带农业科学院环境与植物保护研
究所郑服丛研究员提供，芒果炭疽病病原菌（Colletotrichumgloesporioides）菌株SC2和香蕉枯萎病病原菌
（Fusariumoxysporumf.sp.cubense）菌株FOC19由本实验室分离。
1.2方 法
1.2.1臂形草内生菌活体检测 内生菌的活体检测方法参照文献[11]的方法进行。将获得的无明显症
状健康的叶片组织剪成1~2cm长，置于 2mL离心管中并标记好，用固定液处理好后，利用改良的苯胺
蓝染液（苯胺蓝0.1g，体积分数 70%酒精 100mL，体积分数 85%乳酸 50mL）染色，脱色处理后进行镜
检（胞间蓝色菌丝体或孢子体即为内生菌菌丝体）。每个品种叶片中有1份检查到内生菌的，即计为受
侵染品种。以经过去除内生菌处理的同种质叶片作为对照。
1.2.2 HND5菌株的分离纯化与回接 采用组织分离法从健康组织中分离获得内生真菌菌株 HND5：
选取健康叶片，剪成长度约为 0.5~1cm的组织块进行表面消毒（消毒程序为：75%酒精 1min，体积分数
3.25%的活性次氯酸钠溶液浸泡6min，然后用75%酒精浸泡0.5min，最后用无菌水清洗4次，取第4次
清洗的无菌水涂布平板以检验消毒效果），无菌滤纸吸掉叶片上多余的水分后将其接种到 PDA平板（含
2期 郭志凯等：臂形草内生真菌菌株 HND5的分离、抗性评价及其初步鉴定
10μg/mL四环素）上，置28℃暗培养2个月（定期检查）。菌株经单胞分离法纯化后采用文献[13，15]的
方法进行回接以确定菌株的内共生性。
1.2.3 HND5菌株的体外抗性测定 利用对峙平板培养法把分离获得的 HND5菌株与3种重要的植物
病原真菌进行拮抗测定。在无菌操作条件下将病原真菌菌块接种到 PDA平板（不含抗生素）中央，两侧
或呈三角形方式接种上HND5菌株菌块，用只接种病原菌菌块而不接种 HND5菌株菌块的PDA平板作
对照，接种后置28℃暗培养，直到对照长满平板后进行观察。每个处理重复 3次，用十字交叉法测量菌
落直径，求出菌株对各病原菌的抑制率。抑制率 =[(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直
径-原菌饼直径)]×100%。
耐盐碱性测定采用在含不同浓度的NaCl（耐盐）和Na2CO3（耐碱）的PDA培养基上进行。NaCl浓度
分别为3%，5%，7%和9%，Na2CO3浓度分别为1%，3%和5%。挑取HND5菌株菌块分别接种到上述
含不同浓度盐或碱成分的PDA培养基上，28℃倒置培养2周后，观察、记录菌落直径大小。以在不加相
应盐碱成分的 PDA培养基上生长的HND5菌株作为对照。每个处理重复 3次。
1.2.4 HND5菌株初步鉴定 HND5菌株的初步鉴定采用经典分类学方法，主要依据文献[11，14，15]
的方法来进行。依据菌株在PDA培养基上的菌落培养特征、质地结构，生长速度、分生孢子梗及分生孢
子形态特征，并结合菌株的宿主特性来进行初步鉴定。
2 结果与分析
2.1 臂形草种质内生菌活体检测
利用改良的苯胺蓝染色法对 9种臂形草属种质叶片进行内生菌活体检测发现，在参试的 9种种质
组织中均能检测到被染成蓝色的内生菌菌丝体；其中，俯仰和多枝臂形草叶片带菌率最高，分别达
100%和90%（见表1），其菌丝体也较为发达（见图1）。
2.2 HND5菌株的分离纯化与回接
采用组织分离法从臂形草属种质健康组织块中分离获得内生真菌菌株 11株，而将内生菌分离过
程中最后1次清洗组织块的无菌水涂布到PDA平板上，培养2周后未发现有菌落长出。进一步将从俯
仰臂形草叶片中分离得到的HND5菌株进行单胞分离法纯化后回接，可以成功回接到已经过内生菌去
除处理的俯仰臂形草中，并可从回接后的俯仰臂形草叶片上重新分离得到HND5菌株（见图2）。
2.3 HND5菌株的体外抗性评价
对峙平板培养法测定结果表明，内生真菌菌株 HND5对芒果炭疽菌 SC2菌株、香蕉枯萎病菌
FOC19菌株和水稻稻瘟菌Y34菌株均表现出明显的抑菌活性，抑菌率分别达 51.2%，68.4%和 79.1%
（见图3）。体外耐盐碱性测定发现，该菌株具有较强的耐盐碱性，能在 NaCl质量分数分别为 3%，5%，
7%和 9%的 PDA培养基上生长，培养 2周后菌落直径分别为 4.5，1.1，0.7和 0.4cm；也能在质量分数
1%Na2CO3的PDA培养基上生长，2周后菌落直径为0.85cm。
四生B.subquadripara 10 6 60.0
多枝B.ramosa 10 9 90.0
杂交B.hydrid 7 5 71.4
刚果B.ruzizensis 5 3 60.0
网脉B.dictyoneura 6 3 50.0
巴拉草B.mutica 10 4 40.0
湿生B.humidicola 10 5 50.0
俯仰B.decumbens 7 7 100
珊状B.brizantha 10 7 70.0
种
检验样品数
（份）
带菌样品数
（份）
带菌率/%
表 1 臂形草叶片中内生真菌带菌率
图 1 俯仰臂形草(左图)和多枝臂形草(右图)叶片中检测到
的蓝色菌丝体(100×)(箭头所示)
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2.4 HND5菌株的初步鉴定
HND5菌株在加有 10μg/mL四环素的 PDA平板上，菌落初为白色棉花状，随着时间的增加变为浅
粉红色，背面逐渐变为橙黄色或淡褐色，表面凹凸不平整，上面能够分泌无色液珠，菌落表面的菌丝束
内部充满无色液体，边缘较规则，1周后菌落直径为2.7cm；具有基内菌丝和气生菌丝，菌丝纤细，分枝，
成网状，无隔，无色或浅褐色，直或弯曲，光滑或不平整，粗度为 1.2~1.81μm；分生孢子梗直立单生，无
隔，顶端成头状，梗中央较两端粗，不分枝，粗 ×长：1.46~1.97μm×15.82~25.95μm；分生孢子无隔，单
孢，短圆桶状、椭圆状、纺锤状或球状，大小为1.23~1.62μm×1.93~2.88μm（见图 2）。依据上述形态特
征，参照文献[14，15，22]中关于 Acremonium属特征的描述和文献[10]关于珊状臂形草内生真菌的研究
结果，初步鉴定 HND5菌株暂定为半知菌类丛梗孢目丛梗孢科丛梗孢科单孢亚科葡萄孢族枝顶孢属
（FungiImperfecti，Moniliales，Moniliaceae，AmerosporoideaeofMoniliaceae，Botrytideae，Acremonium）真菌，
其更为准确的系统分类地位需通过进一步的分子分析才能加以确定。
3 讨 论
D.C.Saha等人利用一种快速的染色检测方法对草坪草的内生真菌进行了检测[16]。据报道，2001年
S.Kelemu等采用常规苯胺蓝染色法染色检测珊状臂形草内生真菌结果表明其内部感染有内生真菌[11]。
在国内，南志标也是利用常规苯胺蓝染液对我国部分国产和引进的禾草品种中的内生真菌分布开展了
图 2 HND5菌株在 PDA平板上生长状况(2周,左图)及产孢器(中图)和分生孢子(右图)
上一排为对照，从左到右分别是：C.gloesporioides，Fusariumsp.Magnaporthegrisea，下一排为HND5菌株与上排相应病原菌的对峙培养结果。
图 3 HND5菌株体外抑菌测定
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研究[17]。在本实验中，笔者采用了改良的苯胺蓝染色法（常规的是用水溶苯胺蓝）来对热带牧草臂形草
品种进行活体检测，得到较好的结果。改良的苯胺蓝染色法利用酒精溶解苯胺蓝，一方面起到固定组织
的作用；另一方面对材料表面进行杀菌，以免影响观察。该方法简单、方便、易于掌握，但也有其局限性，
主要是组织的染色往往深浅不一而影响观察。可根据材料的不同变更染色时间来加以克服。此外采用
分子生物学方法如 PCR特异扩增技术[18~20]等手段也能快速、准确地检测植物体内内生菌的存在。
由于内生菌独特的生物学特性及其特殊的生存环境，使得常规分离培养方法不能够保证将所有生
活在植物组织的内生菌分离出来。研究结果表明，采用乙醇、次氯酸钠、乙醇三步消毒法效果较好[21]，但
S.Kelemu采用两步消毒法也可从珊状臂形草中分离获得对病原菌具有拮抗作用的内生真菌[10，11]。为了
能从植物组织内部分离出尽可能多的内生菌株，常需要考虑多方面的因素，例如培养基的组成、消毒时
间、培养技术等，并且常需在培养基中加入一些抗性物质，以提高获得植物内生菌的可能性[21]。本实验
中采用了优化的3步消毒程序和改良的培养技术获得了对多种重要病原真菌具有明显的抑菌活性和较
强的耐盐碱性的内生真菌 HND5菌株，但其内共生机理、抗性机制及系统分类地位的确定仍需做进一
步的研究。
参 考 文 献
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InitialIdentificationandResistanceAnalysisof
EndophyticFungusStrainHND5Isolated
fromBrachiariasp.
GuoZhikai WangRong CaiJimiao HuangGuixiu
KeyLaboratoryforBalefulBiologyDetectionandMonitorofTropicalAgricultureofHainanProvince,
EnvironmentandPlantProtectionInstitute,CATAS Danzhou Hainan 571737 China
Abstract Endophytesexistcommonlyinsymptom-freeandhealthyplants.Therearemanyspeciesofendo-
phyteswhichperformvariousbeneficialfunctionstohostplants,suchaspathogen-resistance,host-growthim-
provementandsoon.EndophytesfromsomemajorspeciesofBrachiariasp.wereisolated,purifiedandinitialyi-
dentified,andtheirresistanceanalyzed.TheleavesofBrachiariasp.weredirectlyinspectedbyusingamodified
anilinebluestainingmethod,andtheresultsshowedthatal9speciesusedwereinfectedwithendophytes.With
tissueculturemethodanendophyticfungus,HND5strain,wasisolated.Invitroinhibitiontestsandsalt-tolerant
experimentsshowedclearlythatitcanobviouslyinhibitthegrowthofmanyimportantpathogensandismoresalt-
and-alkalitolerantthanotherstrains.InitialidentificationbyclassicalphylogenymethodshowsthatHND5maybe
classifiedintofungiImperfecti,genusAcremonium,familyMonilaceae.
Keywords Brachiariasp. HND5 resistanceanalysis identification
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