全 文 ：＊通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｏｎｇｋｕａｎｈｕ＠１２６．ｃｏｍ
收稿日期：２０１１－１１－３０；修回日期：２０１２－０４－１０
基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目
（２０１０１４０３１１０００２）；国 家 科 技 学 技 术 部 科 技 成 果 转 化 项 目
（２００９ＧＢ２Ａ３０００４３）资助
作者简介：李钰莹（１９８８－ ），女，陕西宝鸡人，在读硕士研究生，
研究方向为牧草抗逆性，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｙｕｙ＿ｉｎｇ＠１６３．ｃｏｍ．
文章编号：１６７３－５０２１（２０１２）０４－００１５－０６
白羊草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化
李钰莹，董宽虎＊，王若梦，杨静芳
（山西农业大学动物科技学院，山西　太谷　０３０８０１）
　　摘要：采用正交试验与单因素、双因素设计结合的方法，对白羊草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、模板
ＤＮＡ、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶及引物５种主要因素进行优化。确立了白羊草最佳反应体系及扩增程序：２５μＬ体系中
ｄＮＴＰ　０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔａｑ酶１．０Ｕ、引物０．６μｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ
２＋２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＮＡ模板３０ｎｇ、１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ；扩增
程序：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性４５ｓ，５０～６０℃（退火温度随引物不同而定）退火６０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，共３５个循环，
７２℃后延伸５ｍｉｎ。
关键词：白羊草；ＩＳＳＲ；ＰＣＲ反应体系；优化
中图分类号：Ｓ５４３　　　文献标识码：Ａ
　　白羊草（Ｂｏｔｈｒｉｏｃｈｌｏａ　ｉｓｃｈａｅｍｕｍ）是一种多年
生禾本科孔颖草属暖季型牧草，具有易建植、高产、
抗旱、耐牧、抗侵蚀等特点，是我国暖性草丛类草地
的建群种。主要分布于我国暖温带森林草原区和落
叶阔叶林区，从南到北大约跨越１０个纬度。白羊草
草地是山西中南部地区低山丘陵区的主要草地类
型，主要的放牧场和割草地。对于白羊草的研究前
人已做了大量的工作，主要集中在生理生态方
面［１～３］，利用分子手段对白羊草的研究尚少见报
道［４］。目前，在白羊草的种质资源方面的研究仅停
留在的调查分析阶段。
ＩＳＳＲ标记技术是一种在ＰＣＲ中直接使用微卫
星序列进行ＤＮＡ扩增的分子标记技术，因操作简
单、成本低、快速、灵敏、检测多态性能力强、所需
ＤＮＡ模板的量少而倍受青睐［５］，广泛应用于生物研
究的各个领域。本研究以白羊草基因组ＤＮＡ为模
板，采用正交与单因素、双因素结合的研究方法对
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系进行优化，为进一步开展白羊
草种质资源多样性研究奠定基础。
１　材料与方法
１．１　供试材料
供试草种于２０１０年１０月采自Ｅ１１１°４４′２１．３″、
Ｎ３８°１５′４８．１″、海拔１３４７ｍ的山西省岚县社科乡阳
坡村。２０１１年６月种植于山西农业大学动物科技
学院草业科学实验室。植株正常生长５０ｄ后采样，
剪取８株白羊草幼嫩无污染的叶片均匀混合后进行
基因组ＤＮＡ提取［６］。
１．２　基因组ＤＮＡ提取及定量
采用改良的 ＣＴＡＢ法提取基因组 ＤＮＡ，用
０．８％琼脂糖凝胶对基因组ＤＮＡ质量进行电泳检
测，ＤＮＡ 浓度通过核酸分析仪进行测定，并将
ＤＮＡ浓度稀释为１０ｎｇ／μＬ。
１．３　ＰＣＲ反应及电泳
ＩＳＳＲ引物序列由哥伦比亚大学（ＵＢＣ）提供，上
海生工合成，经过初步筛选试验，选用序列为：
５′ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣ３′的 ＵＢＣ８２３为本试
验固定引物。
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应程序常用的有以下两种，一种
是普通的ＰＣＲ，另一种是降落ＰＣＲ。试验初期，分
别用两种程序进行正交分析，确定出适合白羊草
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的反应程序。普通ＰＣＲ反应程序：９４℃
预变性５ｍｉｎ；９４℃变性４５ｓ，５４℃退火６０ｓ，７２℃延
伸９０ｓ，３５个循环；７２℃后延伸５ｍｉｎ，２５℃保存。
降落ＰＣＲ反应程序：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性
４５ｓ，６４℃退火６０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，共１１个循环，每
个循环退火温度降１℃；９４℃变性４５ｓ，５４℃退火
６０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，共２４个循环，７２℃后延伸５ｍｉｎ，
２５℃保存。
取５μｌ　ＰＣＲ 扩 增 产 物 与 １μｌ的 ６×ＤＮＡ
Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ混匀，点入含有０．５μｇ／ｍＬ　ＥＢ的
—５１—
第３４卷　第４期　　　　　　　　　　中　国　草　地　学　报　　　　　　　　　　２０１２年７月
　　Ｖｏｌ．３４　Ｎｏ．４　　　　　　　　　　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ　　　　　　　　　　Ｊｕｌ．２０１２　　
１．５％琼脂糖凝胶上电泳分离，电极缓冲液为
０．５×ＴＢＥ，９０Ｖ电泳１ｈ左右，用 Ｔｒａｎｓ２ＫＰｌｕｓ
ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ作为标准相对分子量对照，用 Ｂｉｏ－
Ｒａｄ　ＧｅｌＤｏｃ　ＸＲ凝胶成像系统观察、拍照。
１．４　ＰＣＲ正交试验设计、双因素及单因素处理
采用Ｌ９（３４）正交实验设计，对影响ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
的主要因素：Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚合酶、ｄＮＴＰ、引物和
Ｍｇ２＋的浓度进行４因素３水平的筛选分析，共９个
处理，每个处理２次重复，ＩＳＳＲ－ＰＣＲ各反应成分
的因素水平及正交试验见表１、表２。反应体系总体
积为２５μｌ，包括１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μｌ，基因组
ＤＮＡ　２μｌ，其他成分按照表 ２ 加样，不足的用
ｄｄＨ２Ｏ补足至２５μｌ。
表１　白羊草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的正交试验水平－因素
Ｔａｂｌｅ　１　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｆｏｒ　Ｂｏｔｈｒｉｏｃｈｌｏａ　ｉｓｃｈａｅｍｕｍ
水平
Ｌｅｖｅｌ
ｄＮＴＰ浓度
ｄＮＴＰ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｔａｑ酶浓度
ＴａｑＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｕ）
引物浓度
Ｐｒｉｍｅｒｓ
（μｍｏｌ／Ｌ）
Ｍｇ２＋浓度
Ｍｇ２＋
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
１　 ０．１　 ０．５　 ０．２　 １．０
２　 ０．３　 １．５　 ０．４　 ２．０
３　 ０．５　 ２．５　 ０．６　 ３．０
表２　白羊草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的正交试验设计表－Ｌ９（３４）
Ｔａｂｌｅ　２　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｆｏｒ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
ｒｅａｃｔｉｏｎ －Ｌ９（３４）ｆｏｒ　Ｂｏｔｈｒｉｏｃｈｌｏａ　ｉｓｃｈａｅｍｕｍ
编号
Ｎｕｍｂｅｒ
ｄＮＴＰ用量
（μｌ）
ｄＮＴＰ
Ｔａｑ
酶用量（μｌ）
Ｔａｑ　ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
引物用量
（μｌ）
Ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｍｇ２＋用量
（μｌ）
１　 ０．２５　 ０．１　 ０．５　 １．０
２　 ０．２５　 ０．３　 １．０　 ２．０
３　 ０．２５　 ０．５　 １．５　 ３．０
４　 ０．７５　 ０．１　 １．０　 ３．０
５　 ０．７５　 ０．３　 １．５　 １．０
６　 ０．７５　 ０．５　 ０．５　 ２．０
７　 １．２５　 ０．１　 １．５　 ２．０
８　 １．２５　 ０．３　 ０．５　 ３．０
９　 １．２５　 ０．５　 １．０　 １．０
　　单因素、双因素试验是为了细化各个因素浓度，
弥补正交试验的不足，根据正交试验结果初步选出
的最佳体系，在其他因素保持不变的情况下，按照梯
度水平（表３）调整单个因素，逐步筛选出各个因素
最优的扩增条件，组成最优的白羊草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反
应体系。模板ＤＮＡ浓度、Ｔａｑ聚合酶浓度、引物浓
度、退火温度４因素梯度见表３。
表３　白羊草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应系统优化设计
Ｔａｂｌｅ　３　Ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ｏｐｔｉｍａｌ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｂｏｔｈｒｉｏｃｈｌｏａ　ｉｓｃｈａｅｍｕｍ
试验因素
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｆａｃｔｏｒｓ
反应参数
Ｐａｒａｍｅｔｅｒ　ｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ
１　 ２　 ３　 ４　 ５　 ６　 ７　 ８
单因素 ＤＮＡ模板（ｎｇ） １０　 ２０　 ４０　 ６０　 ８０　 １００　 １２０ －
引物（μｍｏｌ／Ｌ） ０．１０　 ０．２０　 ０．４０　 ０．６０　 ０．８０　 １．００　 １．２０ －
Ｔａｑ　ＤＮＡ酶 （Ｕ／２５μＬ） ０．２　 ０．５　 １．０　 １．５　 ２．０　 ２．５　 ３．０ －
退火温度（℃） ４７．８　 ４９．６　 ５１．５　 ５３．６　 ５５．６　 ５７．５　 ５９．２　 ６０．４
双因素 ｄＮＴＰ（ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．１　 ０．２　 ０．３　 ０．４
Ｍｇ２＋（ｍｍｏｌ／Ｌ） １．０　 １．５　 ２．０　 ２．５
２　结果及分析
２．１　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交试验结果及其分析
正交组合的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系的扩增结果如图１
和图２所示。由于各个组合处理中各因素浓度不
同，因此扩增结果存在明显的差异。
图１为采用降落ＰＣＲ程序得到的正交试验结
果，其中组合２、组合３扩增效果较差；组合１扩增
出３条带，其中有两条较亮；其余组合效果相近，
条带数目基本一致，重复性较好。但降落ＰＣＲ程
序下的各组合处理差异不显著，无法确定出最佳
的组合。
图２为采用普通ＰＣＲ程序得到的正交试验结
果。其中组合１、组合４几乎无扩增条带；组合２、组合
３主条带不明显；组合６、组合８主条带不清晰且有杂
带出现；组合９中条带较清晰，但杂带较多且无法区分
出主带；组合５、组合７扩增效果好，其中组合７的多态
性相比５要高，条带之间界限更分明。选择组合７为
—６１—
中国草地学报　２０１２年　第３４卷　第４期
正交试验中的最佳组合，即在２５μｌ体系中：ｄＮＴＰ　０．５
ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔａｑ 酶０．５Ｕ、引物０．６μｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ
２＋２．０
ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＮＡ模板２０ｎｇ、１０×Ｂｕｆｅｒ　２．５μｌ。
为获得理想的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系，比较两种扩增
方法后，采用普通ＰＣＲ程序在组合７的基础上进行
第二轮的双因素和单因素优化筛选试验。
２．２　ｄＮＴＰ和 Ｍｇ２＋浓度对扩增体系的影响
由于ＰＣＲ原料ｄＮＴＰ会与 Ｍｇ２＋产生拮抗作用，
因此为确定最优的扩增条件，进行ｄＮＴＰ和Ｍｇ２＋浓度
双因素试验。在Ｍｇ２＋与ｄＮＴＰ的正交试验中（图３），
所有都能看到一条明显主带；组合８、组合１２能看到５
条清晰条带；组合１３到组合１６随着 Ｍｇ２＋浓度的增
大，主带的清晰度随之下降。本试验按组合８选取
ｄＮＴＰ浓度为０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｍｇ２＋浓度为２．５ｍｍｏｌ／Ｌ。
Ｍ为分子量标准；ｄＮＴＰ的浓度：１～４为０．１ｍｍｏｌ／Ｌ；
５～８为０．２ｍｍｏｌ／Ｌ；９～１２为０．３ｍｍｏｌ／Ｌ；１３～１６为０．４ｍｍｏｌ／Ｌ；
Ｍｇ２＋的浓度：１，５，９，１３为１．０ｍｍｏｌ／Ｌ；２，６，１０，１４为１．５ｍｍｏｌ／Ｌ；
３，７，１１，１５为２．０ｍｍｏｌ／Ｌ；４，８，１２，１６为２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｍ：Ｔｒａｎｓ２ＫＰｌｕｓ　ＤＮＡ　ｍａｋｅｒ；Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄＮＴＰ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ
ｂｙ　１～４ａｒｅ　０．１ｍｍｏｌ／Ｌ；５～８ａｒｅ　０．２ｍｍｏｌ／Ｌ；９～１２ａｒｅ　０．３ｍｍｏｌ／Ｌ；
１３～１６ａｒｅ　０．４ｍｍｏｌ／Ｌ；Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｇ２＋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｂｙ
１，５，９ａｎｄ　１３ａｒｅ　１．０ｍｍｏｌ／Ｌ；２，６，１０ａｎｄ　１４ａｒｅ　１．５ｍｍｏｌ／Ｌ；
３，７，１１ａｎｄ　１５ａｒｅ　２．０ｍｍｏｌ／Ｌ；４，８，１２ａｎｄ　１６ａｒｅ　２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
图３　Ｍｇ２＋和ｄＮＴＰ浓度对扩增结果的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｍｇ２＋ａｎｄ　ｄＮＴＰ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ
２．３　模板ＤＮＡ浓度对扩增体系的影响
从图４中可以看出，模板ＤＮＡ用量为１０ｎｇ时
不能产生条带，２０～１２０ｎｇ均能产生特异性条带，
高浓度时主条带过亮，可能会遮盖其他特异性条带。
２５μｌ体系时，模板ＤＮＡ浓度在２０～６０ｎｇ为宜。
Ｍ：分子量标准；１～７组合处理，参见表３；图５、图６、图７同
Ｍ：Ｔｒａｎｓ２ＫＰｌｕｓ　ＤＮＡ　ｍａｋｅｒ；１～７：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｎｕｍｂｅｒ，
ａｓ　ｓｈｏｗｎ　ｉｎ　ｔａｂｌｅ　３；Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｓ　Ｆｉｇ．５，Ｆｉｇ．６ａｎｄ　Ｆｉｇ．７
图４　模板ＤＮＡ浓度对扩增结果的影响
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ
２．４　Ｔａｑ　ＤＮＡ剂量对扩增体系的影响
Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶剂量是影响扩增反应效果的关键
—７１—
李钰莹　董宽虎　王若梦　杨静芳　　　白羊草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化
因素。由图５可见，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶的用量在０．５～３．０
Ｕ之间均可产生条带。３、４号处理的条带清晰，且多态
性好。考虑到试验效果和费用，在２５μｌ体系中，Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶用量选择１．０Ｕ较为适宜。
图５　Ｔａｑ酶浓度对扩增结果的影响
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ
２．５　引物浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增体系的影响
引物是ＰＣＲ特异性反应的关键，引物浓度过低，
引物与模板ＤＮＡ的结合位点减少，扩增产物减少；引
物浓度过高，会促使引物二聚体的产生。图６说明在
本试验中引物浓度在０．１～１．２μｍｏｌ／Ｌ范围内均可扩
增出条带，随着引物浓度的增高，扩增产物量增大，条
带亮度增加，本试验最佳引物浓度为组合４，即引物
浓度为０．６μｍｏｌ／Ｌ最适于２５μｌ体系。
图６　引物浓度对扩增结果的影响
Ｆｉｇ．６　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ
２．６　引物退火温度对扩增体系的影响
根据引物的Ｔｍ值，设计８个温度梯度进行扩
增，而扩增体系则参照以上的优化结果进行扩增，即
在２５μｌ体系中：ｄＮＴＰ　０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔａｑ酶１．０Ｕ、
引物０．６μｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ
２＋ ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＮＡ 模板
３０ｎｇ、１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μｌ。图７说明组合１、组
合２多态性好，组合２比组合１条带清晰，组合３到
组合８之间随着温度的增加，特异性条带数也减少，
条带亮度减弱。因此，本实验中 ＵＢＣ８２３的最适退
火温度为４９．６℃。
图７　引物退火温度对扩增结果的影响
Ｆｉｇ．７　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ
３　讨论
由于在不同物种中ＩＳＳＲ－ＰＣＲ最佳扩增条件不
同［６］，因此为保证试验结果并找到合适白羊草ＩＳ－
ＳＲ－ＰＣＲ最佳反应程序，首先将降落ＰＣＲ反应程序
与普通ＰＣＲ反应程序进行了效果比较。得到的降
落ＰＣＲ效果不理想，主条带非常清晰，但条带数相
对普通ＰＣＲ要少，多态性受到抑制。这可能与降落
ＰＣＲ原理有关，先用高退火温度扩增，保证扩增的
严谨性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温
度，提高扩增的效率。降落ＰＣＲ能有效的去除非特
异性条带的扩增，适合在ＰＣＲ体系与退火温度均未
知的情况下使用。但本试验中，究竟是过高的严谨
性抑制了多样性还是程序编写不合理导致降落
ＰＣＲ效果不理想，还有待进一步研究。综合考虑，
选用普通ＰＣＲ程序进行白羊草的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ试验
效果更好。
合适的ＰＣＲ参数是保证ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效率
的基本条件，对ＰＣＲ反应体系的优化，确保了分析
结果的可靠性［７］。Ｍｇ２＋与ｄＮＴＰ均是反应中的重
要成分，Ｍｇ２＋浓度既影响酶的活性及扩增的可靠
性，又影响引物与模板的结合效率、模板与ＰＣＲ产
物的解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形
成。作为扩增反应的原料，ｄＮＴＰ的浓度直接影响
扩增反应的结果，过多的ｄＮＴＰ对 Ｍｇ２＋会产生拮
抗作用，直接导致ＰＣＲ产物的减少，特别是 Ｍｇ２＋
浓度较低时，ｄＮＴＰ的拮抗作用尤其显著。
模板ＤＮＡ作为扩增的根本对象，在保证其质
量的前提下，在一定范围内扩增条带会随模板ＤＮＡ
浓度的升高而增加，但是模板浓度过高，则会导致非
特异性引物的产生［８］。
本试验的 Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶有着很高的活性，
—８１—
中国草地学报　２０１２年　第３４卷　第４期
在相对较广的浓度范围内都能扩增出较理想的条
带，综合考虑后选择１．０Ｕ作为最适浓度。
适量的引物浓度有利于ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的扩增
效率和反应特异性，引物浓度过高，会引起模板与引
物的错配，ＰＣＲ反应特异性下降，还会增大引物二
聚体的形成几率［９］；而引物浓度低则会导致ＰＣＲ扩
增效率下降。
在ＰＣＲ反应中，引物退火温度的高低直接影响
到引物与模板ＤＮＡ的特异性结合，退火温度过低
则扩增特异性差，条带弥散，背景深；退火温度过高
则引物与模板结合差，或出现非特异性条带、ＰＣＲ
产物丰度性低，因此对于不同的ＩＳＳＲ引物需要逐
一确定最适退火温度，本试验利用梯度 ＰＣＲ仪，
５３±７．５℃设出８个退火温度，最终确定了 ＵＢＣ８２３
的最佳退火温度。但由于不同的引物序列，引物
Ｔｍ值是不同的，实际应用时需要根据不同的引物
微调温度梯度。
应用于ＩＳＳＲ反应体系的优化方法较多，如单
因素、双因素、正交设计等。正交试验设计的特点是
用部分试验代替全部试验，并通过部分试验即可找
到较优的组合设计，相对于单、双因素试验，正交试
验减少了处理组合，节约了时间，降低了费用。虽然
正交试验有诸多优点，却存在一定的局限性，不能很
好的估计试验误差、说明各个试验条件之间的互作
等［１０～１１］。单、双因素试验则能很好的弥补这方面的
不足，直观的找出最优的试验处理，因此本实验又采
用双因素和单因素浓度梯度分析，进一步优化了白
羊草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系，校正了正交试验设计的不足，
最终找到了适合白羊草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ稳定扩增的最佳
反应体系在２５μｌ反应体系中个反应成分为：ｄＮＴＰ
０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔａｑ酶１．０Ｕ、引物０．６μｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ
２＋２．５
ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＮＡ模板３０ｎｇ、１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｅｒ　２．５μｌ。
参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：
［１］　董宽虎，米佳．白羊草种群繁殖的数量特征［Ｊ］．草地学报，
２００６，１４（３）：２１０－２１３．
Ｄｏｎｇ　Ｋｕａｎｈｕ，Ｍｉ　Ｊｉａ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ　ｏｆ　ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ
ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｏｔｈｒｉｏｃｈｌｏａ　ｉｓｃｈａｅｍｕｍｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ａｃ－
ｔａ　Ａｇｒｅｓｔｉａ　Ｓｉｎｉｃａ，２００６，１４（３）：２１０－２１３．
［２］　于娜，董宽虎．白羊草成熟胚组织培养及植株再生体系的建
立［Ｊ］．草地学报，２００８，１６（５）：４６６－４６９．
Ｙｕ　Ｎａ，Ｄｏｎｇ　Ｋｕａｎｈｕ．Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ
ｐｌａｎｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｒｏｍ　ｍａｔｕｒｅ　ｅｍｂｒｙｏ　ｏｆ　Ｂｏｔｈｒｉｏｃｈｌｏａ
ｉｓｃｈａｅｍｕｍ （Ｌ．）Ｋｅｎｇ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ａｇｒｅｓｔｉａ　Ｓｉｎｉｃａ，２００８，１６
（５）：４６６－４６９．
［３］　徐伟洲，徐炳成，段东平，等．不同水肥条件下白羊草光合生
理生态特征研究Ⅲ．叶绿素荧光参数［Ｊ］．草地学报，２０１１，１９
（１）：３１－３７．
Ｘｕ　Ｗｅｉｚｈｏｕ，Ｘｕ　Ｂｉｎｇｃｈｅｎｇ，Ｄｕａｎ　Ｄｏｎｇｐｉｎｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ
ｔｈｅ　ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｂｏｔｈｒｉｏｃｈｌｏａ　ｉｓｃｈａｅｍｕｍ
ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｗａｔｅｒ　ａｎｄ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓⅢ．Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｋｉｎｅｔｉｃ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ａｇｒｅｓｔｉａ　Ｓｉｎｉｃａ，
２０１１，１９（１）：３１－３７．
［４］　Ｓａｒａｈ　Ｍａｔａｋｉｓ，Ｒ．Ｄｅｂｏｒａｈ　Ｏｖｅｒａｔｈ，Ｂｒａｎｄｉ　Ｋｕｔｉｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｓｏ－
ｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｂｏｔｈ－
ｒｉｏｃｈｌｏａ　ｉｓｃｈａｅｍｕｍ （Ｐｏａｃｅａｅ）［Ｊ］．Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｏｔａ－
ｎｙ，２０１１，９８（７）：１９２－１９４．
［５］　刘美，赵桂琴，刘欢，等．早熟禾ＩＳＳＲ反应体系的优化［Ｊ］．
中国草地学报，２００９，３１（５）：１０７－１１１．
Ｌｉｕ　Ｍｅｉ，Ｚｈａｏ　Ｇｕｉｑｉｎ，Ｌｉｕ　Ｈｕａｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｐｏａ　Ｌ．［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓ－
ｌａｎｄ，２００９，３１（５）：１０７－１１１．
［６］　刘欢，慕平，赵桂琴，等．燕麦ＩＳＳＲ反应体系的建立与优化
［Ｊ］．中国草地学报，２０１０，３２（４）：８０－８５．
Ｌｉｕ　Ｈｕａｎ，Ｍｕ　Ｐｉｎｇ，Ｚｈａｏ　Ｇｕｉｑｉｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｅｓｔａｂ－
ｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｏａｔ［Ｊ］．
Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ，２０１０，３２（４）：８０－８５．
［７］　王育青，王晓晶，王建光．马蔺ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与
优化［Ｊ］．中国草地学报，２０１０，３２（２）：８０－８５．
Ｗａｎｇ　Ｙｕｑｉｎｇ，Ｗａｎｇ　Ｘｉａｏｊｉｎｇ，Ｗａｎｇ　Ｊｉａｎｇｕａｎｇ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｉｒｉｓ　ｌａｃｔｅａ　ｂｙ　ｕｎｉｆｏｒｍ　ｄｅｓｉｇｎ［Ｊ］．Ｃｈｉ－
ｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ，２０１０，３２（２）：８０－８５．
［８］　王方，袁庆华．冰草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化［Ｊ］．
草地学报，２００９，１７（３）：３５４－３５７．
Ｗａｎｇ　Ｆａｎｇ，Ｙｕａｎ　Ｑｉｎｇｈｕａ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ　ＩＳＳＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｃｒｉｓｔａｔｕｍ［Ｊ］．Ａｃｔａ
Ａｇｒｅｓｔｉａ　Ｓｉｎｉｃａ，２００９，１７（３）：３５４－３５７．
［９］　邹喻苹，葛颂，王晓东．系统与进化植物学中的分子标记
［Ｍ］．北京：科学出版社，２００１：１６．
Ｚｏｕ　Ｙｕｐｉｎｇ，Ｇｅ　Ｓｏｎｇ，Ｗａｎｇ　Ｘｉａｏｄｏｎｇ．Ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ
ｏｆ　ｂｏｔａｎｙ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓｓ，
２００１：１６．
［１０］　王彦华，侯喜林，徐明宇．正交设计优化不结球白菜ＩＳＳＲ反
应体系研究［Ｊ］．西北植物学报，２００４，２４（５）：８９９－９０２．
Ｗａｎｇ　Ｙａｎｈｕａ，Ｈｏｕ　Ｘｉｌｉｎ，Ｘｕ　Ｍｉｎｇｙｕ．Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｏｐｔｉｍｉｚａ－
ｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ＩＳＳＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｓｓｐ．
ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｂｏｔａｎｉｃａ　Ｂｏｒｅａｌｉ－
Ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉａ　Ｓｉｎｉｃａ，２００４，２４（５）：８９９－９０２．
［１１］　沙伟，滕兆岩，倪红伟．正交设计优化星星草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反
应体系研究［Ｊ］．中国草地学报，２００６，２８（６）：５２－５５．
Ｓｈａ　Ｗｅｉ，Ｔｅｎｇ　Ｚｈａｏｙａｎ，Ｎｉ　Ｈｏｎｇｗｅｉ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｎ　Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ　ｔｅｎｕｉｆ　ｌｏｒａ　ｂｙ　ｏｒｔｈｏｎｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ
［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ，２００６，２８（６）：５２－５５．
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李钰莹　董宽虎　王若梦　杨静芳　　　白羊草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｂｏｔｈｒｉｏｃｈｌｏａ　ｉｓｃｈａｅｍｕｍ
ＬＩ　Ｙｕ－ｙｉｎｇ，ＤＯＮＧ　Ｋｕａｎ－ｈｕ，ＷＡＮＧ　Ｒｕｏ－ｍｅｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｊｉｎｇ－ｆａｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｘｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ０３０８０１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｗｏ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｄｅｓｉｇｎ　ｗｅｒｅ
ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｂｏｔｈｒｉｏｃｈｌｏａ　ｉｓｃｈａｅｍｕｍ．Ｔｈｅ　ｆｉｖｅ　ｍａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｓｙｓｔｅｍ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｎ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　Ｍｇ２＋，ｄＮＴＰ，Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＤＮＡ　ｔｅｍ－
ｐｌａｔｅ　ａｎｄ　ｐｒｉｍｅｒ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＩＳＳＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗａｓ　０．２ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ，１ＵＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙ－
ｍｅｒａｓｅ，０．６μｍｏｌ／Ｌ　ｐｒｉｍｅｒ，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ
２＋，３０ｎｇ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ，１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ　ａｎｄ　ｗｉｔｈ　ｔｏ－
ｔａｌ　２５μＬ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅ－ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ　ａｔ　９４℃ｆｏｒ　５ｍｉｎｕｔｅｓ，
ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ　ａｔ　９４℃ｆｏｒ　４５ｓ，ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ａｔ　５０℃～６０℃ｆｏｒ　６０ｓ，ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ａｔ　７２℃ｆｏｒ　９０ｓ，ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ
３５ｃｙｃｌｅ，ａｎｄ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ａｔ　７２℃ｆｏｒ　５ｍｉｎｕｔｅｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｂｏｔｈｒｉｏｃｈｌｏａ　ｉｓｃｈａｅｍｕｍ；ＩＳＳＲ；ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ；Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
—０２—
中国草地学报　２０１２年　第３４卷　第４期