全 文 ：生物多样性 2008, 16 (1): 91–95 doi: 10.1360/biodiv.070239
Biodiversity Science http: //www.biodiversity-science.net

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收稿日期: 2007-09-03; 接受日期: 2007-11-15
基金项目: 国家林业局 948 项目“植物基因测序及功能改良技术引进”（2004-4-60）
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: zhu2222@126.com
冷箭竹根际土壤中可培养细菌的多样性
刘 敏1,2 李潞滨2 杨 凯3 韩继刚1 朱宝成1,4* 彭镇华2
1 (河北大学生命科学学院, 保定 071002)
2 (中国林业科学研究院林业研究所, 国家林业局林木培育重点实验室, 北京 100091)
3 (北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室, 北京 102206)
4 (河北农业大学生命科学学院, 保定 071001)
摘要: 为了解冷箭竹(Bashania fangiana)根际土壤中可培养细菌的多样性, 2006年5月从四川卧龙自然保护区冷箭
竹根际土壤中共分离出50株具不同菌落形态的细菌。16S rDNA序列分析结果表明: 50株菌分属于10个属26个种。
27株属于变形菌门γ亚群(Gammaproteobacteria)(42.3%)、9株属于厚壁菌门(Firmicutes)(26.9%)、4株属于放线菌门
(Actinobacteria) (15.4%) 、 6株属于变形菌门 β亚群 (Betaproteobacteria) (7.7%) 、 3株属于变形菌门 α亚群
(Alphaproteobacteria) (3.9%), 1株与土地杆菌属(Pedobacter)关系密切。假单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢杆菌属
(Bacillus)为优势菌属。2株菌为可能的新种或属。研究表明冷箭竹根际土壤中含有较为丰富的微生物多样性。
关键词: Bashania fangiana, 根际细菌, 可培养细菌, 多样性
Culturable bacterial diversity in rhizosphere of Bashania fangiana
Min Liu1,2, Lubin Li2, Kai Yang3, Jigang Han1, Baocheng Zhu1,4*, Zhenhua Peng2
1 College of Life Science, Hebei University, Baoding 071002
2 Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry; Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State
Forestry Administration, Beijing 100091
3 Key Laboratory of New Technology in Agricultural Application in Beijing, Beijing Agricultural College, Beijing 102206
4 College of Life Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001
Abstract: In order to understand the diversity of culturable bacteria, we collected Bashania fangiana
rhizosphere soil in Wolong Nature Reserve in May 2006. Then we isolated and cultured 50 bacteria strains
with different morphological character of colonies from the soil. Phylogenetic analysis based on the partial
16S rDNA sequences indicated that the 50 strains were clustered into ten genera: 27 strains of Gammapro-
teobacteria (42.3%), nine strains of Firmicutes (26.9%), four strains of Actinobacteria (15.4%), six strains of
Betaproteobacteria (7.7%), three strains of Alphaproteobacteria (3.9%), one strain closely related to the ge-
nus Pedobacter. The dominant bacteria were Pseudomonas and Bacillus. Additionally, we found two poten-
tial novel species. The result shows that the bacterial population diversity is abundant in B. fangiana
rhizosphere soil.
Key words: Bashania fangiana, rhizosphere bacteria, culturable bacteria, diversity

植物根际是土壤―植物生态系统物质交换的活
跃界面, 土壤细菌既是土壤微生物区系的重要组成
部分, 也是土壤物质流和能量流的主要推动者(李阜
棣和胡正嘉, 2003)。根际中细菌种类丰富, 存在着许
多对植物有益的细菌群落, 土壤微生物种类、数量以
及分布已成为评价土壤生态环境质量的重要指标。
冷箭竹(Bashania fangiana)为我国特有的亚高山竹类,
它是国宝大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的主食竹
种(易同培, 1997)。目前有关的研究主要集中于冷箭
竹的种子特性、自然更新、种群动态、生物生产量
·研究简报·
92 生 物 多 样 性 Biodiversity Science 第 16 卷
和更新复壮技术等生物学特性方面(秦自生等, 1989
a, b; 周世强, 1994; 周世强和黄金燕, 1998, 2002),
而在土壤微生物方面仅见有关缺苞箭竹(Fargesia
denudate)根际微生物数量和酶活性的报道(齐泽民
和杨万勤, 2006)。
本文采用稀释平板法分离培养冷箭竹根际土
壤中的细菌, 并依据16S rDNA序列特征对分离的
菌株进行了系统发育分析, 初步获得冷箭竹根际细
菌的物种多样性信息, 以期为进一步开展冷箭竹与
微生物关系研究和根际微生物资源的开发利用提
供基础。
1 材料与方法
1.1 样品的采集和处理
于2006年5月上旬, 在四川卧龙自然保护区“五
一棚”(海拔2,300–3,400 m)中坡位置沿等高线设置5
个样地(5 m × 10 m ), 在每个样地随机选取10株冷
箭竹。根据Courchesne和Gobran (1997)的根际区土
壤取样方法, 沿着冷箭竹基部挖取健康根系, 轻轻
抖动1 min, 取附着每株根系表面2 mm左右的土壤
为根际土。实验用根际土为5个样地采集的等量混
合土壤样品。样品采集后放入无菌牛皮纸袋中, 带
回实验室，4℃保存, 一周内分离。
1.2 根际细菌分离和计数
牛肉膏蛋白胨培养基(NM)配比(陈华癸, 1981)
为: 蛋白胨10 g, 牛肉膏3 g, NaCl 5 g, 琼脂15 g, 蒸
馏水1,000 mL, pH 7.2–7.4。
样品经系列稀释后涂布在NM培养基上, 30℃
倒置恒温培养, 2–3 d后统计菌落数量。挑取表型有
差异的单菌落, 纯化后转至NM斜面, 4℃保存。
1.3 细菌DNA提取和16S rDNA扩增
参考Kim等(1995)和Rainey等(1996)的方法少
量提取总DNA。室温干燥后溶于适量TE Buffer中,
1%琼脂糖电泳检测DNA质量。将DNA浓度调至70
ng/µL左右, 备做PCR模板。
引物为细菌通用引物(Stackebrandt et al., 1985),
正 向引物为 27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC
AG-3′, 反向引物为1495R: 5′-CTACGGCTACCT-
TGTTACGA-3′。分别对应于Escherichia coli 16S
rDNA的第8–27和1,495–1,514位碱基。
PCR扩增体系: DNA(70 ng/µL)模板2 µL; dNTP
Mixture (2.5 mM) 2.5 µL; 27 F (20 µM) 1.5 µL; 1495
R (20 µM) 1.5 µL; 10 × Ex Taq Buffer (Mg2+ plus ) 5
µL; Ex Taq 酶（5U/µL）0.2 µL; 补足ddH2O到50 µL。
PCR扩增程序: 94℃预变性3 min；94℃变性1
min, 55℃退火1 min, 72℃延伸3 min, 30个循环;
72℃延伸5 min。
Ex Taq DNA Polymerase等扩增所用试剂均购
自TaKaRa公司, PCR Purification Kit 购自北京金螺
旋生物科技中心, 引物由北京三博远志生物技术有
限责任公司合成。PCR仪使用Biometra公司生产的
Tgradient, 凝胶成像分析仪为 Bio-Rad 公司的
Gel-Doc2000。
1.4 16S rDNA序列分析
PCR扩增产物经PCR Purification Kit纯化后,
送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。将测
定的序列登录GenBank (登录号: EU169143–EU169
192), 并利用BLAST软件 (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/blast/Blast.cgi)与GenBank数据库中的序列进行
比对分析, 获得最相近菌株的16S rDNA序列, 用
Clustal X (Thompson et al., 1997)按照最大同源性的
原则进行排序, 采用Kimura 2 (Kimura, 1980)计算
核苷酸差异值, 并用Neighbor-joining(Saitou & Nei,
1987)构建系统进化树, 自展数(bootstrap)为1,000。
1.5 细菌多样性分析
定义16S rDNA序列同源性大于97%作为同一
种(Suzuki et al., 1997), 采用Shannon-Wiener指数
(H)和均匀度指数(E)计算多样性(陈梦, 2003)。
H
S
=1
lni i
i
Ρ Ρ= −∑ (1)
E=H/㏑S (2)
式中 S 为菌种数, Pi 为第 i 种的多度比例, 可以
用 Pi = ni／N 求出。ni 是第 i 种的菌株数, N是所
有菌株数总和。
2 结果与讨论
利用牛肉膏蛋白胨(NM)培养基对冷箭竹根际
土壤样品进行分离, 共获得50个菌落表型差异的菌
株, 菌落多为黄色和灰白色。用平板菌落计数法得
到细菌数量为4.3×106个/g干土, 与齐泽民和杨万勤
(2006)对各龄级缺苞箭竹根际土壤细菌数量的研究
结果(1.31×106个/g干土)在同一个数量级。
对50株分离培养物的16S rDNA进行序列测定,
共获得50条有效序列。相似性比对结果表明(表1),
第 1 期 刘敏等: 冷箭竹根际土壤中可培养细菌的物种多样性 93

表1 分离菌株的16S rDNA序列相似性分析
Table 1 Similarity analysis of partial 16S rDNA sequences of isolates from Bashania fangiana rhizosphere
* 定义OTU为菌株16S rDNA序列相似性≥97% The strains were clustered into operational taxonomic units (OTUs) at a level of sequence
similarity ≥97%


它们分属于10个属26个种。Shannon-Wiener多样性
指数(H)为4.2244, 均匀度指数(E)为0.8987。除菌株
B38和B9之外, 其他菌株均与数据库中已知细菌
16S rDNA序列具有较高的相似性(≥97％)。
基于16S rDNA序列的系统发育分析结果(图1)
表明, 所得的50条有效序列主要分属于5大类群。27
株属于变形菌门γ亚群(Gammaproteobacteria)(42.3%)
(按单元种类数计算百分比), 9株属于厚壁菌门
(Firmicutes)(26.9%), 4 株 属 于 放 线 菌 门
(Actinobacteria)(15.4%), 6株属于变形菌门β亚群
(Betaproteobacteria)(7.7%), 3株属于变形菌门α亚群
(Alphaproteobacteria)(3.9% )。
变形菌门γ亚群在冷箭竹根际细菌种类中比例
最高, 成为分离获得的最优势类群。该类群24株细菌
(34.6%)与假单胞菌属(Pseudomonas)关系密切, 16S
rDNA序列相似性为98–99%, 其中7株与拖拉氏假单
胞菌(P. tolaasii)关系密切 , 8株与荧光假单胞菌
(P. fluorescens)同源性较高。B38菌落呈土黄色, 表
面扩展呈扁平状, 革兰氏阴性短杆, 与数据库中已
知菌Acinetobacter johnsonii (DQ257425) 相似性仅
为95%, 可能为新种或新属。
Firmicutes类群为分离得到的第二大优势类群,
9株菌全部与芽孢杆菌属(Bacillus)关系密切, 16S
rDNA序列相似性介于98–100%之间。菌株B31代表
的分类单元与耐冷菌株Bacillus weihenstephanensis
(Lechner, 1998)同源性大于97%。
4株A ct i n o b a c t e r i a类群的菌与微杆菌属
(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)和壤球菌
属(Agrococcus)3个属的细菌关系密切。其中B16在
NA斜面上呈锗色, 革兰氏阳性球菌, 与 Agrococcus
jenensis (AM410679)相似性达99%, 为稀有放线菌。菌
株B9菌落呈黄白色 , 不透明 , 有光泽 , 革兰氏
类群
Genus
代表菌株(登录号)
Representative isolate
(accession no.)
菌株数
No. of isolates
in OTU*
最相近菌种(登录号)
Nearest type strain (accession no.)
序列相似性
Similarity
(%)
B34(EU169189) 7 Pseudomonas tolaasii (AF320989) 98
B46(EU169146) 3 P. brenneri (AF268968) 98
B64(EU169192) 1 P. poae (AJ492829) 97
B61(EU169159) 1 P. trivialis (DQ885949) 99
B62(EU169158) 1 P. frederiksbergensis (AY785733) 99
B25(EU169168) 1 P. lini (AY035996) 99
B23(EU169169) 1 P. aurantiaca (AY271792) 99
B69(EU169163) 8 P. fluorescens (AF094730) 99
假单胞菌属 Pseudomonas
B5(EU169177) 1 P. grimontii (AF268029) 99
B38(EU169148) 1 Acinetobacter johnsonii (DQ257425) 95 不动杆菌属 Acinetobacter
B33(EU169147) 2 A. johnsonii (DQ257425) 98
贪铜菌属 Cupriavidus B47(EU169175) 1 Cupriavidus basilensis (AY860224) 99
贪噬菌属 Variovorax B54(EU169184) 5 Variovorax paradoxus (DQ241396) 99
叶杆菌属 Phyllobacterium B70(EU169181) 3 Phyllobacterium myrsinacearum (AJ011330) 98
土地杆菌属 Pedobacter B52(EU169155) 1 Pedobacter cryoconitis (AJ438170) 99
B26(EU169182) 1 Microbacterium trichotecenolyticum (AB167383) 99 微杆菌属 Microbacterium
B9(EU169183) 1 M. schleiferi (Y17237) 91
壤球菌属 Agrococcus B16(EU169180) 1 Agrococcus jenensis (AM410679) 99
微球菌属 Micrococcus B7(EU169174) 1 Micrococcus indicus (AM158920) 99
B1(EU169187) 1 Bacillus mycoides (EF210295) 99
B31(EU169186) 3 B. weihenstephanensis (AM062685) 99
B72(EU169167) 1 B. cereus (AB244464) 100
B15(EU169176) 1 B. megaterium (AB271751) 100
B22(EU169170) 1 B. badius (AY803745) 99
B43(EU169188) 1 B. subtilis (EF656456) 99
芽孢杆菌属 Bacillus
B53(EU169154) 1 B. flexus (EF157301) 99
94 生 物 多 样 性 Biodiversity Science 第 16 卷



图1 根据分离自冷箭竹根际细菌和其相近菌种16S rDNA部分序列(分成26个OTUs)构建的系统发育树。圆括号内为序列登
录号, 中括号内为每一分类单元中分离的菌株数。Bootstrap值(百分值)(1,000次抽样)标注在分支处。
Fig. 1 Neighbor-joining tree based on partial and aligned 16S rDNA sequences of 26 OTUs isolated from Bashania fangiana
rhizosphere and their nearest type strains. GenBank accession numbers are given in parentheses. The number of isolates in one OTU
is presented in brackets. Bootstrap values (percent) calculated from 1,000 resamplings are shown at branch nodes.


阳性, 杆状,虽与Microbacterium schleiferi (Y17237) 聚
在一起, 但最高同源性仅为91%, 可能为新种或新属。
6 株 变形菌门 β 亚群的 细菌 与贪 铜菌属
(Cupriavidus)和贪噬菌属(Variovorax)亲缘关系密
切, 其中5株与Variovorax同源性较高。Alphaprote-
obacteria的3株细菌与叶杆菌属(Phyllobacterium)系
统关系密切。
本研究中 ,与Pseudomonas、Acinetobacter、
Micrococcus和Bacillus关系密切的４个土壤常见菌
属都获得了分离培养。其中Pseudomonas(34.6%)为最
第 1 期 刘敏等: 冷箭竹根际土壤中可培养细菌的物种多样性 95
优势菌属, Bacillus(26.9%)为第二优势菌属。前人研
究认为Pseudomonas和Bacillus为土壤中的典型微生
物(Harris, 1988), 它们对植物根系的分泌物和脱落
物反应迅速, 生长繁殖很快, 因而可以从植物根际
中广泛地分离出来。此外, 4株菌的16S rDNA序列与
已报道的耐冷菌的相似性很高。说明冷箭竹根际存
在一些能够适应高海拔低温环境的耐冷菌。
所获得的可培养细菌种类和数量与所采用的培
养基有密切的联系。本研究仅采用牛肉膏蛋白胨一种
培养基分离冷箭竹根际细菌, 还存在一定的局限性。
因此采用多种培养基对样品进行分离培养, 将有助于
了解冷箭竹根际可培养细菌种群的完整信息。
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