全 文 ：Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
2012年第1期
莜麦中病程相关蛋白的分离纯化
及其几丁质酶活性分析
!
!
!
!
Van Loon等 1970年首先从烟草花叶病毒
（tobaccomosaic virus，TMV）侵染的烟草叶片中检测
到与过敏性反应（HR）相关的蛋白，如葡聚糖酶、几
丁质酶，后来将这些由病原物诱导植物产生的特异
性蛋白质统称为病程相关蛋白（pathogenesis-related
proteins，PRP），它们属于抗真菌蛋白的一种。至今已
在7个科30多种植物中发现PRP，其中多数为双子叶
植物，例如番茄[1]、马铃薯[2]、菜豆、豌豆、豇豆[3-4]，最近
又在野油菜[5]、芸薹[6]、鹰嘴豆[7]、拟南芥[8]、水稻[9]中分
离到病程相关蛋白。PRP在正常植物中不存在或表
现微弱，而当植物被病原菌感染或诱导后，则迅速产
生并积累。与病原菌本身相关的一些物质同样可以
诱导植物产生PRP，例如几丁质、β-1，3葡聚糖等[10]。
PRP相对分子质量较小，一般为10~40ku，PRP有较强
的稳定性，大部分PRP能抵抗蛋白酶、糖苷酶、重金
属、尿素、低pH和高温（60℃）。不同诱发因子在诱导
植物系统中产生的PRP的生物特性各不相同。PRP一
般表现一种或几种活性，如几丁质酶、β-1，3葡聚糖
酶、脱乙酰壳多糖酶、类甜味蛋白（Thaumatin-Like
protein，TLP）等。植物体的病程相关蛋白中TLP一类
属于多功能蛋白，不仅具有α-淀粉酶的抑制活力，还
有胰蛋白酶的抑制活力以及几丁质酶的部分活力[4]。
本文从山西应县的莜麦种子中，利用蛋白的分离纯
化技术，获得到一种病程相关蛋白，除具有抑制胰蛋
白酶活力外，还具有抗真菌活性，并发现其具有一定
的几丁质酶活性。在以胶体几丁质为底物的条件下，
分析了该酶的最适反应温度和最适反应pH以及金属
离子对该蛋白几丁质酶活性的影响。
闫永飞，石亚伟*
（教育部化学生物学与分子工程重点实验室，山西大学生物技术研究所，山西太原 030006）
摘 要：病程相关蛋白广泛存在于高等植物中，可以被多种微生物病原菌诱导产生，是植物抗病物质，具有重要应用
前景。 以莜麦种子为原料，经丙酮脱脂、硫酸铵盐析、DEAE离子交换以及Superdex-200层析等方法，获得一种具有几
丁质酶活性的病程相关蛋白，其在酸性条件下稳定存在，最适pH为5.0，最适反应温度为45℃，当温度高于65℃时活性
丧失80%。 蛋白分子量经测定为23.7ku，为单体蛋白。 该蛋白可以抑制白腐菌、毛壳菌的生长，其最低抑制浓度为
30μg/mL；但对红曲霉没有效果。
关键词：病程相关蛋白，莜麦，纯化，特征
Purification and characterization of pathogens-related proteins
from Avena nuda
YAN Yong-fei，SHI Ya-wei*
（Institute of Biotechnology，Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education，
Shanxi University，Taiyuan 030006，China）
Abstract：Pathogens-related proteins extensively existed in higher plants，which could be induced by various
microorganism and belong to disease-resistant proteins that are attracted in the application fields. Through
defatting with acetone，30%~60%（NH4）2SO4 precipitation and DEAE ion exchange chromatography，Superdex-
200 chromatography，pathogens-related proteins with the activity of chintinase was purified from the seeds of
Avena nuda. The enzyme was stable from pH2.0~7.0 with optimum pH at 5.0. The optimum temperature of the
enzyme was 45℃，and its activity was rapidly lost at temperatures above 65℃. The relative molecular weight
was about 23.7ku. The growth of Trametes sp. SQ01 and Chaetomium sp. R01 were inhibited by the enzyme，
with lowest dose of 30μg/mL.
Key words：pathogens-related proteins；Avena nuda；purification；characterization
中图分类号：TS210.1 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2012）01-0094-04
收稿日期：2010－11－11 * 通讯联系人
作者简介：闫永飞（1986-），女，硕士研究生，研究方向：蛋白质工程。
基金项目：太原市明星专项资助。
94
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.01.107
研究与探讨 Vol . 33 , No . 01 , 2012
2012年第1期
1 材料与方法
1.1 实验材料
莜麦种子 产自山西应县；蛋白分离纯化的材
料 DEAE-Sepharose Fast Flow柱、Superdex-200柱，
均购自GE公司；甲壳素 购自中国生化制品厂；其它
试剂 均为国产分析纯；抗真菌活性测定所用的白腐
菌（Trametes sp. SQ01）、毛壳菌（Chaetomium sp. R01）、
红曲霉（Monascuspurpureus） 为本实验室保存。
1.2 实验方法
1.2.1 PRP蛋白的分离纯化 将莜麦种子去壳粉碎，
经丙酮脱脂后用含50mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，
pH8.0的缓冲液溶解，14000r/min 4℃离心30min，收集
上清液，加入固体硫酸铵进行分级沉淀，收集30%~
60%（NH4）2SO4沉淀。用50mmol/L Tris-HCl，pH8.0缓冲
液悬浮，并用相同缓冲液在4℃进行透析。将透析后
的样品离心后上样到经50mmol/L Tris-HCl，pH8.0缓冲
液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱，进行盐离子
浓度梯度洗脱。收集活性峰，浓缩后上样于50mmol/L
Tris-HCl，150mmol/L NaCl pH8.0平衡的Superdex-200
层析柱，收集活性部分，浓缩后进行SDS-PAGE电泳
鉴定。
1.2.2 PRP分子量的测定 采用Superose12（10/30）
预装柱于AKTA purifier系统，用20mmol/L Tris-HCl，
100mmol/L NaCl，pH8.0缓冲液预平衡凝胶柱，流速为
0.5mL/min，室温280nm紫外检测。标准蛋白分子为牛血
清白蛋白（136ku）、卵清蛋白（45ku）、胰蛋白酶（24ku）、
溶菌酶（14.4ku）。根据Kav-lgMr作图，求得该样品的
天然分子量。Kav=（Ve-V0）/（Vi-V0），其中Ve、Vi、V0分别
是洗脱体积、柱体积和外排体积。亚基数目和亚基分
子量采用SDS-PAGE分析。
1.2.3 PRP抗真菌活性分析 抗真菌活性的鉴定采
用牛津杯法[11]。配制PDA培养基（成分：200g土豆，20g
葡萄糖，2g磷酸二氢钾，1g结晶硫酸镁，10mgVB1），将
菌株（白腐菌、毛壳菌、红曲霉）点种于培养基的中
心，于30℃条件下培养，当其菌落直径长至1~2cm时
向菌落的外围加入灭菌的牛津杯，将该样品和不含
该样品的其他条件完全相同的含50mmol/L NaCl 的
20mmol/L Tris-HCl，pH8.0缓冲液通过滤膜除菌加入
牛津杯内，于4℃放置24h使其充分扩散，然后将平板
放入30℃培养箱中进行培养过夜，进行观察。
1.2.4 PRP几丁质酶活性测定 采用3，5-二硝基水
杨酸（DNS）法[12-13]。将100μL含10mg/mL的胶体几丁
质与相同体积的0.467mg/mL PRP蛋白在37℃下保温
30min后，加入1mL 3，5-二硝基水杨酸显色剂，沸水
浴10min终止反应，最后用蒸馏水定容至5mL，于
540nm处测定光吸收值。以不加PRP作为对照。
几丁质酶活力的定义为：在37℃条件下，每分钟
产生1μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量。
1.2.5 温度对PRP几丁质酶活性的影响 将电泳纯
的莜麦PRP蛋白，分别置于25、35、45、55、65、75℃条
件下，在pH8.0的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中保温
30min，进行酶活性测定，确定最适反应温度。将莜麦
PRP蛋白在上述温度下，先保温30min，然后冰浴
10min，在标准条件下进行酶活测定。
1.2.6 pH对PRP几丁质酶的活性的影响 配制一系
列100mmol/L的pH缓冲液：pH2~5为醋酸盐缓冲液，
pH6~8为磷酸盐缓冲液，pH9~10为硼酸盐缓冲液。将
莜麦PRP蛋白在上述不同缓冲液于中 37℃保温
30min，然后在标准条件下测定PRP几丁质酶活性，确
定PRP的几丁质酶活性pH稳定性。最适pH的确定采
用在上述不同pH条件下进行活性测定。
1.2.7 金属离子对PRP蛋白活性的影响 先将莜麦
PRP蛋白与各金属离子在37℃保温10min后，再加入
10mg/mL几丁质胶体底物，37℃反应30min，DNS法测
定其酶活，以不含金属离子的缓冲液为对照。
2 结果与分析
2.1 PRP蛋白的纯化
莜麦种子经丙酮脱脂，获得的粗蛋白溶液利用
硫酸铵盐析以及DEAE阴离子柱层析结合Superdex-
200层析柱，我们首次从莜麦种子中分离到电泳纯的
PRP蛋白。采用SDS-PAGE分析蛋白的分子量大约在
20ku左右，分子量接近病程相关蛋白的分子量范围
（图1）。
2.2 蛋白分子分子量的测定
将获得的电泳纯PRP蛋白和标准蛋白质上样于
Superose12分子排阻层析，进行分子量的测定。PRP
的洗脱体积为15.21mL，相应其Kav值为0.469，lgMr为
4.37，根据Kav-lgMr作图，可知其相对分子量为23.76ku
（图2），而SDS-PAGE结果显示其分子量为22ku，进一
步说明莜麦PRP蛋白是以单体形式存在的小分子量蛋
图2 分子排阻层析对天然PRP蛋白分子量的测定
Fig.2 Determination of nature PRP molecular weight by
molecular exclusion chromatography
注：·代表PRP蛋白在Kav-lgMr图上的位置。
0.55
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9
lgMr
K a
v
图1 12% SDS-PAGE检测PRP蛋白的纯化
Fig.1 Purification of PRP proteins determined by 12% SDS-PAGE
注：1.蛋白质标准；2.蛋白粗提液；3.30%~60%硫酸铵沉淀；
4.DEAE阴离子交换层析；5.Superdex-200凝胶层析。
116
1 2 3 4 5
66
45
35
25
18
ku
95
Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
2012年第1期
白质（图3）。该分子量也接近于TLP一类的PRP蛋白。
2.3 PRP抗真菌活性的鉴定
真菌主要是以菌丝方式进行扩散生长，若遇抑
菌物质，菌落生长会产生类似弯月的菌落边缘形态。
从图4中也可以定性地观察到，PRP对白腐菌的抑菌
效果最明显，毛壳菌次之，对红曲霉的抑制最不明
显，并且抑制活性存在剂量依赖性，其最小抑制浓度
为30μg/mL。
2.4 PRP几丁质酶活性的最适温度及pH
将PRP分别在25~75℃温度范围内，测定其几丁
质酶的活性，以及在上述温度保温30min后，置冰浴
10min，在标准条件下测定不同保温处理的PRP样品，
结果显示PRP的几丁质酶活性在55℃以下，酶活可以
保留80%活力，具有良好的热稳定性，当高于65℃，其
酶活急剧下降；PRP 的几丁质酶活性的最适温度为
45℃（图5）。比李奕雅[16]等报道的花生中的几丁质酶
温度40~50℃范围更大。
将相同量的PRP蛋白，溶解在0.1mol/L的不同pH
缓冲液中（pH2~5为醋酸盐缓冲液，pH6~8为磷酸盐缓
冲液，pH9~10为硼酸盐缓冲液），保温30min，按1.2.4
标准方法进行活性测定。结果表明，PRP在pH5.0时活
力最高。而不同pH条件下保温后，再在标准条件下进
行活性测定，PRP在pH5.0~8.0可以稳定存在，并显示
几丁质酶的活性（图6）。该性质与李奕雅[14]等报道的
花生中的几丁质酶pH范围相似。
2.5 金属离子对PRP几丁质酶活性的影响
在PRP测活体系中添加终浓度为1mmol/L的不同
金属离子，保温30min后，利用1.2.4标准方法进行几
丁质酶活性测定。可以看出，Mn2+有明显的促进作用；
Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Ca2+的促进作用不明显；Co2+、
Ni2+、Cu2+具有明显的抑制作用（图7）。而绿僵菌中金
属离子Zn2+、Ca2+、Ba2+和Mn2+离子对几丁质酶活性有
明显的促进作用，而Hg2+、Co2+和Fe2+离子具有显著抑制
几丁质酶活性的作用[15]。
3 结论与讨论
植物中普遍存在的抗病机制有两种：过敏反应
（hypersensitive response，HR）和系统获得性抗性
（systemic acquired resistance，SAR）[16]。自从烟草中的
一些病程相关蛋白如几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶被
鉴定为具有潜在的抗真菌活性之后，病程相关蛋白
参与植物系统获得性抗性的结论被广泛接受，但其
作用机制尚不清楚。
莜麦的PRP至今未见任何国内外报道。利用硫
酸铵沉淀、阴离子交换层析，从莜麦种子中分离提取
到的一种病程相关蛋白，纯化步骤简单，样品纯度
高。实验发现其不仅有胰蛋白酶抑制活力，还具有抗
真菌活性，进一步检测到其具有一定的几丁质酶活
性。其活力和莜麦种子的真正意义上的几丁质酶活
图3 12% SDS-PAGE对PRP单体及亚基数的分析
Fig.3 Analyze of PRP monomer and subunit by 12% SDS-PAGE
注：1.标准蛋白分子量；2.PRP。
116
1 2
66
45
35
25
18
ku
图4 PRP对真菌的抑制活性分析
Fig.4 Inhibition activity of PRP to fungus
注：a.PRP对白腐菌菌丝生长的抑制；b.PRP对毛壳菌菌丝生长
的抑制；c.PRP对红曲霉菌丝生长的抑制；
0：control；1：30μg·mL-1；2：50μg·mL-1；3：80μg·mL-1。
a b c
0
1
2
3
0
0
1 1
2
2
图5 温度对PRP几丁质酶活的影响
Fig.5 Effect of temperature on PRP fungus activity
温度（℃）
20 30 40 50 60 70 80
100
80
60
40
20
0
相
对
比
活
力
（
%）
温度稳定性曲线
最适温度曲线
图6 pH对PRP几丁质酶活的影响
Fig.6 Effect of pH on PRP fungus activity
pH
2 4 6 8 10 12
100
80
60
40
20
0
相
对
比
活
力
（
%）
最适pH曲线
pH稳定性曲线
图7 金属离子对PRP几丁质酶活性的影响
Fig.7 Effect of metal ions on PRP fungus activity
金属离子
Control
200
180
160
140
120
100
80
60
40
相
对
比
活
力
（
%）
Co2+ Ni2+ Mn2+Mg2+ Zn2+ Fe3+ Ca2+ Cu2+ Na+ K+
96
研究与探讨 Vol . 33 , No . 01 , 2012
2012年第1期
[8] ISO 5509：2000（E）. Animal and vegetable fats and oils -
Preparation of methyl esters of fatty acids [M]. First edition.
International Standard，2000.
[9] FEENEY R E，WEAVER J M，JONES J R，et al. Studies of the
kinetics of yolk deterioration in shell eggs[J]. Poultry Science，
1956，35：1061-1066.
[10] LAI K M， CHUNG W H， HSU K C. Oil exudation and
histological structures of duck egg yolks during brining [J].
Poultry Science，2010，89：738-744.
[11] KAEWMANEE H， BENJAKUL S， VISESSANGUAN W.
Changes in chemical composition， physical properties and
microstructure of duck egg as influenced by salting [J ] . Food
Chemistry，2009，112（3）：560-569.
[12] OARADA M，TSUZUKI T，GONOI T，et al. Effects of dietary
fish oil on lipid peroxidation and serum triacylglycerol levels in
psychologically stressed mice[J]. Nutrition，2008，24（1）：67-75.
[13] YANG S C，CHEN K N. The oxidation of cholesterol in the yolk
of selective traditional Chinese egg products[J]. Poultry Science，
2001，80（3）：370-375.
[14] CHEN B Q，XUE Y B，LIU J R，et al. Inhibition of conjugated
linoleic acid on mouse forestomach neoplasia induced by benzo
（a） pyrene and chemopreventive mechanisms[J]. World Journal
of Gastroenterology，2003，9（1）：44-49.
[15] LEE K N，KRITCHEVSKY D，PARIZA M W. Conjugated
linoleic acid and atherosclerosis in rabbits [J]. Atherosclerosis，
1994，108（1）：19-25.
[16] KRITCHEVSKY D，TEPPER S A，WRIGHT S，et al. Influence
of graded levels of conjugated linoleic acid（CLA） on experimental
atherosclerosis in rabbits[J]. Nutrition Research，2002，22（11）：
1275-1279.
[17] PARK Y，STORKSON J M，ALBRIGHT K J，et al. Evidence
that the trana-10，cis-12 isomer of conjugated acid induces body
composition changes in mice[J]. Lipids，1999，34（3）：235-241.
[18] MARKS F，DECKER K M，FURTENBERGER G. A causal
relationship between unscheduled eicosanoid signaling and tumor
development：cancer chemoprevention by inhibitors of arachidonic
acid metabolism[J]. Toxicology，2000，153（1-3）：11-26.
[19] BELL J G，FARNDALE B M，BRUCE M P，et al. Effects of
brood stock dietary lipid on fatty acid compositions of eggs from
sea bass（Dicentrarchus labrax）[J]. Aquaculture，1997，149（1-2）：
107-119.
[20] SPEAKE B K，SURAI P F，et al. Fatty acid profiles of yolk
lipid of five species of wild ducks（Anatidae） differing in dietary
preference[J]. Journal Zoology（London），2002，257（4）：533-538.
[21] 蔡健，王薇 . 蛋品风味物质研究 [J]. 食品科技，2003（4）：
31-33.
力相比大约是其1/10的水平（结果未显示），并且Mn2+能
明显地促进其酶活。其抗真菌的活性可能的机制是
通过其发挥几丁质酶的活性来显示。但是病程相关
蛋白的作用方式是否类似于动物体内的免疫蛋白，
还有哪些重要因子同时参与，其信号转导及基因表
达的具体途径怎样，SAR和PRP的内在关系如何，这
些均有待更多PRP结构的解析、基因表达调控的阐
明及PRP作用模式的建立。
参考文献
[1] Rodrigo I，Vera P，Frank R，et al. Identification of the viroid-
induced tomato pathogenesis-related （PR） protein P23 as the
thaumatin-like tomato protein NP24 associated with osmotic stress.
[J]. Plant Mol Biol，1991，16（5）：931.
[2] El-Banna A，Hajirezaei MR，Wissing J，et al. Over-expression
of PR -10a leads to increased salt and osmotic tolerance in
potato cell cultures[J]. J Biotechnol，2010，150（3）：87-277.
[3] Onishi M，Tachi H，Kojima T，et al. Molecular cloning and
characterization of a novel salt-inducible gene encoding an acidic
isoform of PR-5 protein in soybean（Glycine max[L.] Merr.） [J].
Plant Physiol Biochem，2006，44（10）：80-574.
[4] Franco OL，Rigden DJ，Melo FR，et al. Plant alpha-amylase
inhibitors and their interaction with insect alpha -amylases [J].
Eur J Biochem，2002，269（2）：397-412.
[5] Conrads-Strauch J，Dow JM，Milligan DE，et al. Induction of
gydrolytic enzymes in brassica campestris in response to pathovars
of xanthomonas campestris [J]. Plant Physiol，1990，3 （1）：43 -
238.
[6] Rasmussen U ， Bojsen K ， Collinge DB . Cloning and
characterization of a pathogen -induced chitinase in Brassica
napus[J]. Plant Mol Biol，1992，20（2）：87-277.
[7] Vogelsang R， Barz W. Purification， characterization and
differential hormonal regulation of a beta -1，3 -glucanase and
two chitinases from chickpea（Cicer arietinum L.）[J]. Planta，1993，
189（1）：9-60.
[8] Uknes S，Mauch-Mani B，Moyer M，et al. Acquired resistance
in arabidopsis[J]. Plant Cell，1992，4（6）：56-645.
[9] Masuta C，Van den Bulcke M，Bauw G，et al. Differential
effects of elicitors on the viability of rice suspension cells[J]. Plant
Physiol，1991，97（2）：29-619.
[10] 胡明，李晓宇，马平，等. 抗真菌蛋白研究进展[J]. 生物技术
通报，2004（3）：13-17.
[11] 孙斌，李多川，慈晓燕. 小麦叶片β-1，3-葡聚糖酶的诱导、纯
化与抗菌活性[J]. 植物生理和分子生物学报，2004（4）：399-404.
[12] 张龙翔，张庭芳，李令媛. 生物实验方法和技术[M]. 北京：
高等教育出版社，1997：1-3.
[13] Wisessing A，Engkagul A，Wongpiyasatid A，et al. Biochemical
characterization of the alpha -amylase inhibitor in mungbeans
and its application in inhibiting the growth of Callosobruchus
maculatus[J]. J Agric Food Chem，2010，58（4）：7-2131.
[14] 李奕雅，陈凡. 花生几丁质酶的纯化及酶学性质研究[J]. 漳
州师范学院学报：自然科学版，2008（3）：79-83.
[15] 杨革，陈洪章，李佐虎. 绿僵菌几丁质酶的分离纯化及性
质[J]. 化工学报，2005（4）：672-676.
[16] 赵淑清，郭剑波. 植物系统性获得抗性及其信号转导途径
[J]. 中国农业科学，2003（7）：286-290.
（上接第93页）
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
97