全 文 ：大叶藻胚的石蜡切片制作方法
刘延岭 ,田萍萍＊ ,钱冠兰 ,王宏梅 ,崔翠菊 ,潘金华 ,孙 娟　(山东东方海洋科技股份有限公司 ,山东烟台 264003)
摘要　研究固定方法、脱水及浸蜡时间 、染色方式对大叶藻胚石蜡切片制作效果的影响。结果表明 ,采用标准固定液(FAA)固定 48h以
上 ,脱水每级梯度时间 2h,分 3次浸蜡(每次 30min),苏木精-伊红染色 ,可制作出染色清晰 、组织结构完整的大叶藻胚切片。
关键词　大叶藻;胚;石蜡切片
中图分类号　S132　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2011)13-07779-02
MakingMethodofParafinSectionofZosteramarinaEmbryo
LIUYan-lingetal　(ShandongOrientalOceanSci-TechCo., Ltd., Yantai, Shandong264003)
Abstract　Theinfluencesoffixationmethod, dehydration, wax-soakingtimeandstainingmethodonthemakingeffectofparafinsectionof
Zosteramarinaembryowerestudied.TheresultsshowedthattheparafinsectionofZosteramarinaembryo, whichshowedclearstainingefect
andwholehistologicalstructure, wasmadebyfixingwithstandardfixationliquid(FAA)formorethan48h, gradientdehydrationfor2hper
grade, waxsoakingfor3timesand30minonceandstainingwithhematoxylin-eosin.
Keywords　Zosteramarina;Embryo;Parafinsection
基金项目　山东省科技发展计划项目(2010GSF10612);烟台市科学技
术发展计划项目(2009211);海洋公益性行业科研专项经费
项目(200905020-12)。
作者简介　刘延岭(1985-),女 ,山东潍坊人 ,硕士研究生 , 研究方向:
海洋植物学。 ＊通讯作者 , 硕士 ,工程师 , E-mail:pptian2010
@163.com。
收稿日期　 2011-01-30
　　海草(Seagras)是指能够在海洋中进行沉水生活 ,并能
在海洋中完成开花 、结果和萌发等整个生活史的高等植物 ,
在被子植物中只占约 0.02%[ 1] 。大叶藻就是其中的一个典
型代表 ,其为多年生草本 ,根状茎匍匐生长;瘦果 ,椭圆形至
长圆形 ,长约 4 mm,具喙;外果皮褐色 ,干膜质至革质 ,具纵
纹;种子暗褐色至淡黄色 ,具清晰的 16 ～25条纵肋;花果期 3
～7月 ,半水媒传粉 [ 2] 。
大叶藻以形成广阔群落的方式分布于浅海地区 ,是近海
重要的初级生产者 ,也是近海生态系统的重要组成部
分 [ 3-4] 。其种群形成的灌丛是许多海洋生物(如沙蚕 、海蚯
蚓等)的栖息育幼场所 [ 5] 。大叶藻海草床可缓冲水流对海底
基质的扰动 ,并可过滤水流中的沉积物和营养物质 [ 6];另外 ,
其根和茎可固定海底沉积物 ,有利于保持海水的透明度 [ 7] 。
笔者首次应用石蜡切片法对大叶藻胚进行石蜡切片 ,结果表
明 ,该方法获得的大叶藻切片可清晰显示胚的整体形态及各
部分组织细胞的结构 ,为进一步研究大叶藻种子奠定了
基础。
1　材料与方法
1.1　材料　成熟大叶藻种子 ,于 2009年 8月采自荣成禇岛
自然海区。
1.2　试剂　无水乙醇 、二甲苯均为分析纯;FAA固定液 ,苏
木精染液 ,伊红(醇溶性)染液;甘油蛋白 ,切片石蜡 ,中性加
拿大树胶。FAA固定液:按 50%乙醇 90 ml、冰醋酸 5 ml、福
尔马林 5ml比例配制。苏木精染液:取苏木精 0.8 g,溶于 95
ml蒸馏水中 ,加入研磨后的铵明矾 ,待明矾溶解后依次加入
碘酸钠 、甘油和冰醋酸备用。伊红(醇溶性)染液:称取 10 g
署红 ,加入 100ml95%乙醇中溶解备用。
1.3　方法
1.3.1　取材与固定 。取大叶藻种子 ,用吸水纸吸干组织块
上的水分 ,剥去种皮和胚乳后迅速放入 FAA固定液中固定
24 h以上。
1.3.2　梯度乙醇脱水。将固定好的组织放入 50%乙醇中泡
洗 3遍 ,每遍 5min,以洗去残留固定液 ,然后依次放入 50%、
70%、80%和 95%乙醇及无水乙醇中脱水 ,各级均脱水 1 ～2h。
1.3.3　透明 、浸蜡 、包埋 。将脱水后的材料放入无水乙
醇 /二甲苯(1∶1)混合液中 30min,然后在二甲苯中透明处理
约 10min,以光线基本能透过组织为度。透明后将材料放入
二甲苯 /石蜡(1∶1)混合液中 30min,再放入 58 ℃熔融的纯
蜡(I)※纯蜡(I)中各浸蜡 45 min。将浸蜡后的材料放入恒
温箱中保温(58 ℃),进行常规石蜡包埋。将蜡盒倒满熔融
石蜡 ,用镊子夹取材料移入盒内石蜡中 ,按所要切得方向摆
放好材料。在蜡面上吹气使蜡的表面凝成薄层 ,将蜡盒移入
凉水中并将纸盒压入水底 ,完全凝固后即获蜡块。标明材料
的类型 、包埋方向及包埋日期等。
1.3.4　切片 、展片 、烘干。拆去纸盒获得蜡块 ,对蜡块进行修
整后在 RM2015型轮转式切片机上进行常规石蜡连续切片 ,
切片厚度为 10μm。将连续切片放入 40℃水浴锅中展片 ,蜡
带完全展开后将涂有甘油蛋白的载玻片插入水中 ,平放在蜡
带下边 ,向上提 ,使蜡带附在载玻片上 ,倾去多余的水分 ,室
温晾干或置于 35℃烘箱中烘干备用。
1.3.5　脱蜡 、复水 、苏木精染色。将充分干燥的切片先后放
入二甲苯(I)和二甲苯(I)中分别进行脱蜡处理 20和 10
min。脱蜡后的切片依次放入二甲苯 /无水乙醇(1∶1)混合
液 、无水乙醇及 95%、80%、70%、50%乙醇中各 5 min,于蒸
馏水中浸洗 2次。
复水后的切片经苏木精染色 5 min后 ,自来水(流水)冲
洗 15 min,低倍镜检查见细胞核呈蓝色 ,结构清楚 ,细胞质或
结缔组织纤维成分无色。
1.3.6　脱水 、伊红染色。染色后的切片经蒸馏水浸洗 2遍
后依次入 50%、70%和 80%乙醇中各 5 min进行脱水处理。
脱水后的切片入 10%伊红乙醇溶液中染色 1 min,然后入
95%乙醇(I)5 min, 95%乙醇(I)5 min,无水乙醇(I)5 min,
无水乙醇(I)5min,洗去非特异性着色。
1.3.7　透明 、封片。切片依次入二甲苯 /无水乙醇(1∶1)混
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2011, 39(13):7779-7780 责任编辑　常俊香　责任校对　况玲玲
合液 5 min,二甲苯(I)10 min,二甲苯(I)20min进行透明处
理 。切片从二甲苯中取出后 ,待二甲苯未挥发完全之前 ,在
材料中央滴 1滴中性加拿大树胶 ,盖盖玻片 ,通风干燥 ,制成
永久切片。用 OLYMPUS倒置显微镜观察并拍照。
2　结果与分析
采用该方法可制作出染色清晰 、组织结构完整的大叶藻
胚切片。由图 1可知 ,大叶藻胚由子叶 、胚根 、胚轴和胚芽 4
部分构成。在子叶中可以看到染色较深的中央维管束贯穿
胚根 、胚轴 、胚芽和子叶;胚根有 2个生长点 ,由染色较深的
分生细胞构成;胚芽最外层是 1层排列整齐 、染色较深的表
皮细胞 ,内部散布着分生组织和液泡状的气道;胚芽的一侧
由子叶的 2层表皮细胞包裹 ,子叶上有 1个倾斜的孔道 ,是
胚芽向外生长的部位。
注:A.大叶藻胚纵切(×100);B.胚根横切(×400);C.胚芽横切(×400)。
Note:A.LongitudinalsectionofZosteramarinEmbryo(×100);B.Transversesectionofradicule(×400);C.Transversesectionofplumule(×400).
图 1　大叶藻胚的石蜡切片
Fig.1　ParafinsectionofZosteramarinembryo
3　讨论
由于大叶藻种子对海洋沉水生活的适应性 ,与陆地植物
不同 ,其胚较软 ,切片制作较难 ,在石蜡切片制作过程中很多
因素都会影响切片的效果 。
完整的材料是做好切片的关键 ,该研究取剥去种皮和胚
乳的完整胚。取材时刀刃要锋利 ,严禁挤压以免损伤材
料 [ 8] 。因种子胚与胚乳一起固定时渗透慢 ,固定效果较差 ,
所以应选择去掉胚乳的材料进行固定。
良好的固定剂穿透力较强 ,并可使细胞立刻致死 ,原生
质全部凝固 ,不发生任何变形。 FAA固定液具有固定兼保存
的效果;卡诺固定液为快速固定液。对这 2种固定液进行对
比试验 ,发现切片效果相当 ,但卡诺固定液固定时间较长时
会使材料变硬变脆 ,而 FAA的固定时间不受限制 ,野外工作
非常便利 ,且固定的材料不妨碍染色。固定过程中要注意材
料在固定液中的位置 ,并随时翻动材料 ,使其充分固定 [ 9] 。
大叶藻与陆地植物不同 ,其细胞渗透压较高 ,需要的固
定和脱水时间较长。固定时间一般在 24h以上 ,期间还需多
次更换固定液 。其每一浓度梯度的脱水时间控制在 2 h左
右 。低浓度脱水要充分 ,高浓度乙醇和无水乙醇中可采取多
次更换脱水乙醇的方法减少在高浓度乙醇中的脱水时间 ,以
防止组织变脆影响切片效果。脱水如需过夜 ,应将材料保存
在 70%乙醇中。
透明是石蜡切片中应用透明剂如二甲苯置换无水乙醇
的过程。透明剂穿透力强 ,易使组织变脆 ,因此 ,透明时间不
宜过长 ,一般 10 min即可 ,实际透明时间以观察到组织透明
为准。
浸蜡是使石蜡渗入到组织内部置换出二甲苯的过程 。
在组织浸蜡前必须更换新蜡 ,保证蜡内二甲苯含量最少 [ 10] 。
浸蜡过程中要更换石蜡 2 ～ 3次再进行埋蜡 ,每次 30 min。
若浸蜡不彻底 ,石蜡就无法渗入组织 ,包埋好的蜡块与空气接
触后会因水分蒸发而凹陷 ,或组织与蜡分离 [ 11] 。若石蜡中含
有二甲苯 ,则会出现白色结晶区 ,易粉碎 ,不易修蜡 、切片。
该研究发现切片在 40 ℃恒温水浴锅中展片比在灯箱上
展片效果更好 ,因为水浴温度比较均匀且容易控制。粘片时
涂梅氏蛋白液量要适中 ,量多则影响切片效果 ,量少则容易
脱落。
苏木精染色剂要提前配制 ,染色时间要根据染色液的新
旧程度适当调整 ,必要时在染色过程中用显微镜观察。染色
后必须将切片中的水分脱净 ,透明使之产生一定的折光率 ,
便于镜下观察。
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