全 文 ：＊通讯作者
收稿日期:2010-11-09;修回日期:2011-01-05
基金项目:国家草品种区域试验项目 “草品种抗旱性鉴定”
(2010);国家科技支撑计划课题(2011BAD17B01);中央级公益性科
研院所基本科研业务费专项资金(中国农业科学院草原研究所)资助
作者简介:张凤霞(1982-),女 ,内蒙古呼和浩特市人, 在读硕士
生 ,研究方向为植物生态学.
文章编号:1673-5021(2011)02-0025-06
12个无芒雀麦种群遗传多样性的 RAPD分析
张凤霞1 ,王铁娟1 ,王照兰2 , ＊ ,杜建材2 ,田青松2 ,吴新宏2
(1.内蒙古师范大学生命科学与技术学院 ,内蒙古　呼和浩特　 010022;
2.中国农业科学院草原研究所/农业部草原资源与生态重点开放实验室 ,内蒙古　呼和浩特　010010)
　　摘要:用 RAPD分子标记对 12 个无芒雀麦种群进行遗传多样性分析 ,结果表明:选用的 9 条多态性引物共扩
增出 87 个条带 ,平均每个引物扩增 9.67 条 , 其中多态性条带 45 个 , 多态性条带百分率为 51.72%。无芒雀麦物
种水平上的多态性条带数为 76 个 , 多态性条带百分率为 87.36%, Shannon 信息指数为 0.2933 , Nei s 基因多样性
指数为 0.1843。 种群间遗传分化系数为 0.2735 , 说明无芒雀麦的遗传分化主要发生在种群内。聚类结果显示 ,
部分种群间的遗传距离与地理距离有一定的相关性 , 但也有例外 , 这可能与人类的广泛栽培加大了种群间的基因
交流有关 。
关键词:无芒雀麦;种群;RAPD;遗传多样性
中图分类号:S543　　　文献标识码:A
　　无芒雀麦(Bromus inermis Ley ss.)属禾本科雀
麦属 ,是世界上分布较广 、被人类广泛利用的多年生
优良牧草 。无芒雀麦具短横走根状茎 ,秆直立 ,叶鞘
通常无毛 ,近鞘口处开展 ,叶片扁平通常无毛 ,圆锥
花絮开展 ,体细胞染色体为四倍体 、六倍体或八倍
体 ,即 2n=28 、42 、56[ 1 ～ 2] 。原产于欧洲 ,其野生类
型广布于亚洲和北美洲的温带地区[ 3 ～ 4] 。我国南北
各地都有种植 ,以华北 、西北 、东北 、内蒙古等地为
多 ,是草地补播和建植人工草地的理想草种[ 5] 。无
芒雀麦具有很强的耐寒性 ,可作为草皮材料和干草
饲料[ 6] 。由于无芒雀麦在草地植被恢复 、生态建设
等方面具有重要作用 ,因此国内外对该植物的研究
报道较多 。但是 ,目前的研究主要集中在种群数量
结构 、生物量结构[ 7] 、生理生化变化[ 8] 以及栽培技
术[ 9]等方面 ,有关无芒雀麦遗传多样性的研究报道
较少 。国内仅见蔡丽艳 、石凤翎[ 10] 等以缘毛雀麦基
因组 DNA 为模板 ,对 ISS R反应体系中的一些重要
参数进行探索和优化试验 ,初步建立了一套雀麦属
牧草 ISSR分析的优化反应体系;田青松 、韩冰等[ 11]
对 96份雀麦属材料遗传多样性进行 ISS R分析 ,结
果表明种内分子变异较大 ,种内遗传多样性高于种
间遗传多样性。相对于形态学 、生理学 、等位酶电泳
技术而言 ,分子标记技术可直接显示 DNA 序列的
差异 ,避免了根据表型性状来推断基因型的误差等
问题 ,是分析无芒雀麦种群遗传结构 、基因多样性和
栽培植物种质资源最为直接和有效的手段[ 12] 。常
见的分子标记方法有 RAPD 、AFLP 、SSR 、ISS R等 ,
其中 RAPD(随机扩增多态 DNA)技术是一项建立
在聚合酶链式反应基础上的 DNA 分子标记技术 ,
其优点是快速高效 、简单方便 、成本低 、信息量大。
该技术目前已被广泛应用于种内遗传多样性的监
测[ 13 ～ 14] ,探讨种间或属间遗传关系[ 15 ～ 16] ,构建遗传
图谱[ 17] 以及基因定位与分离[ 18 ～ 19] 等方面。本研究
采用 RAPD技术对 12个无芒雀麦种群的遗传多样
性进行分析 ,以期为无芒雀麦新品种培育和种质资
源开发利用提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　试验材料
12个无芒雀麦材料来源见表 1。所有供试材料
由中国农业科学院草原研究所提供。室内种植各种
群的种子 ,成苗后从每个种群中随机选取 12 个单
株 ,分别采集嫩叶单株提取 DNA 。
1.2　试验方法
采用改进的 CTAB 法[ 20] 分单株提取基因组
DNA , 以 1kb Ladder DNA M arker 做标准 , 用
0.8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量和浓度 ,用无
—25—
第 33 卷　第 2 期　　　　　　　　　　中　国　草　地　学　报　　　　　　　　　　2011 年 3 月
　　Vo l.33　No.2　　　　　　　　　　Chinese Journal o f Grassland 　　　　　　　　　 Mar.2011　　
表 1　无芒雀麦种群代号与来源
Table 1　Population codes and origin of Bromus inermis Leyss
编号
Code
种群代号
Populat ion codes
来源
Origin
编号
Code
种群代号
Popu lat ion codes
来源
Origin
1 JS 江苏 7 QSL 前苏联
2 B L 波兰 8 XJ3 新疆
3 XJ1 新疆 9 JND 加拿大
4 XLGL 锡林郭勒 10 GS 甘肃
5 MG 美国 11 JL 吉林省长春市
6 XJ2 新疆 12 H LJ 黑龙江海林市
菌水将 DNA 稀释至 10 ～ 15ng/μL , -20℃保存备
用。
1.3　PCR扩增及检测
RAPD引物是由北京华大基因公司合成的 ,从
合成的 30条引物中筛选出多态性丰富的 9条引物 ,
对无芒雀麦的 12个种群进行扩增 。反应在 PE9600
PCR仪上进行 ,反应体系 25μl ,其中 DNA 模板 2μl
(20 ～ 30ng)、2 × Taq PCR MasterM ix 13.5μl
(Taq DNA聚合酶 0.05U/μL , MgCl2 4mmol/ L ,
dN TP 0.4mmol/L)、引物 3μl(10μmol/L)、ddH 2O
6.5μl补至 25μl。PCR扩增反应程序:94℃预变性
3min;然后 94℃变性 30s , 30℃退火 30s , 72℃延伸
1min ,共 40个循环;最后 72℃延伸 10min , 4℃保存
备用。PCR扩增产物于 1.3%的琼脂糖凝胶中电泳
检测 ,用 100bp DNA Ladder 作为对照。电极缓冲
液为 1×TAE ,在 100V 的电压下电泳 1h。电泳结
束后用凝胶成像仪在紫外灯下观察照相。
1.4　数据统计与分析
以电泳图谱中的每一条带作为一个分子标记位
点 ,将清晰可见的强带或反复出现的弱带记为“1” ,
无带记为“0” ,若某一样本没扩增出任何条带按缺失
处理 ,记为“.” ,形成 0/1二元矩阵 。
运用 Popgen32分析软件进行遗传参数分析:
(1)多态性条带数及条带百分率(PPB);(2)Nei s
基因多样性指数(H)和 Shannon 信息指数(I＊);
(3)总的基因多样性(Ht)、种群内基因多样性(Hs)
和种群间遗传分化系数(Gst);(4)各种群遗传一致
度(I)和遗传距离(D),根据遗传距离用 U PGMA 法
获得种群聚类分析树状图。
2　结果与分析
2.1　RAPD引物多态性分析
用 9个 RAPD 引物对无芒雀麦 12 个种群的
144个个体进行 PCR扩增 ,总扩增带数 87条 ,平均
每个引物扩增出 9.67个。其中多态性条带 45 个 ,
占总条带数的 51.72%,平均每个引物产生 5 个多
态性条带(表 2)。引物 S22扩增结果见图 1。
表 2　RAPD 引物序列及其扩增结果
Table 2　Squence of the RAPD primers and the amplif ied results
引物
编号
Primer
No.
序列
Sequen ce
(5′※3′)
扩增
带数
Band
num ber
多态性
带数
No.of
polymorphic
bands
多态性条
带百分率(%)
Percentage of
polymorphic
ban ds(%)
总基因
多样性
T otal gene
diversi ty
种群内基
因多样性
Within-populat ions
gene diversity
种群间遗传
分化系数
Genetic
dif feren tiation
among population s
S 02 TGATCCCTGG 11 8 72.73 0.2597 0.1883 0.2750
S22 TGCCGAGCTG 7 4 57.14 0.2703 0.1727 0.3611
S46 ACCTGAACGG 6 5 83.33 0.2805 0.1504 0.4640
S50 GGT CTACACC 5 2 40.00 0.0886 0.0588 0.3361
S52 CACCG TACGA 11 1 9.09 0.0976 0.0870 0.1085
S99 GTCAGGGCA A 7 3 42.86 0.2566 0.1952 0.2390
S156 GG TGACTGT G 3 0 0.00 0.0163 0.0159 0.0283
S442 ACGT AGCG TC 14 9 64.29 0.1258 0.0989 0.2138
S489 GGCTAACCGA 23 13 56.52 0.1952 0.1489 0.2374
总和 87 45 51.72 0.1844 0.1340 0.2735
平均 9.67 5
—26—
中国草地学报　2011年　第 33 卷　第 2 期
图 1　RAPD 引物 S22 对 MG 种群和 XJ2 种群的扩增结果
F ig.1　DNA f ragments amplified by the RAPD pr imer S22 on population MG and XJ2
2.2　无芒雀麦种群遗传多样性的 RAPD分析
由表 3可知 ,9条引物在 12个种群中检测出的
多态性条带数在 30 ～ 46 条之间 ,平均每个种群为
39.33;各种群的多态性条带百分率在 34.48%～
52.87%之间 ,平均每个种群为 45.21%,其顺序为
HLJ>JS=QSL >MG >XJ2=XJ3=GS >JND >
XJ1>BL>JL>XLG L。物种水平上的多态性条带
数为 76 ,多态性条带百分率为 87.36%。
Nei s基因多样性指数(H)和 S hannon信息指
数(I＊)是衡量物种多样性最常用的指标[ 21] 。由表
3 可知 , 各种群的 Shannon 信息指数(I＊)介于
0.2559 ～ 0.1464之间 ,其平均值为 0.2056 ,顺序是
H LJ>MG>JS>GS>XJ2>QSL>XJ1>BL >XJ3
>JND>JL>XLG L;各种群的 Nei s基因多样性
指数(H)介于 0.1680 ～ 0.0920 之间 , 平均值为
0.1340 ,顺序是 H LJ>MG >JS>GS >XJ2>QSL
>XJ1>BL >JL >XJ3>JND>XLG L。由此可以
看出 ,各种群的 Nei s基因多样性指数(H)大小排
序和 S hannon信息指数(I＊)大小排序结果基本一
致。三种指标均显示 ,种群 HLJ的遗传多样性最
高 ,种群 XLG L 最低 。物种水平上的 Nei s基因多
样性指数(H)为 0.1843 ,Shannon 信息指数(I＊)是
0.2933。
表 3　无芒雀麦种群遗传多样性的 RAPD分析
Table 3　RAPD genetic diversity analysis of Bromus inermis Leyss.
种群代号
Population code
样本数
Number of
samples
多态性条带数
No.of
polymorphic
bands
多态性条带百分率(%)
Percentage of
polymorphic bands(%)
Shannon信息指数
Shannon s index
Nei s 基因多样性
指数
Nei s genetic
diversity
JS 12 45 51.72 0.2360 0.1539
B L 12 35 40.23 0.1944 0.1294
XJ1 12 37 42.53 0.1991 0.1304
XLGL 12 30 34.48 0.1464 0.0920
MG 12 42 48.28 0.2398 0.1591
XJ2 12 41 47.13 0.2126 0.1384
QSL 12 45 51.72 0.2061 0.1312
XJ3 12 41 47.13 0.1888 0.1200
JND 12 38 43.68 0.1835 0.1172
GS 12 41 47.13 0.2237 0.1466
JL 12 31 35.63 0.1809 0.1212
H LJ 12 46 52.87 0.2559 0.1680
物种水平 144 76 87.36 0.2933 0.1843
—27—
张凤霞　王铁娟　王照兰　杜建材　田青松　吴新宏　　　12 个无芒雀麦种群遗传多样性的 RAPD 分析
2.3　无芒雀麦种群间的遗传分化
种群间的遗传分化结果显示(表 2),供试 12 个
无芒雀麦种群总的基因多样性(Ht)为 0.1844 ,种群
内基因多样性(Hs)为 0.1340 ,种群间遗传分化系数
(Gst)为 0.2735 , 即种群间的 遗传变异只 占
27.35%,说明供试 12个无芒雀麦种群的大部分遗
传变异都发生在种群内部 。
2.4　无芒雀麦种群间的遗传距离和聚类分析
种群间的遗传一致度(I)和遗传距离(D)的
RAPD分析结果显示:XJ1和 XLG L 种群即新疆种
群和锡林郭勒种群的遗传一致度最大 ,为 0.9824 ,
遗传距离最小 ,为 0.0178。BL 和 HLJ种群即波兰
种群和黑龙江海林市种群的遗传一致度最小 , 为
0.8938 ,遗传距离最大 ,为 0.1122。12 个无芒雀麦
种群的平均遗传一致度为 0.9430 ,平均遗传距离为
0.0589。对 12个无芒雀麦种群根据遗传距离进行
聚类分析 ,在遗传距离 0.06 处可分为 4个类群(图
2)。第Ⅰ类群包括 8 个种群:即种群 JS 、GS 、XJ1 、
XLG L 、XJ2 、JND 、QSL 和 XJ3;此类群内 ,在遗传距
离 0.045处又可把它们分成 3个亚类 ,即中国亚类 ,
包括 JS 、GS 、XJ1 、XLGL 和 XJ2;加拿大亚类 ,只包
括 JND;前苏联亚类 ,包括 QSL 和 XJ3两个种群 。
第Ⅱ类群只包括来自美国的一个种群 MG;第 Ⅲ类
　　图 2　无芒雀麦种群间的 RAPD 聚类
Fig.2　RAPD dendrog ram of UPGMA of Bromus inermis Leyss.
群包括来自吉林的 JL 和来自黑龙江的 HLJ两个种
群;第Ⅳ类群只包括来自波兰的一个种群 BL。从种
群间的 RA PD聚类结果看 ,有些地理距离相对较近
的类群首先聚类 ,如吉林省长春市的 JL 种群和黑
龙江海林市的 HLJ种群聚在第 Ⅲ类群;来自新疆的
3个种群均在第 Ⅰ类群聚类 。但也有例外 ,如来自
于加拿大的 JND种群和美国的 MG 种群并没有聚
到一起。
3　结论与讨论
3.1　无芒雀麦的遗传多样性
利用 RAPD分子标记对无芒雀麦 12个种群进
行了分析 , 其多态性条带百分率介于 34.48%和
52.87%之间 ,平均每个种群为 45.21%。从物种水
平来看多态性条带百分率为 87.36%,表明无芒雀
麦的遗传多样性处于丰富的水平。物种水平的
Shannon信息指数(I＊)为 0.2933 ,各种群的平均值
为 0.2056;Nei s基因多样性指数(H)为 0.1843 ,各
种群的平均值为 0.1340。三个指标均显示 ,来自黑
龙江海林市的 HLJ种群具有较丰富的遗传多样性 ,
而来自锡林郭勒盟的 XLGL 种群遗传多样性最低。
由于 Nei s指数估算等位基因频率时忽略了杂合基
因 ,所以其种群内和物种总的基因多样性估算值要
低于 S hannon信息指数[ 10] 。今后的研究可以结合
其它分子标记的方法相互对比 ,互相补充 ,以求更加
科学的探讨无芒雀麦的遗传多样性。
3.2　无芒雀麦的遗传分化
Wright认为 ,遗传分化系数介于 0 ～ 0.05之间
表示居群间的分化很弱 ,0.05 ～ 0.15之间表示中等
分化 ,0.15 ～ 0.25之间表示分化大 ,大于 0.25表明
分化极大[ 22] 。本研究 12个无芒雀麦种群间的遗传
分化系数(G st)为 0.2735 ,表明供试种群间在遗传
上高度分化 。Harmrick认为异交传粉植物的遗传
分化系数平均为 0.20 , 而自交物种为 0.51[ 23] 。
Bussell用 RAPD方法分析 35种植物的遗传分化系
数 ,发现 29 个异交物种的平均遗传分化系数为
0.1930 ,另外 6个自交物种为 0.6250[ 24] 。本研究无
芒雀麦的遗传分化系数为 0.2735 ,表明无芒雀麦为
异交物种 ,其遗传变异主要发生在种群内部。田青
松 、韩冰[ 11] 等人对 96 份雀麦属材料遗传多样性的
ISSR分析表明 ,其遗传变异主要存在于种内 ,至于
存在于种内的种群内还是种群间未进行探讨。本研
究与前人的研究结果相一致 ,同时又是对雀麦遗传
—28—
中国草地学报　2011年　第 33 卷　第 2 期
多样性的进一步深入研究 。
3.3　聚类分析
对 12个无芒雀麦种群根据遗传距离进行聚类
分析 ,在遗传距离 0.06处可把 12个无芒雀麦种群
分为 4个类群:第Ⅰ类群包括 8个种群 ,来自新疆的
3个种群均分布于此。第Ⅱ类群只包括来自美国的
一个种群 MG;第Ⅲ类群包括来自吉林的 JL 和来自
黑龙江的 H LJ两个种群;第Ⅳ类群只包括来自波兰
的一个种群 BL 。从种群间的 RAPD聚类结果看 ,
有些地理距离相对较近的类群首先聚类 。如吉林省
长春市的 JL 和黑龙江海林市的 HLJ 聚在第 Ⅲ类
群;来自新疆的 3 个种群均在第 Ⅰ类群聚类 。但也
有例外 ,如来自北美洲加拿大的 JND种群和美国的
MG种群并没有聚到一起 。
无芒雀麦作为优良的牧草和人工草地的重要草
种 ,在世界及全国各地被广泛引种栽培。据记载 ,
1991年黑龙江齐齐哈尔市草原监理站引进加拿大
无芒雀麦 ,在查罕诺草籽场进行了 4年栽培 ,已获成
功[ 25] 。2003年 11月我国的“948”项目引进了美国
的无芒雀麦 ,次年种植于内蒙古巴彦淖尔市林业科
学研究所苗圃地 ,引种获得成功[ 26] 。由于人类的利
用使不同地区 ,甚至使不同大洲的种群得以交流 ,伴
随着这样的种群交流和基因渗入杂交 ,使得种群间
关系变得复杂化 。
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Genetic Diversity Analysis of 12 Bromus inermis
Leyss Populations Based on RAPD Markers
ZHANG Feng-xia1 ,WANG Tie-juan1 ,WANG Zhao-lan2 ,DU Jian-cai2 , TIAN Qing-song 2 ,WU Xin-hong2
(1.Science and Technology Col lege , I nner Mongolia Normal Univ ersity , Hohhot 010022 , China;
2.Grassland Research Insti tute , Chinese Academy of A gricul tural Science/K ey Laboratory o f
Grassland Resources &Ecology , Ministry of A gricul ture , Hohhot 010010 ,China)
Abstract:Random amplif ied polymo rphic DNA(RAPD)techniques w ere used to detect the genetic di-
ve rsity of 12 Bromus inermis Ley ss populat ions.A to tal of 87 bands w ere amplified wi th 9 RAPD primers ,
of w hich 45 we re po lymo rphic bands.The average percentag e of polymo rphic bands w ere 51.72%.76
were polymo rphic(PPB=87.36%)in species level.T he resul ts of Popgen32 analy sis indicated tha t Nei s
gene diversity (H)was 0.1843 , Shannon info rmation index (I＊)was 0.2933.Gene dif ference index(Gst)
among populations w as 0.2735 , which means the percentage of gene dif fe rence among populations w as on-
ly 27.35%.The resul ts show ed that the genet ic v ariat ion wi thin population w as higher than among popu-
lations.The cluster analysis show ed tha t gene tic distance w as related to geog raphic distance only on part ial
populations , human s w ide cultiv ation maybe bro aden the gene f low s among populations.
Key words:B romus inermis Ley ss;Population;RAPD;Genetic diversi ty
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中国草地学报　2011年　第 33 卷　第 2 期