全 文 ：分子植物育种，2016年，第 14卷，第 11期，第 3002-3010页
Molecular Plant Breeding, 2016, Vol.14, No.11, 3002-3010
研究报告
Research Report
三色堇酪氨酸脱羧酶基因的克隆及其生物信息学分析
杨文汉 曾媛 李霆格 赵安瑾 王健 *
海南大学园艺园林学院,热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室,海口, 570228
*通讯作者, wjhnau@163.com
摘 要 本研究以三色堇(Viola×wittrockianaGam)为研究材料，采用 RT-PCR和 RACE等方法克隆可能与其
花色形成相关的酪氨酸脱羧酶基因(Tyrosine decarboxylase)，并对基因全长进行氨基酸序列的生物信息学分
析。结果从三色堇中分离克隆出 cDNA全长为 1 634 bp的 TYDC1和 1 575 bp的 TYDC2两个同源基因，包
含相同的且长度为 1 485 bp，编码 494个氨基酸的开放阅读框；氨基酸多重序列比对和聚类分析结果表明:
三色堇中的 TYDC基因编码氨基酸和其他植物相关基因的一致性可达到 82.43%，且与麻疯树的亲缘关系较
近，达到 73%；对 TYDC蛋白的结构进行预测发现，TYDC蛋白是一种亲水性的不稳定蛋白，也是一种存在
跨膜区域且不存在信号肽的非分泌蛋白；通过亚细胞定位预测分析表明该蛋白主要在细胞核和细胞质中表
达。本研究为揭示三色堇 TYDC蛋白的结构功能务实了基础，为进一步研究和验证该基因在三色堇中的表
达提供理论依据。
关键词 三色堇酪氨酸脱羧酶(TYDC),基因克隆,生物信息学
Cloning and Bioinformatics Analysis of TYDC Gene in Pansy (Viola×wittro-
ckiana Gams)
Yang Wenhan Zeng Yuan Li Tingge Zhao Anjin Wang Jian *
Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources, College of Horticulture & Landscape Architec-ture,
Hainan University, Haikou, 570228
* Corresponding author, wjhnau@163.com
DOI: 10.13271/j.mpb.014.003002
Abstract In this study, pansy(Viola×wittrockiana)wasused as researchmaterial to cloning the tyrosine decarboxylase
(TYDC) gene, which may relate to the formation of flower color and variegation, by the methods of RT-PCR and
RACE. The bioinformatics analysis of amino acid sequences were conducted for the full-length of TYDC. The results
of the segregation and cloning indicated that the cDNA full-length nucleotides of TYDC1 was 1 634 bp and 1 575 bp
of TYDC2, and ORF Finder revealed that the two homologous genes contained the same open read frame, the
length of which was 1 485 bp, encoding 494 amino acids. The multiple comparisons and cluster analysis of amino
acid sequences turned out that the amino acids encoded by TYDC of pansy had 82.43% consistency compared to the
same gene of other plants, and the genetic relationship was close to Jatropha curcas, that could reach 73% . The
structure prediction of TYDC protein found that it was a kind of hydrophilic and unstable protein, also was the non
secreted protein of transmembrane region, and had no signal peptide. By means of the prediction analysis for
subcellular localization showed that the protein was mainly expressed in the nucleus and cytoplasm. This study may
take a solid help for revealing the structure and function of TYDC protein in pansy, and provided theoretical basis for
the following research and validation about the expression of the gene in pansy.
Keywords Pansy (Viola×wittrikianan), Tyrosine decarboxylase (TYDC), Gene cloning, Bioinformatics analysis
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(31060265; 31260488)和海南大学中西部计划学科建设项目(ZXBJH-XK008)共
同资助
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
三色堇(Viola×wittrockiana)为堇菜科(Violaceae)
堇菜属(Viola.)的长日照草本花卉，其花色绚丽丰富，
单朵花有纯色花和复色花两类，复色花往往有花斑，
因其色斑区域颇大，色斑与非色斑区域分界鲜明，花
色和花斑的颜色组成纯正，花斑遗传稳定，所以是研
究花色花斑形成机理的理想材料。在课题组关于三
色堇 RNA转录组测序的分析中，我们发现在植物次
生代谢的酪氨酸代谢途径中有一种关键性酶基因—
TYDC，在三色堇花瓣的色斑和非色斑区域的表达量
有着极大的差异(数据未发表)，暗示 TYDC基因有可
能是导致三色堇花斑形成的一个潜在的候选基因，
这使得 TYDC基因成为三色堇花色分子机理研究的
一个新的出发点。
TYDC是一种 5-磷酸吡哆醛(PLP)依赖型脱羧
酶(Coton et al., 2011)，是氨基酸脱羧酶(AADCs)中的
一种关键酶，在酪氨酸代谢途径中的发挥重要的作
用，同时也是连接植物初生代谢与生物碱类类物质
代谢之间的初始酶，决定了整个代谢途径的走向。
TYDC以 L-酪氨酸为底物，催化其脱羧形成酪胺，
酪胺对生物碱的合成有促进作用(王鹏等, 2014)。目
前关于酪氨酸脱羧酶的研究主要集中于该酶的酶学
性质、作用机理及该酶的提纯，在生理学和基因工程
方面，TYDC基因能够催化产生酪胺，增强植物的防
御系统，从而提升抵抗病原体的能力，马铃薯(Solanum
tuberosum L.)中催化产物酪胺不仅是有性生殖的限
制因子，也能抑制真菌菌丝的生长(Negrel and Javelle,
2001)，而 TYDC作为防御基因的表现更为明显，参与
羟基苯丙烯酸酰胺的生物合成在细胞壁中累积，增
强植物的抗病性，如把欧芹(Petroselinum crispum Hill)
的 TYDC借由农杆菌介导入马铃薯中，催化酪氨酸
代谢，使细胞壁中的酪胺成分显著增加，马铃薯的抗
病性也明显提高(Landtaga et al., 2002)。在 TYDC基
因的特异性表达方面，柑橘属(Citurs)中 TYDC基因
可能是辛弗林(Synephrine)合成的决定因子，而辛弗
林是一种减少血中胆固醇的活性物质，高浓度的辛
弗林中 TYDC基因的表达量也高(Glenn et al., 2010)；
蔷薇红景天中 TYDC基因在根和叶中存在着一定的
组织表达差异性，而红景天苷在根中的含量远大于
叶，与 TYDC的表达量成正比，其中 TYDC表达量高
的植株，红景天苷含量也高(Zsuzsanna et al., 2009)。
在大花红景天和高山红景天中(彭静叶, 2011)，通过
对重组 TYDC蛋白进行功能验证，也表明 TYDC基
因的表达可能提高红景天苷在植物中的含量，这些
表明 TYDC基因在不同植物中的表达都可能产生不
同的作用。
目前拟南芥(Trezzini et al., 1993)、罂粟(Facchini
et al., 1999)、马兜铃(杨瑞仪和曾庆平, 2005)等植物
中的 TYDC基因已经被克隆，然而三色堇的 TYDC
基因至今尚未克隆。我们利用转录组测序得到的
TYDC保守片段设计其特异性引物，采用反转录聚合
酶链反应(RT-PCR)和 cDNA末端快速扩增(RACE)
法从三色堇中扩增出 TYDC全长然后进行该基因和
编码蛋白的信息学分析，从而为下一步 TYDC基因
转化模式植物的表达，以及三色堇花色机理的研究，
乃至三色堇的基因工程改造提供了帮助。
1结果与分析
1.1三色堇总 RNA的提取
通过改良后的 Trizol法(李琴等, 2013)对三色堇
花瓣的总 RNA进行提取，然后使用琼脂糖凝胶电泳
检测结果(图 1)，可知编号 1、2、3所示条带整齐清晰，
28S与 18S条带亮度比接近 2:1，RNA整体完整性好，
适用于后续 RACE等试验。
图 1三色堇花瓣总 RNA电泳
注: 1~3:总 RNA
Figure 1 Electrophoretogram for total RNA of petals in pansy
Note: 1~3: Total RNA
1.2三色堇花瓣中 TYDC基因 cDNA的全长克隆
通过转录组测序的数据得到了 TYDC基因的保
守区域片段 1 497 bp，然后利用 RACE技术，设计特
异性 RACE引物，扩增得到 5末端序列 219 bp (图2)，
3末端序列扩增出 397 bp和 338 bp 两个同源片段
(图 3)，最后利用 DNAMAN软件将保守区域，扩增
的 3末端和 5末端序列进行拼接，获得 TYDC1的
cDNA 全长序列 1 634 bp，TYDC2 的 cDNA 全长序
列 1 575 bp。
1.3三色堇花瓣中 TYDC基因的生物信息学分析
1.3.1 TYDC基因核酸序列分析
TYDC基因通过克隆得到一对同源基因，其中
TYDC1全长 1 634 bp，TYDC2全长 1 575 bp，开放阅
读框长度均为 1 485 bp (56~1540)，编码 494个氨基
3003
酸。两个基因在 3末端相差 59 bp，其中 5端有长度为
55 bp的非编码区；TYDC1的 3端有长度为 94 bp 的
非编码区，TYDC2的 3端有 35 bp的非编码区，并包
含了 11 bp的 poly (A)尾巴(图 4)。通过NCBI软件比
对，可以确定为目的基因，进一步进行同源性分析发
现，三色堇中 TYDC基因的核苷酸序列与葡萄(Vitis
vinifera)中该基因的相似性达到 72%，与粳稻(Oryza
sativa subsp.)中相关基因的相似性达到 86%。
1.3.2 TYDC基因氨基酸序列分析
利用 DNAMAN分析软件将三色堇与其他 5种
近缘植物的 TYDC基因所编码的氨基酸序列进行比
对分析(图 5)，结果表明这些植物的 TYDC氨基酸序
列与三色堇的一致性达到了 82.43%，其中与胡杨
(Populus euphratica)、毛果杨(Populus trichocarpa)、麻疯
树(Jatropha curcas)的一致性达到 73%，与葡萄(Vitis
vinifera)的一致性达到 70%，与可可(Theobroma cacao)
的一致性达到 69%，从多重比对的结果来看，保守区
域主要集中在中间的催化区域，两端的非催化区域
变异性较大。
1.3.3 TYDC基因编码的氨基酸序列理化性质分析
利用 ExPASy在线分析工具，可以得知，预测分
子式为 C2446 H3814N648 O726 S27等电点为 5.56，显酸性。
图 2 TYDC基因 3RACE电泳
注: M: DL2000marker; 1~2: TYDC1 3 RACE片段; 3~4: TYDC2,
3 RACE片段
Figure 2 Electrophoretogram for 3 RACE of TYDC gene
Note: M: DL2000 marker; 1~2: TYDC1, 3RACE fragment; 3~4:
TYDC2, 3RACE fragment
图 3 TYDC基因 5 RACE电泳
注: M: DL2000 marker; 1~2: TYDC 5 RACE片段
Figure 3 Electrophoretogram for 5 RACE of TYDC gene
Note: M: DL2000 marker; 1~2: TYDC 5 RACE fragment
图 4 TYDC基因全长核苷酸序列及推测的氨基端序列
注:阴影:开放阅读框,划线: TYDC1和 TYDC2基因在 3末端
相差的 59 bp
Figure 4 cDNA full-length sequence and putative amino acid se-
quence of TYDC gene
Note: Shade regions: Open read frame, Underlined portions: 59 bp
difference between the TYDC1 and TYDC2 in the end of 3 race
三色堇酪氨酸脱羧酶基因的克隆及其生物信息学分析
Cloning and Bioinformatics Analysis of TYDC Gene in Pansy (Viola×wittrikianan Gams)
3004
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 5三色堇 TYDC蛋白和其他植物相关同源序列的多重比对
注: A:三色堇; B:胡杨; C:葡萄; D:毛果杨; E:可可; F:麻疯树
Figure 5 The multiple comparison of TYDC in pansy (Viola×wittrockiana) and the sequence of its orthologs
Note: A: Viola×wittrockiana; B: Populus euphratica; C: Vitis vinifera; D: Populus trichocarpa; E:Theobroma cacao; F:Jatropha curcas
序列中 Leu(L)、Ser(S)含量最高分别为 10.7%、9.7%，不
含 Pyl(O)、Sec5(U)。带正电荷的氨基酸(Arg+Lys)共
49个，带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)共 60个，整个序
列显阴性(表 1)。蛋白分子量 54 780.7 kD，总平均疏水
系数(grand average of hydropathicity, GR-AVY)为
-0.048，通常GRAVY值在±2之间，若为正值则为疏
3005
表 1 TYDC氨基酸残基的组成个数及比例
Table 1 Composition number and proportion of TYDC amino
acid residues
名称
Name
Ala (A)
Arg (R)
Asn (N)
Asp (D)
Cys (C)
Gln (Q)
Glu (E)
Gly (G)
His (H)
Ile (I)
个数
Number
32
24
16
29
16
10
31
37
11
29
比例(%)
Proportion (%)
6.5
4.9
3.2
5.9
3.2
2.0
6.3
7.5
2.2
5.9
名称
Name
Leu (L)
Lys (K)
Met (M)
Phe (F)
Pro (P)
Ser (S)
Thr (T)
Trp (W)
Tyr (Y)
Val (V)
个数
Number
53
25
11
25
21
48
24
9
13
30
比例(%)
Proportion (%)
10.7
5.1
2.2
5.1
4.3
9.7
4.9
1.8
2.6
6.1
图 6 TYDC蛋白亲水性/疏水性预测
Figure 6 Prediction of hydrophilicity/hydrophobicity of TYDC
protein
图 7 TYDC蛋白的跨膜分析
Figure 7 Transmembrane analysis of TYDC protein
图 8 TYDC蛋白的二级结构预测
注:蓝色:α-螺旋;红色:延伸链;绿色:β-转角;紫色:无规则卷曲
Figure 8 Protein secondary structure of TYDC
Note: Blue: α-helix; Red: Extended strand; Green:β-turn; Pur-
ple: Coil respectively
水性蛋白，若为负值则为亲水性蛋白(徐庆华和胡宝
忠, 2011)，故预测 TYDC蛋白为亲水性蛋白，脂溶系数
为 88.83，不稳定系数为 44.16，一般小于 40为稳定蛋
白，故 TYDC蛋白可能是一种不稳定蛋白。
1.3.4 TYDC基因编码蛋白质一级结构分析
采用 Expasy Protscale程序详细剖析此编码蛋白
的疏水/亲水性，发现氨基酸残基中分别在 A164位点
疏水性最强(2.656)，A344位点亲水性最强(-2.400)，
亲水氨基酸的数量远多于疏水氨基酸，推断其为亲
水性蛋白，该蛋白在 440~480区域存在明显的疏水区
域(图 6)，所以推测可能在此区域内存在跨膜结构。
利用 TMHMM Server在线程序分析 TYDC基因
的蛋白质跨膜结构，发现编码蛋白在 450~466位氨
基酸间有跨膜区域，跨膜方向由外向内，为 N端跨
膜结构，肽链 C 端维持在细胞质基质(图 7)，这与
PSORTⅡ软件预测的蛋白质跨膜区域基本接近。
利用 SignalP 4.1 Server在线程序对 TYDC基因
的蛋白质信号肽进行预测解析，其中 mean-s的值为
0.096，小于 0.5，所以编码蛋白质没有信号肽存在，根
据核糖体通过信号肽的作用而附着到内质网从而合
成分泌蛋白这一信号肽假说(Walter and Blobel, 1980)
可以推测此蛋白是非分泌蛋白。
1.3.5 TYDC基因蛋白质二级结构分析预测
通过利用 SOPMA和CFSSP在线软件预测TYDC
蛋白的二级结构(图 8)，发现它的二级结构由 217个
α-螺旋(43.93%)，89个延伸链(18.02%)，56个 β-转
角(11.34%)，132个无规则卷曲(26.72%)，其中 α-螺
旋作为二级结构原件含量丰富。
1.3.6 TYDC基因蛋白质亚细胞定位预测
利用 Green Script中的 PSORTⅡ和WoLF PSO-
RTⅡ两个程序软件对 TYDC蛋白的亚细胞定位进
行初步预测(表 2)，结果发现 TYDC蛋白主要在细胞
核和细胞质中分布并发挥生物学作用。
1.3.7 TYDC编码氨基酸序列聚类分析
利用MEGA5.02软件对三色堇的 TYDC基因所
编码的氨基酸序列与其他植物的相关基因进行聚类
分析，构建系统发育树(Torktaz et al., 2016)。分析结
果发现，三色堇中的 TYDC基因与麻疯树(Jatropha
curcas)的亲源关系最近，可达到 73%，与胡杨(Populus-
euphratica)、可可(Theobroma cacao)、葡萄(Vitis vinifera)
等的亲缘关系也较近，其次是荷花(Nelumbo nucifera)、
甜菜(Beta vulgaris)、油棕(Elaeis guineensis)，可以鲜
明的看出三色堇属于双子叶植物，但与罂粟(Papaver
somniferum)、烟草(Nicotiana sylvestris)、拟南芥(Ara-
三色堇酪氨酸脱羧酶基因的克隆及其生物信息学分析
Cloning and Bioinformatics Analysis of TYDC Gene in Pansy (Viola×wittrikianan Gams)
3006
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 2 TYDC蛋白亚细胞定位
Table 2 Subcellular localization of TYDC protein
名称
Name
比例(%)
Proportion (%)
细胞核
Nucleus
26.1
细胞质
Cytoplasm
21.7
高尔基体
Golgi
17.4
线粒体
Mitochondria
13.0
分泌囊泡系统
Vesicles of secretory system
8.7
内质网
Endoplasmic reticulum
8.7
过氧化物酶体
Peroxisomal
4.3
图 9三色堇 TYDC蛋白的聚类分析
注: TYDC:三色堇; XP012092716.1:麻疯树; XP011016331.1:胡
杨;XP007030244.1:可可;XP003631850.1:葡萄;XP010271797.1:
荷花; XP010695705.1:甜菜; XP010905655.1:油棕; BAD30830.1:
罂粟;XP009760717.1:烟草;XP006836315.1:拟南芥;AAA62347.1:
水稻; XP008651749.1:玉米; NP849999.1:无油樟
Figure 9 Polygenic analysis of TYDC protein in pansy (Viola×
wittrockiana)
Note:TYDC:Viola×wittrockiana;XP012092716.1: Jatropha curcas;
XP011016331.1: Populus euphratica; XP007030244.1: Theobroma
cacao; XP003631850.1: Vitis vinifera; XP010271797.1: Nelumbo
nucifera; XP010695705.1: Beta vulgaris; XP010905655.1: Elaeis
guineensis; BAD30830.1: Papaver somniferum; XP009760717.1:
Nicotiana sylvestris ; XP006836315 . 1 : Arabidopsis thaliana ;
AAA62347.1:Oryza sativa;XP008651749.1:Zea mays;NP849999.1:
Amborella trichopoda
bidopsis thaliana) 这一类双子叶植物亲缘关系较远，
与水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)等单子叶植物
和无油樟(Amborella trichopoda)这一孑遗植物聚类距
离较远(图 9)。
2讨论
本研究克隆得到三色堇 TYDC1基因 1 634 bp，
TYDC2基因 1 575 bp，具有完整且相同的开放阅读
框 1 485 bp，编码相同的 494个氨基酸。研究发现
TYDC基因羧基末端序列的差异性是普遍存在的，这
导致不同植物中 TYDC 以不同的拷贝形式存在，其
中罂粟较为典型，克隆出了 15种 TYDC 基因，从而
形成了一个基因家族(Facchini et al., 1999)，而欧芹的
TYDC基因由也 4个核酸序列稍有差异的基因组成，
且研究表明他们具有高度的氨基酸同源性(Kawal-
leck et al., 1993)。鉴于在三色堇 TYDC基因克隆中羧
基末端非编码区出现了 59 bp长度的差异，得到两个
同源的拷贝基因，也进一步表明 TYDC基因羧基末
端的多样差异性。
TYDC基因编码氨基酸序列与其他植物进行多
重比对发现，TYDC的保守区域一般都在中间部分，
两端变异性较大，氨基端变异性较小，大都以蛋氨酸
(Methionine, M)为起始氨基酸，第 10~第 20位之间
存在少量的插入和缺失部分，但羧基端氨基酸差异
性颇大，且大都长短不一。通过同源性比对氨基酸
序列发现，TYDC 基因在序列 IIPGLTHWQSPNF-
FAYF (75~91)和 DYKDWQIALSRRFR (351~364)两
部分高度保守，依据 GenBank数据库发布的 TYDC
的两段保守氨基酸序列 GFLGEM与 NAHKWF (Fac-
chini, 2000)比对可知，序列 GFLGEM (99~104)在已
发布 TYDC的植物中高度保守，但序列 NAHKWF只
在单子叶植物中属于保守区域，在三色堇等双子叶植
物中保守区域序列为 NPHKWL (306~311)，不同植物
TYDC的编码氨基酸序列之间存在的差异多以点突
变为主导，在 TYDC氨基酸序列比对中发现，三色堇
等双子叶植物的第 92位为谷氨酰胺(Glutamine, Q)，
而单子叶植物此处为苯丙氨酸(Phenylalanine, F)，在
双子叶植物的比对中，三色堇 TYDC编码氨基酸的第
313和 365 位为丝氨酸(Serine, S)，其他双子叶植物
313位和 365 位分别为苏氨酸(Threonine, T)和丙氨
酸(Alanine, A)，通过对序列的整体分析发现三色堇
TYDC基因编码氨基酸序列与其他植物不同的突出
变异点多为丝氨酸。
本研究立足于转录组测序，发现 TYDC在三色
堇色斑与非色斑中存在表达差异性，色斑区的表达
量明显高于非色斑区，已有研究表明三色堇色斑区
具有花色素，而非色斑区不含花色素(李琴等, 2014)，
所以推测其可能在花色形成中起到一定的作用。早
期对于花色花斑的机理研究主要集中在花色素的合
成催化酶基因和调节基因上，但随着花斑机理研究
的不断深入，花斑形成的分子研究也不再仅仅局限
3007
表 3 TYDC基因 3端和 5端特异性 RACE引物序列
Table 3 Specific primers sequences of TYDC for 3 RACE and
5RACE PCR
引物名称
Primer name
TYDC-3 RACE-Outer
TYDC-3 RACE-Inner
TYDC-5 RACE-Outer
TYDC-5 RACE-Inner
引物序列(5-3)
Primer sequences (5-3)
TGCTGCTGCCTCTGGGTCAAAAC
GAGTCCCTGGTGGCGGAAGATGA
TAG
GCGGTGCTCACGTTGGCTTGGAAA
TACG
CCCTGGCGTCACCTGACTCTTAAC
TG
于花色素之中，与花色体内各种次生代谢途径相关
的基因也可能是花斑形成的诱导因素。比如苹果中
的花青素还原酶(ANR)在转烟草的表达验证实验中，
过表达抑制了烟草中 CHI和 DFR基因的表达，从而
诱导形成了红白相间的色斑(Han et al., 2012)，康乃
馨(Dianthuus caryopyhllus)中的谷胱甘肽 S 转移酶
(GST)也可能作为辅助色素诱导花斑的形成(Sasaki
et al, 2012)。TYDC基因主要在植物体的酪氨酸代谢
途径中发挥作用，催化酪氨酸形成酪胺，而酪氨酸代
谢在植物体内的作用还没有十分的明确的研究，近
期一项酪氨酸在模式植物拟南芥的花青素生物合成
及分子机制的研究中发现，外源添加酪氨酸能够有
效的诱导拟南芥花青素的生物合成和积累，酪氨酸
浓度越高，诱导效果越强(Zhou et al., 2014)，这也进
一步增强了我们对于三色堇中 TYDC基因作为潜在
辅助色素催化酪氨酸代谢从而影响花色的推理，同
时鉴于该基因与烟草、拟南芥等模式植物的亲缘关
系较远，可将克隆得到的 TYDC基因通过农杆菌介
导入模式植物烟草中，进行相关表达验证，为进一步
研究植物体中酪氨酸代谢途径以及 TYDC基因的作
用机制提供新的可行性分析。
3材料与方法
3.1试验材料
实验所用的材料为三色堇(Viola×wittrockiana G-
am.)中黄底紫斑的‘梦蝶’系列品种，培育在海南大学
园艺园林学院花卉种植基地。采摘后的三色堇花瓣，
经过无菌水清洗，放置在液氮中速冻，然后转入
-80℃冰箱中保存以供后续使用。
3.2 RNA提取
利用改良 Trizol法对三色堇花瓣的总 RNA进
行提取，提取后的总 RNA，溶于高压灭菌的焦碳酸
二乙酯(diethy pyrocarbonate, DEPC)水中，用 1.6%的
琼脂糖凝胶电泳检测其条带完整性。
3.3 TYDC基因的扩增
根据三色堇转录组测序获得 TYDC基因的保守
区域核酸序列，设计 3RACE和 5 RACE尾端扩增的
特异性引物(表 3)，以三色堇总RNA为模板，参照3-Full
RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase (TaKaRa,
Code No.6106)说明书进行 3RACE扩增；参照 SMA-
RTerTM RACE 5/3 Kit 9 (Clontech, Cat.No.634 859)说
明书进行 5RACE扩增。扩增后的 PCR产物用 1.6%
的琼脂糖凝胶进行电泳检测，然后利用琼脂糖凝胶
DNA回收试剂盒(中科瑞泰)回收目的基因条带，回收
的DNA片段与载体 pMD19-TSimple vector (TaKaRa)
连接，连接产物转化进大肠杆菌 DH 5 α感受态细胞
(TaKaRa, Cat.9057)，在含 AMP＋的 LB固体培养基上
进行蓝白斑筛选，挑取独立的白色菌落在 LB液体培
养基中培养，然后用M13通用引物进行 PCR扩增，
将阳性菌液送到广州华大基因进行测序；最后利用
DANMAN对保守区域序列、测序成功的 3RACE和
5RACE扩增片段，进行序列拼接，获得全长序列。
3.4 TYDC基因的生物信息学分析
获得全长序列后，利用 NCBI 中的 nucleotide
blast对 TYDC基因的核酸序列进行比对分析，验证
是否为目的基因的序列；利用 ORF Finder对 TYDC
基因的开放阅读框进行分析确认；利用 NCBI中的
blastx对 TYDC基因开放阅读框编码的氨基酸序列
进行同源性比较分析；利用 ExPASy ProtParam在线
软件分析氨基酸理化性质(Gasteiger et al., 2003)；利用
Expasy Protscale、TMHMM Server (Qian et al., 2015)和
Signalp 4.1 Server (Chaudhuri et al., 2008)在线分析软
件对 TYDC蛋白一级结构的亲/疏水性、跨膜结构、信
号肽等进行分析预测；利用 SOPMA在线软件对蛋
白质的二级结构进行预测(Meetul et al., 2014)；通过
PSORT Ⅱ和 WoLF PSORTⅡ在线软件对亚细胞定
位进行预测(Horton et al., 2007)；利用 MEGA5.02软
件对三色堇 TYDC编码氨基酸与其他植物相应氨基
酸序列进行多重比对和聚类分析。
作者贡献
杨文汉是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，并负责论文的撰写；曾媛参与实验设计，李霆格
三色堇酪氨酸脱羧酶基因的克隆及其生物信息学分析
Cloning and Bioinformatics Analysis of TYDC Gene in Pansy (Viola×wittrikianan Gams)
3008
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
和赵安瑾参与实验数据分析；王健是该项目的构思
者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与
修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目 (31060265;
31260488)和海南大学中西部计划学科建设项目(ZX-
BJH-XK008)共同资助。
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三色堇酪氨酸脱羧酶基因的克隆及其生物信息学分析
Cloning and Bioinformatics Analysis of TYDC Gene in Pansy (Viola×wittrikianan Gams)
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《分子植物育种》征稿启事
《分子植物育种》是由国家科技部批准，国家新闻出版署核准的刊物。本刊“立足国内，面向国际”，是一
份为转基因育种、分子标记辅助育种及常规育种服务的国际化科学杂志。围绕水稻、小麦、玉米、油菜、大豆、
棉麻、薯类、果树、蔬菜、花卉、茶叶、林草等，刊登分子遗传育种理论、分子育种方法、分子育种研究动态以及
优良种质培育等方面的科学论文应用成果。从 2003年创刊以来，已被美国化学文摘(CA)，英国《国际农业
与生物科学研究文摘》(CABI)，中国科学引文数据库(CSCD)、中国期刊全文数据库(CJFD)、中文科技期刊数
据库，中国核心期刊(遴选)数据库，中国生物学文摘和中国生物学数据库(CBA)等多家中外文献数据库收录。
本刊是北京大学图书馆《中文核心期刊要目总览》之核心期刊、中国科学技术信息研究所的中国科技论文统
计源期刊之核心期刊；是中国科学院文献情报中心的中国科学引文数据库(CSCD)核心库来源期刊。
特向您征集研究论文和研究报告：
研究论文：反映我国植物分子生物学和分子育种领域在基础理论、应用研究和高新技术开发方面的、在
国内外公开出版的刊物上尚未发表过的原始研究工作报告。论文篇幅要求在 8个印刷页面以上，相当某些
国际刊物的 Full length paper。
研究报告：以简要的形式发表的原始研究工作报告。论文篇幅要求在 5~8个印刷页面左右。
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