全 文 ：正交试验优选肾蕨中红杉醇的醇提工艺
林红1 , 2 , 蒋孟良1 , 陈优生2 , 王霆2＊ (1.湖南中医药大学 , 长沙 410208;2.广州威尔曼新药开发中心 , 广州
510663)
摘要:目的 优选肾蕨中红杉醇最佳提取工艺。方法 以红杉醇含量为评价指标 , 采用高效液相色谱法测定红杉醇
的含量 , 并用 L 9 (34)正交试验法优化提取条件。结果 提取时间对红杉醇的含量有显著影响 , 最佳提取工艺为:
每次加 4 倍量 75%乙醇 , 提取 3 次 , 时间分别为 3.5 、 2.5 、 2 h。结论 优选得到的工艺稳定 、 合理 、 可行。
关键词:肾蕨;红杉醇;正交试验;提取工艺
中图分类号:R284.2 , R927.2 文献标识码:A 文章编号:1672-2981 (2009)12-0893-03
Optimization of alcohol extraction technology in
Nephrolepis Cordi f olia by orthogonal design
LIN H ong1 , JIANG M eng-liang 1 , CH EN You-sheng 2 , WANG Ting2＊ (1.Hunan University o f T raditoinal Chi-
nese Med icine , Changsha 410208;2.Welman Pharmaceutical Co.L td., Guangz hou 510663)
Abstract:Objective To optimize the ex traction techno log y of sequoyitol in Nephrolepis Cordi f olia.Methods An
L9 (34)or thgonal e xperiment w as perfo rmed to inve stiga te the 3 fac to rs (3 levels fo r each factor we re selected), the
chr oma and dosage o f ethano l , time o f ext raction with the sequoyitol as indexes fo r evaluation.Results The time o f
ext raction had significant impact on the ex traction o f the effectiv e com ponents in Nephrolepis Cordi f olia .The best
ext raction techno lo gy was as follow s:adding 4 fo lds of ethano l so lution fo r 3 times (a t a concentra tion o f 75%) fo r di-
gera tur ext raction thrice , 3.5 h , 2.5 h , and 2 h each time.Conclusion The optimized techno log y fo r the extr action
of sequoyitol from Nephrolepis Cordi folia is stable , rea sonable and feasible.
Key words:Nephrolepis Cordi f olia ;sequoy ito l;or thogonal experiment;ex traction techno lo gy
肾蕨 (Nephnolepis Cordi f oolia Pre sl)是蕨类肾蕨科
肾蕨属多年生常绿草本植物 , 其化学成分有萜烯类 、 甾体 、
红杉醇等[ 1] 。红杉醇是肌醇的甲基化衍生物 , 在红杉醇脱氢
酶 (EC1.1.1.143)的作用下 , 可以使 NAD (+)转变为
NADP , 参与基本生理生化过程 , 发挥降糖的作用[ 2] 。文献
报道:对于四氧嘧啶或葡萄糖诱发的高血糖小鼠模型 , 红豆
杉提取物 (红杉醇含量占 40%)有很好的降糖效果[3] 。目
前 , 肾蕨化学成分的研究取得了一定的进展 , 但有关提取工
艺尚未报导。本文通过正交试验 , 采用 H PLC 法测定红杉
醇在肾蕨提取液中的浓度 , 考察肾蕨的提取方法 , 为合理提
取肾蕨中降糖的活性成分提供实验依据。
1 仪器与材料
高效液相色谱仪及 SEDEX-75 蒸发光检测器 (日本岛
津公司), NH2 柱 (4.6 mm×250 mm , 5 μm , 美国安捷伦
公司), N2000 色 谱工作站;红杉醇对照品 (含量为
98.7%, 广州威尔曼新药中心自制 , 批号:JH 050201001),
蒸馏水 (屈臣氏), 乙腈 (色谱纯), 其他试剂 (色谱纯或
分析纯 , 市售)。中药肾蕨采自广州市番禺区大学城 , 经湖
南中医药大学中药学院刘塔斯教授鉴定为肾蕨科肾蕨属
(Nephrolepis cordi f olia)。
2 方法与结果
2.1 肾蕨中红杉醇的提取
取肾蕨 , 加乙醇 , 水浴回流提取 3次 , 合并提取液 , 浓
缩回收乙醇至浸膏状 , 用 3 倍体积水溶解 , 用乙酸乙酯萃
取 , 弃去乙酸乙酯层 , 留取水层 , 备用。
2.2 因素水平的确定
预实验表明 , 采用乙醇提取 3次可提取出肾蕨中红杉醇
97%以上。故选择了溶媒浓度 (A), 提取时间 (B), 溶媒
体积 (C)3 个因素 , 每个因素选取 3 个水平 , 采用 L 9 (34)
正交表安排 , 因素水平见表 1。
2.3 样品提取
分别称取肾蕨药材 50 g , 按试验设计加入乙醇 , 提取 3
次 , 抽滤 , 合并滤液 , 浓缩至 50 m L , 备用。
2.4 含量测定
基金项目:广州市科技计划项目 (项目编号:2007Z2-E5021)。
作者简介:在读硕士研究生 , 主要从事中药制剂工艺与质量标准, E-m ail:linh on g200349@163.com ＊通讯作者:王霆 , 男 , 教
授 , 博士 , 主要从事新药开发工作 , Tel:(020) 37637879;E-mai l:wm rd@w elman.com.cn
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中南药学 2009年 12月第 7卷第 12期 Cent ral S ou th Pharmacy.December 2009 , Vol.7 No.12
表 1 因素水平
Tab 1 Factor and level
水平
(level)
因素 (Factor)
乙醇浓度 A (alcoh ol
concent ration)/ %
提取时间 B
(time)/ h
溶媒体积 C
(s olvent volume)
1 90 3.5 、 2.5 、 2 6 、 5 、 4
2 75 2 、 1.5 、 1 6 、 4 、 3
3 60 1.5 、 1 、 1 4 、 4 、 4
2.4.1 色谱条件 色谱柱:NH2 柱 (200 mm ×4.6 mm ,
5 μm);流动相:乙腈-水 (体积比 75∶25 , 过滤脱气后使
用);流速:1.0 mL ·min-1 ;进样量:10 μL;检测器为蒸
发光检测器 , 漂移管温度为 40 ℃, N 2 压力 3.5 Bar , 响应
值:6 , 理论塔板数按红杉醇峰计算≥3 000。
2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取红杉醇对照品
11.07 mg , 置 10 m L 量瓶中 , 加 75%乙腈溶液超声溶解 ,
定容至刻度 , 摇匀 , 得浓度为 1.107 mg ·mL -1的红杉醇乙
腈溶液。
2.4.3 标准曲线的绘制 吸取对照品溶液 , 按拟定的色谱
条件进行测定 , 分别进样 1 、 5、 10、 15、 20 μL 。以峰面积
的对数为纵坐标 (Y), 对照品浓度的对数为横坐标 (X)进
行线性回归 , 得回归方程Y =1.100 X +9.988 , r=0.999 9。
结果表明 , 线性关系良好。
2.4.4 样品制备及测定 分别取各试验号的乙醇提取液
10 m L , 蒸干 , 75%乙腈溶液溶解 , 定容到 10 m L , 用
0.22μm 微孔滤膜过滤, 精密吸取滤液 1 mL , 进样10μL检测。
2.5 正交试验结果和数据分析
用 L9 (34)正交表进行试验优选 , 对所得结果进行直
观分析和方差分析 , 结果见表 2、 3 , 以红杉醇的浓度为参
考指标时 , 最主要的影响因素为提取时间 , 其次是溶剂体积
和溶媒浓度 , 方差结果也表明提取时间对红杉醇浓度有显著
的影响 , 肾蕨最佳提取工艺为:A 2B1C3 , 即 75%乙醇提取 ,
每次溶剂量为肾蕨质量 4 倍 , 提取 3 次 , 提取时间分别为
3.5 、 2.5 、 2 h。
表 2 正交设计结果与分析
Tab 2 Orthogonal test
试验号
(No.)
因素 (factor)
1 (A) 2 (B) 3 (C) 4 (D)
红杉醇浓度
(sequoyitol concent ration)/ mol· L-1
1 1 1 1 1 0.186
2 1 2 2 2 0.138
3 1 3 3 3 0.168
4 2 1 2 3 0.186
5 2 2 3 1 0.171
6 2 3 1 2 0.152
7 3 1 3 2 0.199
8 3 2 1 3 0.170
9 3 3 2 1 0.138
∑ Ⅰ 0.492 0.571 0.508 0.495 Y=1.508
∑ Ⅱ 0.509 0.479 0.462 0.489
∑ Ⅲ 0.507 0.458 0.538 0.524
R 0.017 0.113 0.076 0.035
SS g 0.000 03 0.001 42 0.000 64 0.000 14 SS g= R2/ n = R2/ 9
因素 A 的 SSg 小于空白列 , 故合并计算误差 , 其方差
分析表见表 3。
表 3 方差分析
Tab 3 Analysis of variance
变异来源 SSg ν MS F P
A 0.000 03 2 0.000 02 0.382 >0.05
B 0.001 42 2 0.000 71 16.868 <0.05
C 0.000 64 2 0.000 32 7.630 <0.05
E rror 0.000 17 4 0.000 04
注:F0.05(2 , 4)=6.94, F0.01(2 , 2)=18.0
由直观分析得最佳提取工艺为 A2B1C3 , 各因素的主次
顺序为 B>C>A , 方差分析表明 B 、 C 二因素对红杉醇提取
率具有显著性影响 , 因素 A 没有显著性影响。红杉醇醇提
的最佳提取工艺为:每次加 4 倍量 75%乙醇提取 3 次 , 时
间分别为 3.5、 2.5 、 2 h。
2.6 验证试验
因优选出的最佳组合 A 2B1C3 在正交表中没有 , 故应做
验证试验 , 以进一步考察优选工艺的可靠性及稳定性。称取
肾蕨药材 3 份 , 50 g ·份-1 , 按上述最佳工艺条件进行试
验 , 操作方法同前 , 红杉醇分别为 0.301 、 0.290 、 0.307
mo l· L-1 , 平均为 0.299 mol· L-1 , 结果比正交表中最高
的 7 号 0.199 还要高 0.1 , 实验表明该工艺稳定可行。
3 讨论
从国内外的文献可以得知 , 除 1985 年曾有报导在肾蕨
甲醇提取物中得到红杉醇外[ 4] , 关于肾蕨提取工艺方面的研
究就没有相关的报导。 2 年前 , 曾有报道超声技术可应用于
提取植物生物碱 、 生物活性成分[ 5] 。本实验采用乙醇回流提
取 , 提取物中有效成分含量较高 , 最终确定肾蕨的提取工艺
为 A2B1C3 , 该提取工艺可合理有效的提取肾蕨中降糖活性
成分。
参考文献
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(收稿日期:2009-08-12;修回日期:2009-11-04)
反相高效液相色谱法同时测定
冬虫夏草中腺苷 、虫草素 、肌苷含量方法的研究
毛新亮1 , 郑国栋2 , 张晨1 , 郭晓蕾1 (1.无限极 (中国)有限公司 , 广州 510665;2.广州医学院基础学院药学系 ,
广州 510182)
摘要:目的 建立同时测定冬虫夏草中腺苷 、 虫草素 、 肌苷的 HPLC 方法。方法 采用 RP-HPLC 法 , 色谱柱:
Ag ilent C18柱 (250 nm×4.6 mm , 5 μm), 甲醇与水梯度洗脱 , 柱温:30 ℃, 流速:1.0 mL ·min-1 , 检测波长:
260 nm。结果 腺苷进样量在 0.200 8 ～ 1.004 μg 与峰面积呈良好线性关系 , 回归方程为 Y =2 876 X +0.458 8 ,
r=0.998 7 , 平均加样回收率为 100.5%, RSD为 2.33%;虫草素进样量在 0.202 2 ～ 1.011 μg 与峰面积呈良好线
性关系 , 回归方程为Y =2 018X +8.726 , r=0.999 2 , 平均加样回收率为 99.3%, RSD为 2.03%;肌苷进样量在
0.201 4～ 1.007 μg 与峰面积呈良好线性关系 , 回归方程为Y =5 845X -5.685 , r=0.999 4 , 平均加样回收率为
100.2%, RSD为 1.44%。结论 本方法简便 、 准确 , 重复性好 , 可用于同时检测冬虫夏草中的腺苷 、 虫草素及肌
苷的含量测定。
关键词:冬虫夏草;腺苷;虫草素;肌苷;反相高效液相色谱法
中图分类号:R927.2 文献标识码:A 文章编号:1672-2981 (2009)12-0895-03
Determination of adenosine , cordycepin , and
inosine in Cord yceps sinensis by RP-HPLC
MAO Xin-liang1 , ZH ENG Guo-dong2 , ZH ANG Chen1 , GUO Xiao-lei1 (1. In f initus (China) Company L td ,
Guangzhou 510665;2.Department o f Pharmacy of Guangz hou Medical College , Guangzhou 510182)
Abstract:Objective To establish an RP-H PLC me thod to determine adenosine , co rdycepin and ino sine in Cordyceps
sinensis.Methods The chromatog raphic sy stem consisted of Agilent C18 column (250 nm×4.6 mm , 5 μm).The mobile
phase consisted of me thanol and w ater using a g radient elution.The co lumn tempe rature w as 30 ℃ and the flow rate
was 1.0 m L·min-1 .The de tec tion waveleng th was 260 nm.Results A good linearity of adenosine was 0.2008 ～
1.004 μg , the reg ression equation w as Y =2 876X +0.458 8 , (r=0.998 7), the average recovery was 100.5%, and
RSD was 2.33%.A good linearity of cordycepin was 0.202 2～ 1.011μg , the regression equation w as Y=2 01 8X +8.726
(r=0.999 2), the average recover y was 99.3%, and RSD was 2.03%.A good linearity o f ino sine was 0.2014 ～ 1.007
μg , the reg ression equation was Y =5 845X- 5.685 (r=0.999 4), the aver age recove ry w as 100.2%, and RSD w as
1.44%.Conclusion The method is simple and accurate w ith good reprodlucibility , and it can be used fo r the de te rmi-
nation o f adenosine , co rdycepin , and ino sine by H PLC.
Key words:Cord yceps sinensis;adeno sine;cordycepin;ino sine;RP-H PLC
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌 Cordyceps sinensis
(Be rK.)Sace.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫的子座及幼虫尸体
的复合物[ 1] , 主要产于西藏 、 青海 、 四川 、 云南等海拨较高
的高山草甸中 , 始载于 《本草备要》 。其性平 、 味甘 , 主归
肾 、 肺经。功能补肾壮阳 , 益肺平喘 , 止血化痰。现代临床
研究表明冬虫夏草具有镇强心 、 降血脂 、 降低胆固醇 、 调节
机体免疫功能 、 抗肿瘤 、 抗癌 、 降血压等多种药理活性[ 2-5] ,
对高血压 、 冠心病 、 慢性肝炎 、 慢性肾炎 、 支气管炎以及食
作者简介:毛新亮 , 男 , 硕士 , 主要从事保健食品开发及质量监控等研究工作 , Tel:(020) 81107252 , E-mail:enginemao @ya-
hoo.com.cn
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中南药学 2009年 12月第 7卷第 12期 Cent ral S ou th Pharmacy.December 2009 , Vol.7 No.12