全 文 ：收稿日期:2004-08-19
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30470324);陕西师范大学重点科研项目(200024).
作者简介:任耀辉(1960—), 男 ,陕西富平人 , 陕西师范大学实验师.
＊通讯联系人:肖娅萍 , 女 ,陕西师范大学教授.
文章编号:1672-4291(2005)02-0084-03
太白红杉总 DNA的快速提取方法
任耀辉 , 　胡雅琴 , 　肖娅萍＊
(陕西师范大学 生命科学学院 , 陕西 西安 710062)
摘　要:对太白红杉总 DNA 提取方法进行了探讨 ,并对其不同部位和器官 、不同处理方式材料进
行了提取实验研究.通过琼脂糖凝胶电泳 、限制性内切酶处理等方法对所提取的 DNA样品进行检
测.结果表明 ,改良后的 CTAB法 ,对于太白红杉总 DNA的提取是一种良好的简单易行的方法 , 无
论是烘干后的材料还是新鲜材料提取的总 DNA中基本没有蛋白质及酚类污染.该方法可在短时
间内获得大量的 DNA样品 ,并可根据需要对样品进行适当操作.
关键词:太白红杉;总 DNA提取;限制性内切酶消化
中图分类号:Q523　文献标识码:A
Quick effect method of Larix chinensis DNA extraction
REN Yao-hui , HU Ya-qin , XIAO Ya-ping
(College of Life Science , Shaanxi No rmal Universi ty , Xi′an 710062 , Shaanxi , China)
Abstract:The methods , which are used to ex tract the genomic DNA of the dif ferent organs and
different materials by different t reatment of Larix chinensis are tried.The resulted DNA samples are
tested using Agarose gel electropho resis and restriction digests.There is preliminary success and offer
the elementary conditions for further study of genetic diversity of Larix chinensis.Whatever in the
fresh or dry samples , there are no pro tein and other secondary metaboli tes.The improved method can
get large number of DNA samples in sho rt time.
Key words:Larix chinensis;isolation total DNA;digestion w ith rest rict ion enzyme
　　太白红杉(Larix Chinensis Beissn)属秦岭特有
植物 ,其分布仅限于陕西境内秦岭山地海拔 2 500 —
3 500 m 的少数山头上 ,属森林的上限树种 ,对于涵
养水源 、保护高山水土 、改善生态环境具有重要作
用 ,已被列为国家二级保护植物[ 1 , 2] .因此 ,研究太
白红杉的遗传多样性 ,对于太白红杉的保护以及持
续性利用有着及其重要的意义.DNA的提取是进行
分子生物学研究来探讨生物学问题的第一步 ,高纯
度 、高质量 、高含量 DNA的获得更是研究成功的基
础.太白红杉同其它针叶类裸子植物一样 ,植物体含
有大量的酚 、萜 、酯等次生代谢物 ,由于太白红杉生
长环境的特殊性 ,它含有更多的多糖 ,如何有效地去
除次生代谢物及多糖就成了太白红杉总 DNA 提取
的关键.关于这方面的研究 ,国内已有部分报道 ,李
丹 、凌定厚用 5 种方法提取马尾松总 DNA 并进行
了比较 ,认为 CTAB 沉淀法为提取马尾松总 DNA
的最佳方案[ 3] ,阎桂琴 、李珊等对太白红杉总 DNA
进行了提取和鉴定[ 4] .我们在研究中参考顾红雅
等[ 5]人的方法 ,对太白红杉总 DNA 提取方法进行
研究 ,并对其不同部位器官 、不同处理方式材料进行
了提取尝试 ,获得初步成功 ,为进一步研究太白红杉
的遗传多样性奠定了基础.
1　材料和方法
1.1　材料来源
太白山红桦坪到下板寺 2 560 m 处 ,下板寺到
第 33卷　第 2期 陕西师范大学学报(自然科学版) Vol.33　No.2　2005年 6月 Journal of Shaanxi Normal University (Natural Science Edit ion) Jun.2005　
DOI :10.15983/j.cnki.jsnu.2005.02.024
上板寺梁上太白红杉的大 、小孢子叶球和针叶.其
中 ,部分材料烘干处理 ,部分材料实验室水培发芽所
得 ,部分材料自野外置于冰壶带回实验室后立即用
液氮研磨提取.
1.2　主要仪器
电热恒温水浴锅(HH.S112 ,江苏省医疗器械
厂);Eppondo rf centrifuge 5415D 离心机;Beckman
DU640紫外分光光度计;天能 GIS —120D凝胶系统
紫外分析仪;DY602V 稳流稳压电泳仪(南京大学).
1.3　主要药品与试剂
1.3.1　药品　CTAB 、EcoRI 、Tris均购自华美生物
有限公司.
1.3.2 　试剂 　(1)CTAB 提取液:100 mmol/L
Tris-HCl , pH 值为 8;1.4mol/ L NaCl;20mmol/L
EDTA ,pH 值为 8;2%CTAB(W/ V);2%β-巯基乙
醇(V/ V)(用前加入).(2)氯仿∶异戊醇 =24∶1.
(3)DNA洗 涤液:76%乙 醇 , 0.2mol/ L NaAc.
(4)70%乙醇.
1.4　总 DNA提取
新鲜材料直接研磨或液氮中研成细粉(干材料
可直接于研钵中研磨),分装入 1.5 mL Eppondorf
管中 ,迅速加入 700μL 65 ℃预热的 CTAB提取液 ,
混匀后 65 ℃水浴 60 ～ 90 min ,其间不时颠倒混匀.
2 000 r/min离心 2 min ,取上清液 ,加入等体积氯仿
/异戊醇 ,颠倒混匀 ,6 000r/min离心 5 min ,取上相 ,
重复一次.加入 0.6 V 冰冷异丙醇 ,冰上静置 10
min ,12 000 r/min离心 30 s.小心弃上清 ,加入 400
μL DNA 洗涤液洗一次 , 70%乙醇洗 2次 ,室温干
燥 ,溶于无菌水 ,4 ℃保存备用.
2　结果与分析
本实验提取的总 DNA 可很好地溶于无菌水.
紫外分光光度计下测定 260 nm 和 280 nm 处的吸
光度 ,比值在 1.7 ～ 2.0之间(表 1-4),说明提取的
总 DNA 中有较多的 RNA ,但基本已没有蛋白质及
酚的污染 ,且干材料与新鲜组织没有区别.根据在
260 nm 吸收值计算的总 DNA含量达 mg 级.在 1%
琼脂糖凝胶(+EB ,5 V/cm)上针叶及鲜孢子叶球总
DNA呈现一条迁移率很小的亮条带 ,少数有拖尾 ,
且溴酚蓝附近有弥散的荧光出现 ,说明 RNA 含量
较大(图 1).对于小孢子叶球 ,干材料的总 DNA 呈
现弥散的荧光 ,无明显条带 ,可能是孢子叶球体积过
大 ,在烘干过程中不易立即失水 ,有降解情况发生.
因此 ,小孢子叶球不能用干材料来提取总 DNA.
表 1　太白红杉新鲜针叶紫外光度测定结果
Tab.1　Mensuration outcome of UV spectrophotometer of
larix chinensis fresh leaf
　　　　材料编号 A260 A280 A 260/ A280
DNA质
量/ mg
直接研磨 4.27-1 0.240 7 0.136 5 1.76 3.73
4.27-2 0.278 1 0.150 9 1.84 4.31
4.27-3 0.564 8 0.293 7 1.92 8.75
4.28-1 0.166 6 0.092 9 1.79 2.07
4.28-2 0.207 9 0.109 4 1.90 2.58
4.28-3 0.217 1 0.103 8 2.09 2.69
4.28-4 0.401 9 0.196 0 2.05 4.98
液氮中研磨 5.12-1 0.736 3 0.358 8 2.05 4.42
5.12-2 0.692 6 0.388 7 1.78 4.16
5.20-1 0.291 5 0.148 3 1.97 1.75
　　＊ 5.12 为 10 μL 样+190μL 水 , 4.27 和 4.28为 10 μL
样+300 μLTE.
表 2　太白红杉干针叶紫外光度测定结果
Tab.2　Mensuration outcome of UV spectrophotometer of
Larix chinensis dry leaf
材料编号 A260 A280 A260/ A280
DNA 质量
/ mg
4.28-1 0.490 9 0.271 1 1.81 6.09
4.28-2 0.207 8 0.104 1 1.99 2.58
4.28-3 0.305 3 0.155 9 1.96 3.79
4.29-1 0.196 6 0.113 9 1.73 3.05
4.29-2 0.191 9 0.111 7 1.72 2.97
4.29-3 0.194 4 0.116 5 1.67 3.01
4.29-4 0.755 7 0.363 7 2.07 11.71
4.29-5 0.530 1 0.252 9 2.09 8.22
4.29-6 0.467 6 0.226 0 2.07 7.01
4.29-7 0.297 1 0.158 5 1.87 4.61
　　＊ 10μL 样+300 μL TE.
表 3　太白红杉小孢子叶球紫外光度测定结果
Tab.3　Mensuration outcome of UV spectrophotometer of
Larix chinensis male cone
材料编号 A260 A280 A260/ A280
DNA 质量
/ mg
5.20-1 0.060 9 0.031 8 1.92 0.37
5.20-2 0.077 7 0.040 6 1.91 0.47
5.20-3 0.129 9 0.069 6 1.87 0.78
5.20-4 0.544 1 0.288 6 1.89 5.44
5.20-5 0.213 1 0.107 3 1.99 1.28
5.20-6 0.229 7 0.133 3 1.72 1.38
　　＊ 10μL 样+190 μL水 , 液氮研磨.
　　第 2期 任耀辉 等:太白红杉总 DNA的快速提取方法 85　
表 4　太白红杉大孢子叶球紫外光度测定结果
Tab.4　Mensuration outcome of UV spectrophotometer of
Larix chinensis female strobilms
材料编号 A260 A280 A260/ A 280
DNA质量
/mg
5.20-1 0.397 1 0.200 9 1.98 3.97
5.20-2 0.558 9 0.294 1 1.90 3.35
5.20-3 0.965 5 0.475 0 2.03 5.79
5.20-4 0.640 6 0.340 8 1.88 3.84
5.20-5 1.075 4 0.537 5 2.00 6.45
5.20-6 0.134 7 0.069 6 1.93 0.54
　　＊ 10 μL样+190 μL 水 ,液氮研磨
用 EcoRI对总 DNA 进行限制性内切酶酶切(4
-6 U/μgDNA)5 h ,酶切彻底的样品在 1%琼脂糖
凝胶(+EB , 5 V/cm)上呈弥散状荧光 ,无条带出现
(图 2),说明此方法提的总 DNA可用限制性内切酶
酶切.
图 1　琼脂糖电泳检测 DNA样品
Fig.1　Agarose gel electrophoresis of DNA samples
泳道 1、2、3为直接研磨的鲜针叶;
泳道 4 、8 、9 为干针叶;
泳道 5、6为液氮研磨鲜针叶;
泳道 7、10 、12为烘干小孢子叶球;
泳道 11 为新鲜小孢子叶球
图 2　琼脂糖凝胶电泳检测限制性内切酶降解 DNA样品
Fig.2　Agarose gel electrophoresis of DNA
samples after restriction digests
泳道 1 、3 、7 、9 为 EcoI 彻底酶切
泳道 2 、6 、8 、10分别为相应对照
　　对于液氮中研磨或是在 Eppondorf管中直接用
研棒研磨的新鲜材料 ,电泳结果及紫外分光光度计
下检测无明显差别(表 1 , 2),说明对于太白红杉较
软的新鲜幼嫩针叶 ,如果实验室液氮短缺 ,可以直接
研磨 ,但对于成熟针叶则必须在液氮中研磨.有的液
氮研磨新鲜材料提取的 DNA 出现 DNA Ladder ,可
能是在提取过程中操作幅度过大 ,造成 DNA剪切.
3　讨论
CTAB是一种去污剂 ,能使蛋白质变性 ,并能有
效地沉淀多糖.提取过程中 β-巯基乙醇打断了多酚
氧化酶的二硫键 , 65 ℃保证了蛋白质的变性.氯仿/
异戊醇抽提时 ,有效地将蛋白质及多酚除去.而多糖
则与CTAB结合成复合物 ,因其粘度大不易离心至
管底 ,在异丙醇沉淀 DNA 时可弃去.对于干材料 ,
可在研钵中容易研成粉末 ,减少了液氮及研钵的耗
材.CTAB 可使蛋白质变性 , 避免了操作者接触苯
酚 ,减少了操作者与有害试剂接触的环节 ,而且降低
了费用.此方法提取操作时间短 ,提取 12个样 ,一般
只需2 ～ 2.5 h ,而且此方法操作步骤简单 ,只需1人
操作.
此法提取的总 DNA 用上海生物工程公司生产
的 S83引物 、适当的程序进行 RAPD 反应 ,扩出一
定的产物 ,特别是用干材料提取获得的 DNA 样品 ,
实验室可以用该法在短时间内获得大量的样品并根
据需要对样品进行适当的操作.
参考文献:
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[ M] .西安:西北大学出版社 , 1989.41～ 44.
[ 2] 傅立国.中国珍稀濒危植物[ M] .上海:上海教育出版
社 , 1989.39.
[ 3] 李丹 ,凌定厚.五种提取马尾松基因组 DNA 方法的比较
[ J] .植物学通报 , 2000 , 17(2):168～ 173.
[ 4] 阎桂琴 , 李珊 ,王玲 ,等.太白红杉总 DNA 的提取及鉴定
[ J] .西北大学学报(自然科学版), 2001 , 31(1):53 ～
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[ 5] Clark MS 主编.植物分子生物学实验手册[ M] .顾红雅 ,
瞿礼嘉主译.北京:Springer出版社 , 1998.6～ 7.
〔责任编辑　王　勇〕
86　 陕西师范大学学报(自然科学版) 第 33卷