全 文 ：翻白草总 DNA的提取与 ISSR-PCR体系的建立与优化
罗 佶1 , 伍贤进2 , 彭帅1 , 刘选明1＊
(1.湖南大学生命科学与技术研究院 ,生物能源与材料研究中心 ,湖南长沙 410082;2.怀化学院生物工程系 ,湖南怀化 418008)
摘要　[目的]针对翻白草 ISSR的反应特点 ,建立稳定可靠的 ISSR分子指纹标记反应体系 ,为进一步研究翻白草的居群差异奠定基础。
[方法]通过筛选引物并设定影响翻白草 ISSR反应的诸因子的不同浓度 ,检测 ISSR不同反应体系的扩增效果;通过分析非特异性条带的
产生原因并进行条件优化 ,建立翻白草 ISSR稳定可靠的反应体系。[结果]首次建立了可用于翻白草 ISSR-PCR分析的最适宜的反应体
系 , 确定了 25μl PCR反应体系中各试剂终浓度:1×Buffer缓冲液 , 1U Taq DNA聚合酶 ,2.5 mmol/LMg2+, 0.25 mmol/LdNTP, 0.4μmol/L引
物 , DNA模板约 20～ 30 ng ,退火温度在 50～ 56 ℃;实验表明:Taq 酶质量、DNA模板品质、退火温度、Mg2+浓度、dNTP浓度均对 ISSR反应结
果具有较大影响。[结论]所建立的翻白草 ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点 ,可
以较好地应用于翻白草的居群鉴别及居群分子生态的研究。
关键词　翻白草;总DNA提取;ISSR-PCR;体系优化
中图分类号　Q503　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)03-00895-03
Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction System and Genome DNA of Discolor cinquefoil Herb
LUO Yue-ji et al　(Institute of Life science and Biotechnology , Bioenergy and Biomaterial Research Center,Hunan University , Changsha ,Hunan 410082)
Abstract　To establish and optimize ISSR-PCR system of Discolor cinquefoil Herb according to the ISSR-PCR characters of Discolor cinquefoil Herb the
effects of ISSR-PCRs was examined with selected primers and different concentrations in the ISSR-PCRs , and the reliable ISSR-PCR systems for Discolor
cinquefoil Herb populations was established through the analysis of the reasons for occurrence of differential bands and optimizing reaction conditions.The
optimal ISSR-PCR system in Discolor cinquefoil Herb was reported for the first time , and 25μl ISSR-PCR system contained 1×Taq buffer ,1 UTaq DNA
polymerase, 2.5 mmol/ LMgCl2 , 0.25 mmol/L dNTP ,0.4μmol/L primer and 20～ 30 ng template DNA.The appropriate annealing temperature was among
50～ 56 ℃.ISSR-PCRs were significantly influenced by Taq DNA polymerase, template DNA quantity and annealing temperature , concentrations of Mg2+
and dNTP , etc.The ISSR-PCR systems ,which were established in this paper for studying Discolor Cinquefoil Herb , could provide clear reliable abundant
polymorphisms molecular markers and were suitable for studying population authentication and population molecular ecology of Discolor Cinquefoil Herb.
Key words　Discolor cinquefoil Herb;Genome DNA extraction;ISSR-PCR;Optimization of ISSR-PCR Reaction System
基金项目　国家科技基础条件平台建设项目(2005DKA21006)。
作者简介　罗 佶(1983-),女 ,湖南株州人 ,硕士研究生, 研究方向:
植物分子生物学。 ＊通讯作者 ,教授 ,E-mail:sw-xml@hnu.
cn。
收稿日期　2007-07-19
　　翻白草[ 1](Discolor Cinquefoil Herb),又名天青地白 、白头
翁 、叶下白 、鸡腿苗 、结梨 ,为蔷薇科委陵菜属植物。翻白草
具有止血 、止痢 、解毒 、降血糖 、降血脂的作用[ 2] ,是一种重要
的中草药植物。对翻白草的研究 ,我国近期来多集中对其化
学成分的分析和对Ⅱ型糖尿病 、乳腺炎等疾病的治疗方面 ,而
对遗传多样性和亲缘关系的研究才进入初步阶段。
简单重复序列区间 ISSR(Inter simple sequence repeat)是由
Zietkiewicz等[ 3] 1994年发展的一种基于微卫星系列的新分子
标记技术 ,其随机分布于真核生物基因族内 ,显性标记 ,呈孟
德尔遗传 ,具有简便 、不需预先知道序列信息 、重复性强等特
点 ,广泛用于植物的分子标记和遗传育种[ 4] 。
运用 ISSR-PCR标记技术时 ,DNA 提取是至关重要的一
步 ,只有高质量的 DNA才能扩增理想的条带。而翻白草叶
片中含有较多的多糖 、脂类和酚类等次生代谢物 ,普通的提
取方法不适合 ,该研究在CTAB 法的基础上加以改进DNA纯
度和浓度满足PCR要求 。探讨了以先前提取的翻白草DNA
为模板 , ISSR-PCR中 6种因素对扩增的影响 ,以期获得翻白
草 ISSR的最佳体系 ,为翻白草的遗传多样性的研究提供科
学依据与基础。
1　材料与方法
1.1　试验材料
1.1.1　植物材料 。DNA提取材料采自北京中科院 、辽宁辽
阳 、湖南怀化和株洲等地 12个居群 ,取植物叶片置干净保鲜
袋中 ,带回实验室放于-70 ℃低温冰箱保存。
1.1.2　主要试剂和仪器 。离心机(德国 Eppendorf公司),纯
水器(美国Millipore公司);765P紫外可见分光光度计(上海
光谱仪器有限公司);T-GRADIENT PCR仪(德国 Biometra公
司);水浴锅 、电泳槽等(国产);MBI Taq 酶(晶美生物有限公
司);DNA Marker(北京天为时代科技有限公司)。
1.1.3　ISSR引物。50条引物参照加拿大哥伦比亚大学 UBC
公司 2006年公布的 ISSR引物序列(http://www.michaelsmith.
ubc.ca/services/NAPS/Primer_Sets/Primers_Oct2006.pdf)由上海
生工生物技术公司合成。
1.2　试验方法
1.2.1　翻白草 DNA 提取和浓度测定。参照传统的 CTAB
法[ 5] 和非洲菊花基因组 DNA提取方法[ 6] ,根据提取材料的
不同进行了适当的改进和优化。步骤:①采用改进的 CTAB
法 ,取幼嫩叶约 2g在液氮冷冻下研磨成粉末 ,加入到 3ml预
热至 94 ℃的 2×CTAB 提取缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl pH
值 8.0 , 20 mmol/L EDTA , 1.4 mol/L NaCl , 2%CTAB , 2%PVP ,
0.2%β-巯基乙醇 V/V),1 ml溶液 PB(10%CTAB ,10%PVP ,
5%NaCl), 500μl K溶液(10%Na2SO4 ,5%VC),0.02 g VE混
合溶液的 10 ml离心管中 ,混匀后 65 ℃水浴 1.5 h ,其间颠倒
翻转离心管若干次;②取出离心管冷却至室温 ,加入 500 μl
溶液 PB ,等体积氯仿/异戊醇(24/1 , V/V),混匀 ,后置于摇床
上来回震荡 1 h;③取出离心管后 6 000 r/min离心 30 min ,取
上清;④加入 1 ml溶液PB ,等体积氯仿/异戊醇(24/1 , V/V),
混匀后 6 000 r/min离心 10 min ,取上清;⑤加入-20 ℃预冷
的等体积异丙醇 ,轻柔混匀后静置 30 min ,出现絮状沉淀;⑥
用玻璃钩钩出絮状沉淀 ,转移至 1.5 ml离心管中 ,加入 70%
乙醇洗涤 2 ～ 3 次;⑦倒去乙醇 ,让 DNA 自然晾干 ,加入 500
μlTE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH值 8.0 , 1 mmol/L EDTA)
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008 , 36(3):895-897 , 901　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　朱新秀　责任校对　朱新秀
溶解 DNA ,加入 RNaseA 1 μl ,于 37 ℃恒温水浴 1 h;⑧加入
1/10体积的 3 moL/L NaAc ,并加入 2倍体积的无水乙醇 ,小心
混匀后 ,置-20 ℃ 60min ,DNA再次呈絮状沉淀析出 ,钩出置
1.5 ml离心管中;⑨70%乙醇洗涤 2～ 3次 ,倒去乙醇 ,自然晾
干 ,加入 100～ 200 μl TE缓冲液 ,4 ℃保存。采用 765 P紫外
可见分光度计检测 DNA浓度 , 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测
DNA质量。
1.2.2　ISSR-PCR体系的优化。该试验以翻白草基因组DNA
为模板 ,从 50 条引物中筛选出 3条重复性较好的引物
(UBC841 ,UBC842 ,UBC847)为代表 ,进行预备试验。根据预备
试验结果 ,对影响 ISSR-PCR的主要参数设置了不同梯度处
理。反应总体系为 25 μl ,其中DNA模板设 100、50 、20、10和 5
ng 5个梯度;Mg2+浓度设 1.0、1.5、2.0 、2.5 、3.0 mmol/L 5个梯
度;dNTPs浓度设 0.15 、0.20、0.25、0.30和 0.35 mmol/L 5个梯
度;Taq酶用量设了 0.5 、0.8、1.0、1.5 、2.0 U 5个梯度。另外
根据不同引物的Tm 值设 46 ～ 55 ℃退火温度 6个梯度 。
1.2.3　ISSR-PCR反应及其电泳检测。采用的反应程序:94
℃预变性 5min;94 ℃变性 30 s ,46 ～ 55 ℃(根据引物来定)退
火 45 s ,72 ℃延伸 1.5 min ,共循环 35次;然后 72 ℃后延伸 10
min;4 ℃保温 。将PCR产物在含有溴化乙锭(EtBr)染料染色
的 1.5%琼脂糖凝胶中电泳 ,电泳结束后在凝胶成像系统中
照相保存。
2　结果与分析
2.1　DNA提取与优化　该试验提取的 DNA呈米白色絮状
和无色沉淀(图 1),经紫外可见分光光度计测定 ,DNA的在
260和 280 nm的吸收度比值(A260/A280)为 1.76 ～ 1.85。经电
泳检测显示 ,所提取的DNA中蛋白质 、多糖和酚类等物质基
本祛除 ,纯度较高 ,符合 ISSR-PCR的要求 。
图 1　12种不同地区翻白草样品所提取的 DNA
Fig.1 DNA extracted from 12 species of Discolor cinquefoil Herb
fromdifferent regions
2.2　ISSR-PCR体系的优化
2.2.1　DNA 模板浓度的影响。DNA模板浓度是影响 ISSR-
PCR扩增效果的一个重要因子。模板浓度过低 ,扩增产物不
稳定或无扩增产物;模板浓度过高 ,又会相应增加非特异性
产物[ 7] 。试验设置 5个模板浓度梯度(分别是稀释 10 、20、50、
100、200倍)(图 2)参与PCR反应 ,结果显示:浓度为 5 ～ 10 ng
(稀释 100 ～ 200倍)时 ,扩增条带比较模糊;在 20～ 50 ng(稀释
20 ～ 50倍)之间条带清晰且扩增产物带型稳定;浓度为 100 ng
以上时 ,扩增产物带型不稳定。试验选择 20 ～ 30 ng(稀释 50
倍)为反应体系中模板的浓度 。
2.2.2　Mg2+浓度的影响。Mg2+浓度是影响 ISSR-PCR的一
个主要变量之一。作为Taq酶的辅助因子 , Mg2+浓度不仅影
响Taq 酶活性 ,还能与反应液中的 dNTPs、模板 DNA 及引物
结合 ,影响引物与模板的结合效率 、模板与 PCR产物的解链
温度以及产物的特异性和引物二聚体的形成[ 8] 。该试验根
据鱼腥草 ISSR-PCR体系设计了 5个Mg2+浓度来比较(图 3),
结果表明 ,Mg2+浓度为2.5mmol/L时 ,条带清晰且稳定 ,为最
佳浓度。而在 1.0～ 2.0 mmol/L时 ,条带稍模糊且不稳定 ,在
3.0 mmol/L时扩增的条带模糊且有非特异性扩增 。
注:1～ 5泳道 PCR反应的模板用量分别是 100 、50、20 、10和 5 ng。
Note:Template dosage for PCR reaction in lane 1～ 5 is 100 ,50 , 20 ,10 and
5 ng , resp.
图 2　DNA模板浓度对 ISSR-PCR的影响
Fig.2 Effects of DNA template concentration on ISSR-PCR
注:1～ 5泳道PCR反应的Mg2+浓度分别是 1.0、1.5 、2.0 、2.5和3.0
mmol/L。
Note:Mg2+concentration for PCR reaction in lane 1～ 5 is1.0, 1.5 ,2.0 ,
2.5 and 3.0 mmol/ L , resp.
图3　Mg2+浓度对 ISSR-PCR的影响
Fig.3 Effects of Mg2+ concentration on ISSR-PCR
2.2.3　dNTPs浓度的影响。dNTP是 ISSR-PCR反应的原料底
物。dNTP浓度过高 ,会导致聚合酶错误的掺入 ,过低又影响
合成效率 ,甚至会因 dNTP过早消耗而使产物单链化 ,影响扩
增效果[ 7 ,9] 。结果如图 4 所示 , dNTPs 浓度为 0.20 ～ 0.35
mmol/L时均有扩增产物 , dNTPs浓度为 0.25 mmol/L时扩增
的条带最为清晰 ,为最适浓度。
2.2.4　Taq酶单位量的影响。在PCR反应中 ,Taq 酶的单位
量也是影响PCR结果的重要因素 。使用高浓度的 Taq 酶不
仅增加试验成本 ,而且会导致非特异性产物增加 ,使用低浓
度的Taq 酶 ,则会使酶过早耗完 ,导致产物合成率下降[ 10] 。
结果表明(图 5),0.5～ 0.8 U时条带模糊不清 , 1.0～ 2.0 U时
条带清晰且重复性好 , 2.5 U时重复性不好 ,带型发生变化 。
因Taq 酶成本较高 ,在保证试验结果的前提下 ,选择 1.0 U为
最佳单位。
2.2.5　退火温度的影响。PCR反应的程序对PCR扩增效果
896 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年
注:1～ 5泳道 PCR反应的 dNTPs浓度分别是0.15 、0.20、0.25 、0.30
和 0.35 mmol/ L。
Note:dNTP concentration for PCR reaction in lane 1～ 5 is 0.15 , 0.20,
0.25, 0.30 and 0.35mmol/ L , resp.
图4　dNTPs浓度对 ISSR-PCR的影响
Fig.4 Effects of dNTPs concentration on ISSR-PCR
至关重要 ,不同物种的扩增程序有所不同。退火温度明显影
响 ISSR-PCR扩增谱带式样。退火温度可由引物的 Tm 值确
定 ,退火温度为(Tm 值±3)℃[ 11] 。根据原初的 PCR反应条
件进行引物的初筛 ,选择能看到清晰条带的引物进行退火温
度的测定(图 6)。根据公式 Tm =4(G+C)+2(A+T)[ 12] ,
UBC841的 Tm 为 55 ℃,试验结果表明 ,退火温度为 52 ℃时
条带最清晰且特异性较高。
注:1～ 5泳道PCR反应的Taq酶单位量分别是 0.5、0.8、1.0 、1.5和
2.0 U。
Note:Taq polymerase unit for PCR reaction in lane 1～ 5 is 0.5 , 0.8,
1.0 , 1.5 and 2.0 U , resp.
图 5　Taq 酶单位量对 ISSR-PCR的影响
Fig.5 Effects of Taq polymerase on ISSR-PCR
　　最后 ,确立翻白草的 ISSR-PCR体系为 25 μl(图 7):1×
Buffer缓冲液 , 1 U Taq DNA 聚合酶 , 2.5 mmol/L Mg2+ , 0.25
mmol/L dNTP ,0.4μmol/L引物 ,DNA模板 20～ 30 ng ,退火温
度 50～ 56 ℃。反应循环参数为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变
性 30 s ,50～ 56 ℃(根据引物来定)退火 45 s ,72 ℃延伸 1.5
min ,共循环 35次;然后 72 ℃后延伸 10 min;4 ℃保存 。
3　讨论
翻白草是一种重要的中草药 ,其新鲜材料的叶片中含有
较多的酚类 、多糖等次生代谢物 ,用传统的 SDS和CTAB 法提
取DNA时 ,酚类 、多糖等物质包裹并结合了部分DNA ,使其
不能释放 ,严重影响了 DNA的纯度 ,达不到 ISSR-PCR的要
求。参照 Couchu 等[ 5] 和李宗菊等[ 6] 提取 DNA 的方法 ,对
CTAB法进行了一些优化及综合 ,即在提取缓冲液中加入的
PB溶液 、K溶液 、VE及β-巯基乙醇。PB溶液中的PVP是酚
的络合物 ,能与多酚形成一种不溶的络合物质 ,有效地去除
多酚 ,减少酚的污染。PVP 、CTAB 和NaCl 组成的 PB溶液能
够有效地去除多糖。K溶液中的VC、VE 及 β-巯基乙醇都是
抗氧化剂 ,其作用都是与多酚物质竞争氧 ,有效地防止酚氧
化成醌 ,避免褐变[ 6] 。而 K溶液中的Na2SO3 是酶活性中心
抑制剂 ,可使酶的活性减弱 ,当酚氧化酶活性受到抑制时 ,避
免了酚氧化成醌 ,使酚容易去除。此外 ,在氯仿/异戊醇
(24/1 ,V/V)抽提中再次加入了 PB溶液 ,抽提两次后不仅将
蛋白质祛除干净 ,也使得酚类 、多糖等次生代谢物质进一步
祛除 ,所提取的DNA完全符合 ISSR-PCR的要求 。
注:引物为UBC841, 1～ 6泳道 PCR反应的退火温度分别为 48、50 、
52 、54、56和 58 ℃。
Note:The primers is UBC841, anneal temper ature of lane 1～ 6 are 48 ,
50 , 52 ,54, 56 and 58 ℃, resp.
图6　退火温度对 ISSR-PCR的影响
Fig.6 Effects of anneal temperature on ISSR-PCR
注:M为 Marker , MD107 分子量从下往上依次为:300 、500、1 000 、
1 500 、2 000 、2 500 bp ,1～ 12泳道对应相同序号DNA 模板。
Note:M indicates Marker , molecular weight of MD107 upgrade is 300 ,
500 ,1 000 ,1 500, 2 000 and 2 500 bp , resp.Lane 1～ 12 indicate
same number.of DNA template.
图7　引物 UBC821对 12份翻白草的 ISSR-PCR扩增结果
Fig.7 Amplification results of ISSR-PCR on 12 species of Discolor
cinquefoil Herb by primer UBC821
ISSR技术是基于PCR上的一种分子标记技术 ,与 RAPD
技术相比 ,操作难度相应加大 ,但一般来说 ISSR 技术比
RAPD技术更稳定 、多态性更高[ 13] 。但 ISSR技术也受反应条
件和扩增程序变化以及物种的不同的影响 ,从而影响遗传分
析的准确性。影响 ISSR-PCR的重要因素包括DNA模板的浓
度 、Mg2+浓度 、dNTPs浓度 、Taq酶单位量和退火温度 。试验
发现 ,ISSR反应对DNA模板浓度不太敏感 ,但DNA模板纯度
对扩增的稳定性有较大影响 ,所以对提取 DNA的方法进行
优化。TaqDNA聚合酶的使用量是影响 ISSR扩增结果的重
要因素 ,因为不同厂家生产的Taq 酶性能上有差异 ,而且同
一厂家不同批次的产品也存在一定的差异[ 14-15] ,为了减少
(下转第 901页)
89736卷3期　　　　　　　　　　　　　　　罗 佶等　翻白草总 DNA的提取与 ISSR-PCR体系的建立与优化
增出 309条DNA带 ,其中多态性带 288条 ,平均多态性比率
为 93.2%。该研究中 , 5条 ISSR引物在 25个供试烟草种质
中共扩增出 100个位点 ,其中多态性位点 76个 ,平均多态性
比率 76.0%。以上研究表明 ,ISSR分子标记具有较好的稳定
性和准确性 ,因而适于种质资源的遗传多样性分析 。
在 ISSR分析过程中 , PCR反应与Mg2+浓度 、退火温度 、
模板浓度等有着相当程度的联系 ,所以优化实验条件以获得
最佳扩增效果是很有必要的。在该实验中 ,参考前人的研究
结果 ,在 PCR反应体系中加入 2%的去离子甲酰胺[ 7] ,1%的
甘油或者 0.5 mmol/L的亚精胺[ 8] 都能够在一定程度上起到
消除背景的作用;而在体系中加入 2%～ 4%的 DMSO (二甲
基亚砜)[ 9] 能提高 PCR反应的特异性。该研究结果表明 ,在
制作聚丙烯酰胺凝胶的时候 ,加入 0.8%～ 2.0%的甘油同样
能消除背景 ,有利于扩增产物的辨别。
供试材料之间的遗传相似性系数及进化树(图 1)分析表
明 ,3个野生烟种质 N.gossei ,N.glutinsa以及 N.plumbaginfo-
lia具有很高的遗传多样性 。野生烟 N.plumbaginfolia 、N.
glutinsa 、N.gossei 与 22个栽培烟草的平均相似性系数分别
为 0.433 、0.453、0.495。尽管 N.glutinsa 与普通烟草(N.
tabacum)都属于普通烟草亚属 ,而 N.gossei 属于碧冬烟草亚
属 ,普通烟草与 N.gossei 的遗传相似性更高 ,这从另一方面
证明碧冬烟草是普通烟草的祖先之一 。我国所种植的烟草
品种相当一部分是由美国优良烟草品种选育或杂交而成的 ,
比如供试材料中“云烟 87”的父本是美国品种“K326” , “辽烟
14”的父本是美国品种“Coker-86”。该研究中 ,烤烟“红大”与
美国烟草种质“K346”以及“云烟 87”与“NC82” 、“Coker 176”的
遗传相似系数都大于 0.870。何川生等[ 10]的研究也证实了国
内所种植的大部分烟草都与美国的烟草有较近的亲缘关系。
一些地理位置差异较大的烟草品种因为育种亲本之一相同
或亲缘关系较近而在多样性分析中被聚为一类 ,许明辉
等[ 11]在研究中也发现同样的现象。然而同一类型的材料在
聚类分析中也不一定聚到一起 ,在该研究中 ,同属于白肋烟
的“KY12”和“B22”没有聚到同一个亚类中 ,这可能与两者亲
本的遗传差异有关。
除了 3个野生烟种质 ,其他 22个栽培烟草种质资源的
亲缘关系相对较近 ,说明现有栽培烟草品种的遗传基础比较
狭窄 。究其原因 ,一方面可能是我国在烟草育种时亲本选择
比较集中;另一方面 ,烟草是自花授粉作物 ,外来基因的引入
很少 ,因而自然产生的变异很小。野生烟与栽培烟草之间的
遗传相似性系数相对较低 ,说明不同烟草种间还是存在着十
分可观的遗传分化。因此在今后的育种工作中 ,可以考虑引
入这些野生烟的优良基因来拓宽栽培烟草的遗传基础 ,培育
出优良的烟草品种用于农业生产。
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(上接第 897页)
试验误差 ,该试验中使用的是同一厂家同一批次的Tag 酶。
对于退火温度来说 ,不同物种 、不同引物 、退火温度不同。为
减少非特异性扩增 ,可在允许范围内适当提高引物的退火温
度[ 16] 。Mg2+浓度直接影响 ISSR扩增结果 ,不同材料 、不同引
物的Mg2+浓度需要通过试验来确定。此外 ,由于 dNTP直接
螯合相应数量的 Mg2+ ,其浓度的任何改变都会影响有效
Mg2+的浓度[ 17] ,根据鱼腥草 ISSR-PCR体系采用单因子试验 ,
可以较为快速直观地得出该因子对试验结果的影响。需要
指出的是 ,单因子试验不能体现各因子间的相互效应 ,所以
在具体试验中可做进一步优化 ,以期达到最佳结果 。
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90136卷 3期　　　　　　　　　傅冰等　利用 ISSR分子标记对 25个烟草种质资源的遗传多样性分析