全 文 ：第 29卷第 6期 江 西 农 业 大 学 学 报 Vol.29, No.6
2007年 12月 ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis Dec., 2007
文章编号:1000-2286(2007)06-1021-05
华东黄杉 ISSR引物反应体系的优化与筛选
刘晓燕 1, 2 ,鲁顺保 1 ,江玉梅 1 , 李思光2 ,朱　笃 1＊ ,陈　晖 3
　　(1.江西师范大学 生命科学学院 , 江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室 , 江西 南昌 330022;2.南昌大学
生命科学学院 , 江西 南昌 330047;3.江西省三清山风景名胜区管理委员会 ,江西 上饶 334000)
摘要:在研究华东黄杉(PseudotsugagausseniFlous)的遗传多样性过程中 , 为了获得清晰 、重复性好的 ISSR扩增
结果 ,对影响 ISSR-PCR的多个因素包括模板浓度 、Mg2+浓度 、dNTPs浓度 、Taq酶的用量 、退火温度和循环次
数等指标进行了筛选和优化 ,确定了华东黄杉 ISSR-PCR分析的最佳扩增条件为:20 μLPCR反应体系中 , 2
μL10×Taq酶配套缓冲液 , 1.5 UTaq聚合酶(上海 Promega公司), 1.5 ～ 2.5mmol/LMgCl2 , 0.2μmol/L引物 ,
0.2 mmol/LdNTPs, 10 ng/L模板 DNA。用来自江西三清山的 4个个体 , 以 100个 ISSR引物进行 PCR扩增 , 筛
选出扩增效果较好的 12个引物。
关键词:华东黄杉;ISSR;引物筛选
中图分类号:S791.16　　文献标识码:A
OptimizationofExperimentConditionsandPrimerScreeningwith
ISSRMarkersforPseudotsugagausseni
LIUXiao-yan1, 2 , LUShun-bao1 , JIANGYu-mei1 ,
LISi-guang2 , ZHUDu1＊ , CHENHui3
(1.ColegeofLifeSciences, JiangxiNormalUniversity, JiangxiProvincialKeyLabofProtectionandUti-
lizationofSubtropicPlantResources, Nanchang330022, China;2.ColegeofLifeSciences, NanchangUni-
versity, Nanchang330047, China;3.ManagementCommiteeofSanqingshanMountain, JiangxiProvince,
Shangrao334000, China)
Abstract:ThefactorswhichafectthePCR-ISSRanalysisinthestudyofthegeneticdiversityofPseud-
otsugagauseniFlous, suchasconcentrationsoftemplateDNA, unitsofDNATaqpolymerase, Mg2+ concen-
trationanddNTPsconcentrationwereoptimized.TheoptimalISSR-PCRconditionsintheexperimentswere
asthefolowingin20μLPCRreactionsystem:2μL10×DNATaqpolymerasebufer, 1.5 UTaqDNApoly-
merase, 1.5 ～ 2.5 mmol/LMgC12 , 0.2 μmol/Lprimer, 0.2 mmol/LdNTPs, 10 ng/LtemperDNA.One
hundredISSRprimerswereusedtoscreenthesuitableprimerswith4 samplesfromdiferentpopulationsin
SanqingshanmountainforassessingthegeneticdiversityofP.gauseni, ofwhich12ISSRprimerswithhigh
resolutionandmultiplepolymorphicbandswerescreened.
Keywords:PseudotsugagausseniFlous;ISSR;primerscreening;
简单重复序列区间扩增多态(Inter-simplesequencerepeats, ISSR)DNA分析建立在 PCR反应基础
上的一种新的分子标记技术。它是 Zietkiewicz等 [ 1]于 1994年提出 ,具有操作技术简单 、成本低 、快速
灵敏 、多态性高 、所需 DNA量少以及不需要预知基因组序列 ,检测多态性能力强等优点 ,同时也具有
收稿日期:2007-08-09　　　修回日期:2007-10-23
基金项目:江西省自然科学基金资助项目(0430014)
作者简介:刘晓燕(1982-), 女 ,硕士生 , 主要从事植物分子生物学研究;＊通讯作者:朱笃 , E-mail:zhudul2@163.
com。
SSR的稳定性[ 2] ,已成功地运用于居群生物学 、品种鉴定 、遗传作图 、基因定位 、分类 、进化及遗传多样性
等方面的研究[ 3 ～ 5] 。由于每条引物并不适合于所有的物种 ,且不同的引物所要求的反应条件也不相同 ,
因此为了确保 ISSR分析结果的可靠性和重复性 ,在运用 ISSR标记技术时对引物的反应条件优化和筛
选是非常必要的 。
华东黄杉(P.gausseni)属松科黄杉属植物 ,是我国华东地区特有的珍贵树种 、国家二级重点保护
植物 ,对研究植物区系有一定的学术意义 。由于华东黄杉硬度适中 ,理纹直 ,不翘不裂且耐久用 ,可作为
上等的用材树种 ,具有较高的应用价值 [ 6, 7] 。本研究以华东黄杉的 DNA为模板 ,分析了 ISSR反应体系
中模板 DNA浓度 、Mg2+浓度 、dNTPs浓度 、TaqDNA聚合酶含量 、退火温度和循环次数对 PCR结果的影
响 ,建立了适合于华东黄杉的 ISSR反应最佳体系。据此对 100条引物进行筛选 ,为深入研究华东黄杉
种群的遗传多样性和保护遗传学奠定了良好的基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
华东黄杉样品分别采集于江西三清山神龟探海 、泸泉井 、巨蟒出山 、锯解石等地 。材料采后立即放
在自封袋中 ,用变色硅胶干燥 ,带回实验室后置于 -70 ℃超低温冰箱中保存备用 。
1.2　实验仪器与药品
TaqDNA聚合酶 、Mg2+、dNTPs等购于上海 Promega公司;ISSR引物 、100 bpDNALadder等购于上
海生工公司;TC-96/H/G型 PCR仪(杭州博日科技有限公司);电泳仪及电泳槽(北京六一厂);UPV-
8000凝胶成像系统(美国 Ultra-VioletProductsLtd);2000型＆UV型分光光度计(上海尤尼柯仪器有限
公司)。
1.3　DNA的提取及检测
采用改进后的 CTAB微量法[ 8, 9]提取总 DNA后 ,用紫外可见分光光度计测定 DNA纯度和含量 。 8
g/L琼脂糖凝胶电泳检测所提取 DNA的质量。置于 -20 ℃保存备用。
1.4　PCR反应体系与引物筛选
本实验采用的初步 PCR扩增程序为 94℃变性 5min, 1个循环;94℃变性 30s, 52℃退火 45s, 72℃延
伸 2min, 40个循环;最后再 72℃延伸 5min, 1个循环 ,扩增产物在 4℃保存。 PCR产物用 1.5g/L琼
脂糖凝胶电泳检测 ,以 100 bpMarker作为标准分子量对照 ,紫外凝胶自动成像仪照相。参照 Ge＆
Sun[ 3]的 ISSR-PCR反应体系中各成分的含量 ,对可能影响扩增条带清晰度和多态性的因子 ,如 DNA
模板的含量 、Mg2+浓度 、dNTPs浓度 、TaqDNA聚合酶的含量 、退火温度等进行交叉实验 ,据此筛选出华
东黄杉 ISSR-PCR反应的优化体系 。
选取具有地理代表性即不同海拔高度的 4个居群(神龟探海 、泸泉井 、巨蟒出山 、锯解石),每个居
群取 1个个体 ,分别以 4个个体基因组 DNA作为模板 ,从 100条 ISSR引物中进行筛选并进行可重复性
实验 ,筛选能扩增出清晰的 、可重复性且多态性较好的引物。
2　结果与分析
2.1　DNA模板浓度优化
本实验采用改良后的 CTAB法对华东黄杉基因组进行提取 ,取得了较好的总 DNA,电泳图所显示
的 DNA带型完整 ,清晰一致 ,无明显降解(图 1)。在紫外分光光度计上检测其纯度 , 8 g/L的琼脂糖凝
胶电泳检测其质量。
DNA模板的含量是影响扩增产物及其特异性的一个重要因素 ,模板中含有一定量的 RNA和少量
的蛋白质不会对扩增结果产生明显影响 ,但为避免模板中含有 Taq酶抑制剂 ,应尽量纯化模板。本实验
在 20 μL反应体系中 ,设置了 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 ng质量梯度 ,图 2显示了不同模板质量
浓度以引物 836、811扩增的结果。从图 2可知 ,模板 DNA适宜浓度有一较大范围 。当模板 DNA的量
为 5 ng时 ,扩增产物条带比较弱;当模板 DNA的量为 10 ～ 100 ng时 ,扩增产物条带均比较好 。因此本
实验选用用量较少的 10 ng作为 PCR反应的用量。
·1022· 江 西 农 业 大 学 学 报 第 29卷　
2.2　Mg2+浓度优化
Mg2 +浓度是影响 PCR结果的重要因素之一。 TaqDNA聚合酶是对 Mg2+依赖性酶 ,对 Mg2+浓度非
常敏感 ,选择合适的 Mg2+浓度 ,对 PCR反应至关重要。在一般的 PCR反应中 , 1.5 ～ 2.0 mmol/LMg2+
是比较合适的浓度范围[ 10] 。本实验设置了 1.0 , 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.25 mmol/L共 6个梯度 ,实验结果
见图 3。
图 3　不同浓度的 dNTP及 Mg2+的扩增结果
Fig.3　TheresultsofPCRamplificationwith
differentconcentrationofdNTPandMg2+
注:1 ～ 5:dNTP浓度分别为 0.1, 0.15 , 0.2, 0.25, 0.3
mmol/L;6 ～ 11:Mg2+浓度分别为 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0,
3.25 mmol/L。
图 4　不同的 Taq酶量及循环次数的扩增结果
Fig.4　TheresultofISSRamplificationwithdifferent
amountofTaqDNApolymeraseandcirclingtimes
注:1 ～ 5:Taq酶量分别为 0.5, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0 U;
6:空白对照;7 ～ 10:循环次数为 45, 40, 40, 35。
　　不同的引物 ,不同的物种 ,对反应体系中 Mg2+浓度要求可能不同 。实验发现 , Mg2+浓度为 1.0
·1023·　第 6期 刘晓燕等:华东黄杉 ISSR引物反应体系的优化与筛选
mmol/L时无扩增产物出现;浓度为 1.5 ～ 2.5 mmol/L时能扩增出清晰稳定的条带 ,且无非特异性扩增;
在浓度为 3.0、3.25 mmol/L时 ,虽然也能得到扩增条带 ,但扩增条带不稳定且背景模糊 。因此 ,在华东
黄杉的 ISSR分析中 , 1.5 ～ 2.5mmol/L是 Mg2+的合适浓度 。
2.3　dNTP浓度优化
dNTP是 PCR反应的原料 ,浓度过高会导致聚合酶错误掺入 ,浓度过低又会影响合成效率。在 PCR
反应中 , dNTP浓度一般在 0.02 ～ 0.2mmol/L[ 10] 。本实验设计了 0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L5个
梯度的 dNTP浓度 ,扩增的结果见图 3。结果表明 , 0.1 ～ 0.3mmol/L的 dNTP浓度范围内均有扩增产物 ,
0.1、0.15mmol/L扩增产率低且信号弱;而 0.2 mmol/L时 ,扩增产率最高且稳定 。所以华东黄杉的 IS-
SR分析 dNTP浓度选用 0.2mmol/L。
2.4　TaqDNA聚合酶浓度优化
在 PCR反应中 , Taq酶的使用量是直接影响实验扩增结果的一个重要因素 。使用高浓度的 Taq酶
不仅成本高 ,而且容易产生非特异性扩增产物;而 Taq酶浓度过低则会导致产物的合成效率下降 。一般
随机扩增反应中 , Taq酶的用量在 0.5 ～ 5 U之间 [ 10] 。基于此 ,本实验设置了 0.5、1.0 、1.25 、1.5 、2.0
U共 5个 Taq酶含量梯度进行实验 ,结果(图 4)表明 , 0.5 U无扩增产物 , 1.0 ～ 2.0 U均有扩增产物出
现 ,条带逐渐清晰稳定 。由于使用高浓度的 Taq酶成本高 ,在华东黄杉的 ISSR分析时 Taq酶的使用量
选用 1.5 U为佳 。
2.5　循环次数对 ISSR-PCR的影响
PCR的循环次数决定扩增产物产量 ,次数太少 ,产量极低 ,次数太多 ,进入到反应平台期后 , PCR产
物也不会有明显的增加 ,反而引起非特异性扩增。本实验进行了 35、40和 45次循环 3种尝试 ,试验结
果(图 4)表明 , 35次循环时 ,扩增产物不稳定 ,条带弱背景模糊;40和 45次循环时 ,扩增结果一致 ,带型
稳定且清晰 。因此在本实验中 , 40次循环已经达到要求。
2.6　退火温度对 ISSR-PCR的影响
在 ISSR-PCR扩增中 ,退火温度将明显影响扩增带的式样 ,引物的碱基种类和序列长短不同使得
引物的退火温度也不相同。提高退火温度可减少引物与模板的非特异性结合 ,进而提高 PCR反应的特
异性 ,而降低退火温度则可提高扩增产量。基于此 ,本实验对引物 876、879、811设置了 44, 46, 48, 50,
52 , 54, 56 ℃共 7个温度梯度 ,研究退火温度对 PCR结果的影响(表 1)。根据公式 Tm =4(G+C)+2(A
+T)计算 [ 10] ,引物 876理论退火温度为 44℃,引物 879的理论退火温度为 38 ℃。但在华东黄杉 ISSR
-PCR反应中 ,扩增带型并不理想 。本实验中引物 876在退火温度为 46 ℃,引物 879退火温度为 46℃
时扩增条带清晰 ,重复性好 。同时其它所选引物的理论退火温度和实际退火温度存在较大的差异。这
分别与余艳等[ 11]所用 ISSR研究沙冬青遗传多样性以及朱柏芳等 [ 12]穗花杉 ISSR反应条件的优化与筛
选中的研究结果相似 。
表 1　退火温度对 PCR结果的影响
Tab.1　EfectsofannealingtemperatureonPCRresults
引物 退火温度 T/℃
44 46 48 50 52 54 56
876 + ++ +/- - - - -
879 + ++ +/- - - - -
811 - - +/- ++ +/- - -
　　注:+:有扩增产物;++:扩增效率高;+/-:扩增产物不稳定;-:无扩增产物。
根据上述实验结果 ,我们得出华东黄杉 ISSR-PCR反应条件优化结果为:在 20 μL的反应体系中 ,
10×Bufer缓冲液 2 μL,模板 DNA用量为 10 ng, Taq酶 1.5U, Mg2+浓度为 1.5 ～ 2.5 mmol/L, dNTP浓
度为 0.2 mmol/L,引物浓度为 0.2 μmol/L。按照此体系筛选上海生工公司合成的 100条引物 ,经过最
佳温度调试 ,可重复性实验 ,共筛选出 12条扩增条带数多 、条带清晰 、可重复性好 、多态性丰富的华东黄
杉 ISSR引物(表 2)。 ISSR-PCR反应体系条件优化后 ,可用于华东黄杉的遗传多样性的检测。
·1024· 江 西 农 业 大 学 学 报 第 29卷　
3　讨 论
PCR扩增条件的变化会对图谱产生较大的影响 ,从而影响 ISSR分析的准确性和稳定性 ,因此为了
获得重复性好 、可靠性高的 ISSR图谱 ,对华东黄杉 ISSR-PCR扩增条件的各因素进行了优化。另外 ,
对同一物种 ,选用不同的引物进行扩增 ,其退火温度不同 ,故根据引物的理论退火温度 ,设计几个温度梯
度 ,反复试验 ,选出最适合的退火温度;再对引物进行筛选 ,进行重复性实验 ,建立重复性好 、分辨率高 、
多态性丰富的 ISSR-PCR反应体系 。
表 2　12条 ISSR引物序列和最佳退火温度
Tab.2　Sequencesof12 ISSRprimersandsuitableannealingtemperature T/℃
引物序号 退火温度 理论温度 引物序号 退火温度 理论温度
AW92009 45 38 CW16279 52 55
CW16331 46 44 AW92005 51 54
CW16323 47 48 CW16334 54 62
CW16328 47 51 AW92004 54 56
AW92010 48 53 CW16273 52 55
AW91999 50 53 CW16316 60 67
　　本实验证实了模板 DNA的质量浓度不会影响扩增结果。这和冯富娟等 [ 13]在研究红松 ISSR-PCR
影响因素时得出的结论大致相似 ,模板浓度在 10 ～ 100 ng之间扩增结果基本一致。说明 ISSR-PCR对
模板浓度的要求范围较宽 ,具有很好的可重复性和稳定性。
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