全 文 ：第 30卷 第 4期
2011 年　8 月
华　中　农　业　大　学　学　报
Journal o f Huazhong Ag ricultural Unive rsity
Vo l.30　No.4
Aug.2011 , 432～ 437
收稿日期:2010-12-09
基金项目:国家自然科学基金项目(30901130)
杨琴军 ,博士研究生 ,讲师.研究方向:生物多样性保护 、园林植物种质资源创新及园林植物应用研究.E-mail:yangqj@mai l.hzau.edu.cn
通讯作者:陈龙清 ,教授.研究方向:园林植物种质资源保护 、创新与应用.E-m ail:ch enlq@m ail.hzau.edu.cn
台湾杉 ISSR反应体系的建立及检测
杨琴军1 　袁继林2 　付　强1 　陈龙清1
1.华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室 , 武汉 430070;
2.贵州雷公山国家级自然保护区管理局 ,雷山 557100
摘要　在保持 1 U Taq 酶和 0.2 mmo l/ L dNTP 两个条件不变的情况下 , 通过对模板 DNA 的浓度 、引物浓
度与 Mg2+浓度的筛选 ,建立了台湾杉的优化 ISS R反应体系 ,即在 25 μL 的反应体系中 ,含有 40 ng 模板 DNA 、
1 U Taq酶 、0.2 mmo l/ L dNTP 、0.4 μmo l/ L 引物 、1.8 mmo l/ L M g2+、2.5 μL 10×buffe r。扩增程序为:94 ℃,
4 min;94 ℃, 45 s , 51～ 56 ℃, 45 s , 72 ℃, 2 min , 40 个循环;72 ℃, 7 min。利用这种优化的反应体系 ,筛选出了
10 条稳定性强 、清晰度高并表现出一定多态性的 ISS R引物 , 并进一步筛选出了这 10 条引物的最佳退火温
度。应用这些引物对分布于湖北利川市星斗山保护区的台湾杉野生居群的 20 个样品进行了扩增 , 结果表明 ,
利川星斗山台湾杉居群的多态位点百分率为 61.97%, Nei s 基因多样性和 Shannon s 信息指数分别为
0.136 9和 0.216 0。
关键词　台湾杉;ISSR;PCR条件;反应体系;引物筛选
中图分类号　S 791.280.4　　文献标识码　A　　文章编号　1000-2421(2011)04-0432-06
　　台湾杉(Taiwania cryptomerioides Hayata)又
名秃杉 ,属杉科台湾杉属 ,是特产于我国的一种古老
濒危的孑遗植物 ,国家一级保护树种 ,生长快 、寿命
长 、材质优良 ,而且四季常绿 、树形优美 ,是优良的用
材树种 、造林树种和庭园绿化树种;台湾杉也具有较
高的药用价值[ 1] 。由于生境破坏 、自身繁育习性等
原因 ,台湾杉的野外居群规模越来越小 ,处于濒危的
边缘 ,亟待保护[ 2] 。
国内外对台湾杉的研究主要集中在解剖学 、胚
胎学 、细胞学 、生态地理分布 、群落和种群特征 、引种
和繁殖栽培以及组织培养等方面[ 3-7] ,分子水平的研
究很少[ 8-9] 。Zie tkiew icz等[ 10] 提出的简单序列重复
区间(inter simple sequence repeat , ISSR)DNA 标
记技术 ,结合了 SSR和 RAPD的优点 ,具有引物设
计简单 、利用率高 、稳定性好 、多态性丰富 ,而较之
AFLP 又具技术要求较低 、操作简便快捷等优点 。
近年来 ISSR 已广泛应用于品种鉴定与分类[ 11-12] 、
遗传图谱构建[ 13-14] 和种群的遗传结构评价及遗传多
样性研究[ 9 , 15-18] 等领域。
对于一些居群数目多 、分析样本数量大而遗传
背景又不清楚的濒危植物 ,可优先考虑选择 ISSR
标记进行居群遗传多样性研究 。本研究对影响台湾
杉 PCR反应体系的条件进行了筛选 ,建立并优化台
湾杉的 ISS R反应体系 ,筛选出合适的引物并检测
其有效性 ,为进一步开展台湾杉的保育遗传学研究
奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
供试材料采自湖北省利川市星斗山国家级自然
保护区境内的台湾杉残遗分布区 ,具体采样地点见
杨琴军等[ 19] 的报道。随机选取 20株成年大树 ,取
其新梢嫩叶 ,置于加入了足量硅胶干燥剂的塑料袋
中密封 ,带回实验室后置于-70 ℃的冰箱中保存 。
反应体系筛选的模板为 LC-5(随机从利川居群选
取)。引物筛选时则采用来自 2 个不同地区居群的
样品 LC-5和 LS-32(随机从贵州雷公山雷山县台湾
杉野生居群选取)。
1.2　试　剂
所用10 ×PCR buffer、MgCl2 、Taq DNA 聚合酶 、
dNTP 、购于 MBI Fermantas公司 ,D3000Marker购于
上海英俊公司。引物序列由加拿大哥伦比亚大学
　第 4 期 杨琴军 等:台湾杉 ISSR反应体系的建立及检测 　
UBC 公司提供 ,引物合成由 Invit rogen 公司完成 。
其他试剂购于上海国药公司 ,为分析纯 。
1.3　DNA提取和检测
参见文献[ 20] 。
1.4　PCR反应体系的优化
模板 DNA 的浓度 、Taq酶的用量 、引物浓度 、
Mg
2+浓度及 dN TP 浓度等因素都会影响扩增的结
果。经过多次试验比较发现每个 PCR反应(反应体
系为 25 μL)加 1 U Taq酶和 0.2 mmo l/L dN TP ,
扩增结果比较好。
因此 ,在保持这 2个条件不变的情况下 ,对引物
浓度 、Mg 2+浓度及模板 DNA 的浓度设置三因素
2 ～ 3个水平完全组合试验(表 1)。反应体系筛选的
模板为 LC-5 ,引物为(AG)8 T 。
表 1　ISSR-PCR 反应体系的筛选
Table 1　The selection of the optimal ISSR-PCR recation system
体系编号
Num ber of sy stem
模板 DNA 的用量/ ng
Content of template DNA
引物浓度/(μm ol/ L)
Concent ration of primer
Mg2+浓度/(mmol/ L)
Concent ration of M g2+
体系 1 Sy stem 1 20 0.2 1.5
体系 2 Sy stem 2 20 0.2 1.8
体系 3 Sy stem 3 20 0.2 2.0
体系 4 Sy stem 4 20 0.3 1.5
体系 5 Sy stem 5 20 0.3 1.8
体系 6 Sy stem 6 20 0.3 2.0
体系 7 Sy stem 7 20 0.4 1.5
体系 8 Sy stem 8 20 0.4 1.8
体系 9 Sy stem 9 20 0.4 2.0
体系 10 Sy stem 10 40 0.2 1.5
体系 11 Sy stem 11 40 0.2 1.8
体系 12 Sy stem 12 40 0.2 2.0
体系 13 Sy stem 13 40 0.3 1.5
体系 14 Sy stem 14 40 0.3 1.8
体系 15 Sy stem 15 40 0.3 2.0
体系 16 Sy stem 16 40 0.4 1.5
体系 17 Sy stem 17 40 0.4 1.8
体系 18 Sy stem 18 40 0.4 2.0
1.5　引物筛选和最佳退火温度的确定
选取来自 2个不同居群的样品 LC-5和 LS-32 ,
采用优化的反应体系 、较低的退火温度 52 ℃, 对
ISS R引物进行初步筛选。
由于每条引物的最佳退火温度不一样 ,选择
51 、52 、53 、54 、55 、56 ℃等 6个退火温度 ,对初步筛
选出来的引物进一步进行退火温度的比较试验 ,以
确定每个引物的最佳退火温度 。选择能扩增出清
晰 、稳定条带的引物用于所有样品分析 。
1.6　PCR扩增程序及产物检测
扩增程序:94 ℃, 4 min;94 ℃,45 s ,51 ～ 56 ℃,
45 s ,72 ℃,2 min ,40个循环;72 ℃, 7 min 。扩增在
PE9600型 PCR仪上进行 。
产物检测:以 1×TAE 为电泳缓冲液 ,取 10 μL
的扩增产物在含有 0.5%EB的 1.8%琼脂糖凝胶上
电泳 2 h 左右(5 V/cm)。采用 DNA 标准样品
Marker:100 bp DNA Ladder ,分子质量范围 100 ～
3 000 bp 。电泳结束后利用 Gel-Logic 200凝胶扫描
成像系统拍照并保存 。
1.7　结果统计与数据分析
PCR产物统计:电泳图谱中的每 1条带(DNA
片段)作为 1个分子标记 ,并代表 1 个引物结合位
点。根据各分子标记的迁移率及其有无计算所有位
点的二元数据:显带计为“1” ,无带计为“0” 。强带和
弱带均赋值为“1” 。
基因多样性的度量:运用 POPGENE32 软件计
算 Nei s基因多样性指数 He[ 21] 和 Shannon 信息指
数 I[ 22] 。
2　结果与分析
2.1　优化的 ISSR反应体系
通过对上述 18个反应体系的 PCR扩增产物的
琼脂糖凝胶电泳检测 ,观察比较电泳图谱 ,确定体系
17的扩增效果最好 ,即在 25 μL 的反应体系中 ,含
有 40 ng 模板 DNA 、1 U Taq 酶 、0.2 mmol/L
dN TP 、0.4 μmo l/L 引物 、1.8 mmol/ L M g2+ 、2.5
μL 10×buf fer 。
433
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 30 卷　
2.2　引物筛选和退火温度筛选
利用优化的 ISSR反应体系 ,从 38个 ISS R引
物中筛选出了 10个引物 ,引物的序列及最佳的退火
温度见表 2。重复试验表明:这 10个引物均能够扩
增出清晰 、重复性好 、多态性高的条带 ,可用于台湾
杉的 ISSR分析(图 1)。
表 2　筛选出的 10 个 ISSR引物的序列 、退火温度及多态性片断数1)
Table 2　The sequence , annealing temperature and the number of polymorphic loci of selected 10 ISSR primers
引物序号
Primer
引物序列
Sequ ence1)
退火温度/℃
Annealing temperatu re
扩增总带数
No.of total bands
多态性带数
No.of polymorphic b ands
ISR1 (AG)8 T 52 9 6
ISR3 (AG)8YT 52 7 3
ISR4 (AG)8C 55 3 2
ISR6 (AG)8YC 52 8 7
ISR7 (AG)8YA 52 8 4
ISR9 (AC)8YG 53 9 7
ISR15 (GA)8 YC 52 11 6
ISR25 (CT)8 RC 52 7 5
ISR29 (CTC)6 52 4 3
ISR32 (TCC)6 52 5 1
Total 71 44
　1)R=A , G;Y=C , T .
　M .Marker;1～ 4 , 5～ 8 , 9～ 12 , 13～ 16 , 17～ 20 , 21～ 24道分别为引物 ISR1 , ISR4 , ISR7 , ISR15 , ISR3 , ISR6扩增的带型;1 , 3 , 5 , 7 , 9 ,
11 , 13 , 15 , 17 , 19 , 21 , 23道的模板 DNA 为 LC-5 , 2 , 4 , 6, 8 , 10 , 12 , 14 , 16 , 18 , 20 , 22 , 24道的模板为 LS-32;1 , 2 , 5 , 6 , 9 , 10 , 13 , 14 , 17 , 18 ,
21 , 22道的退火温度均为 52 ℃, 3 , 4 , 7 , 8 , 11, 12 , 15 , 16 , 19 , 20 , 23 , 24道的退火温度均为 55℃。
　M .Marker;The bands in lane 1-4 , lan e 5-8 , lane 9-12 , lane 13-16 , lane 17-20 , lane 21 24 were amplif ied by primers ISR1 , ISR4 , ISR7 ,
ISR15 , ISR3 and ISR6 , respectively;DNA template of LC-5 w as u sed in lane 1 , 3 , 5 , 7 , 9 , 11 , 13 , 15 , 17 , 19 , 21 , 23;DNA template of LS-
32 w as u sed in lane 2, 4 , 6 , 8 , 10 , 12 , 14 , 16 , 18 , 20 , 22 , 24;the ann ealing temperature of 52℃w as u sed in lane 1 , 2 , 5, 6 , 9 , 10 , 13 , 14 , 17 ,
18 , 21 , 22;the annealing temperatu re of 55 ℃w as u sed in lane 3 , 4 , 7 , 8 , 11 , 12 , 15 , 16 ,19 , 20 , 23 , 24.
图 1　部分 ISSR引物的退火温度比较
Fig.1　Compar ison of results under different annealing temperature
　　由表 2可知 ,这 10条引物中 ,有 8条为二碱基
重复引物 ,2条为三碱基重复引物。而 5′端锚定的
二碱基重复引物如 BDV(CA)7 、VHV(G T)7 、DBD
(AC)7 、HVH(TG)7 、VBV (CA)8 、VDV(G T)8
(B=C ,G ,T ;D=A ,G , T ;H =A , C , T;V =A ,C ,
G)等均没有扩增带 ,或者扩增的带谱要么呈弥散
型 、要么没有多态性而被淘汰 。
2.3　优化体系对台湾杉的扩增效果
采用优化的反应体系和筛选出的 10条引物对
采自湖北利川的野生台湾杉居群(共 20个样品)进
行了扩增 ,结果得到了背景清晰 、多态性丰富 、重复
性好的 DNA扩增片段(图2),证明本试验建立的体
434
　第 4 期 杨琴军 等:台湾杉 ISSR反应体系的建立及检测 　
系稳定可靠 , 可用于台湾杉居群遗传变异的分析
研究 。
通过对利川居群的遗传分析得到如下结果:10
条引物共扩增出 71条谱带 ,每个引物扩增的条带数
为 3 ～ 11不等(表 2),扩增谱带的分子质量在 250 ～
2 000 bp 之间 ,多态性带共有 44 条 ,多态位点百分
率为 61.97%,Nei s基因多样性和 Shannon s信息
指数分别为 0.136 9和 0.216 0。
　M .Marker;1～ 20道和 21～ 40道分别为引物 ISR1和 ISR3的扩增图谱。退火温度:52 ℃。M.Marker;the ampli fied band s in 1-20
lane and 21-40 lane u sing primer ISR1 and ISR3 respectively , annealin g tem perature:52 ℃.
图 2　引物 ISR1 和 ISR3 对利川居群样品的扩增
Fig.2　The amplified bands of the samples from population LC using pr imer ISR1 and ISR3
3　讨　论
本试验通过对影响 PCR反应体系条件的筛选 ,
建立并优化了台湾杉的 ISSR-PCR 反应体系 ,即在
25 μL 的反应体系中 ,含有 40 ng 模板 DNA 、1 U
Taq酶 、0.2 mmol/L dNTP 、0.4 μmo l/L 引物 、1.8
mmo l/L M g2+ 、2.5 μL 10×buffer 。基于此反应体
系筛选出了 10条扩增效果好的引物用于台湾杉的
ISS R分析 。10个引物的序列中有 8个为二碱基重
复 ,并且都是 3′端锚定的 , 2个为三碱基重复 。其
中 ,5条引物是基于(AG)重复 、1条引物基于(GA)
重复 ,扩增的多态性最高(表 2),其他二碱基重复或
三碱基重复的引物扩增的多态性较低。由于 3′端
的锚定碱基不同 ,即使具有相同碱基重复序列的引
物 ,在基因组上的扩增序列也是不同的。通过对这
些引物序列的分析 ,表明在台湾杉的基因组中 ,以
(AG)或(GA)二碱基重复的微卫星序列最丰富 、拷
贝数最多 、多态性最高 、在个体或居群间发生的突变
几率也可能最大;其次 ,以(AC)二碱基重复的微卫
星序列的含量也比较丰富 ,但多态性一般。
Mehdi等[ 15] 在利用 ISS R 标记研究 Thymus
daenensis subsp.daenensis的遗传多样性时对引物
选择进行了分析 ,结果表明 ,含(AG)和(AC)二碱基
系列引物扩增的带更清晰 ,多态性带数更多 ,筛选出
15条引物中 ,二碱基系列引物有 11 条 ,三碱基重复
引物只有 4条 ,同时这 15条引物中有 12条属于 3′
端锚定的 , 3条为 5′端锚定的 ,由此表明 3′端锚定引
物比 5′端锚定引物更有效 , 扩增出的带更清晰;
Pradeep 等[ 23]的研究也表明 ISSR标记中 3′端锚定
引物比 5′端锚定引物更有效;这与本研究结果一
致。而 Lu等[ 17]在分析中国西南部青杨的遗传多样
性时发现以(AC)重复的 ISS R引物扩增的多态性
带数最多 ,并推测在青杨的基因组中 ,(AC)重复的
微卫星序列的多态性最丰富。在对小麦[ 24] 和马铃
薯[ 25]的 ISSR分析中也发现(AC)重复的二碱基引
物更有用 。对贵州苏铁[ 16] 、南洋杉[ 18] 、水稻[ 26] 和枸
橘[ 27]的 ISSR研究则发现(AG)或(GA)重复的二碱
基引物扩增效果最好 。
Li等[ 9] 用 ISSR标记研究了台湾杉的遗传多样
性 ,他所建立的台湾杉 ISSR反应体系为:20 μL 反应
体系中 ,含有 20 ng 模板 DNA 、1.5 U Taq 酶 、0.1
mmol/ L dN TP 、0.2 μmol/ L 引 物 、2.5 mmol/L
Mg2+ 、50 mmol/L KCl、2%甲酰胺等。这与本试验
建立的反应体系有明显差别。Li等[ 9] 用此反应体
系筛选出了 15条引物用于台湾杉居群 104个个体
的扩增。其中有 5条引物与本研究筛选出的引物相
同:4条(AG)重复的引物和 1 条三碱基重复的引
物 ,即(AG)8 T 、(AG)8 C 、(AG)8 YC 、(AG)8 YA 、
435
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 30 卷　
(CTC)6 ,其他引物则与本试验不相同。采用本试验
建立的反应体系和得到的 10 条引物对湖北利川星
斗山野生台湾杉居群 20个样本的遗传多样性进行
了检测 ,结果得出星斗山台湾杉居群的多态位点百
分率 、Nei s基因多样性和 Shannon s信息指数分
别为 61.97 % 、0.136 9和 0.216 0 ,远高于 Li等[ 9]
用 ISS R标记对湖北利川野生台湾杉居群(22 个样
本)遗传多样性检测的结果 。本试验得到的台湾杉
星斗山居群的遗传多样性与张瑞麟 [ 28] 、Lin等[ 29] 、
杨琴军[ 2] 等对台湾杉居群遗传多样性的研究结果类
似 ,与其他濒危裸子植物相比 ,利川台湾杉居群具有
较高的遗传多样性。
总之 ,本研究建立了台湾杉的优化 ISSR 反应
体系 ,筛选出了 10个有效的 ISS R引物 ,通过对 10
个引物序列的分析 ,讨论了台湾杉基因组序列的特
征 ,并运用这些引物对湖北利川台湾杉居群进行了
有效扩增 。这为进一步从 DNA 水平上开展台湾杉
的遗传多样性研究及保护 、利用工作奠定了基础。
参 考 文 献
[ 1] 　K UO Y H , CHIEN S C , KUO C H.Ant ioxidative 7-oxodehy-
dropodocarpane-t ype t rinorditerpenes f rom th e b ark of Taiwa-
nia cr yp tomer ioides [ J] .Plan ta Medica , 2002 , 68(11):1020-
1023.
[ 2] 　杨琴军 ,陈光富 ,刘秀群 ,等.湖北星斗山台湾杉居群的遗传多
样性研究[ J] .广西植物 , 2009 , 29(4):450-454.
[ 3] 　于永福.杉科植物的起源 、演化及其分布[ J] .植物分类学报 ,
1995 , 33(4):362-389.
[ 4] 　于永福 ,傅立国.杉科植物的系统发育分析[ J] .植物分类学报 ,
1996 , 34(2):124-141.
[ 5] 　胡玉熹 ,林金星 ,王献溥 ,等.中国特有植物台湾杉的生物学特
性及其保护[ J] .生物多样性 , 1995 , 3(4):206-212.
[ 6] 　庞惠仙 ,张光飞 ,苏文华.秃杉的组织培养及植株再生[ J] .植
物生理学通讯 , 2005 , 41(2):187.
[ 7] 　廖凤林 ,李久林 ,吴士章 ,等.贵州雷公山台湾杉种群结构及空
间分布格局[ J] .贵州师范大学学报:自然科学版 , 2004 , 22(2):
6-9.
[ 8] 　陈伯望 ,洪菊生 ,施行博.杉木和秃杉群体的叶绿体微卫星分析
[ J] .林业科学 , 2000 , 36(3):46-51.
[ 9] 　LI Z C , WANG X L , GE X J.Genetic diversi ty of the relict
p lan t Taiwania cry ptomer ioides H ay ata(C upressaceae)in ma-
in land Chin a[ J] .S livae Genetica , 2008 , 57(4/ 5):242-249.
[ 10] ZIE TKIEWICZ E , RAFALSKI A , LABUDA D.Genome f in-
gerprint ing by sim ple sequence repeat (SSR)-anch ored poly-
merase ch ain react ion amplifi cation [ J] .Genom ics , 1994 , 20:
176-183.
[ 11] ARNAU G , LALLEMND J , B0URGOIN M.Fast and reliable
st raw berry cult ivar iden tif ication usin g inter simpe sequ ence
repeat (IS SR)amplif ication[ J] .Euphy tica , 2003 , 129:69-79.
[ 12] ZHAO W , MIAO X , ZANG B , et al.Cons t ruct ion of finger-
p rinting and genetic diversity of mulberry cul tivars in C hina by
ISSR markers[ J] .Acta Genetica Sinica , 2006 , 33(9):851-860.
[ 13] ZHANG R , XU Y , YI K , et al.A genetic linkage map for wa-
t ermelon derived f rom recombinan t inbred lines[ J] .J Amer Soc
Hort S ci , 2004 , 129:237-243.
[ 14] LEVI J , THMAS C E , T REBITSH T , et al.An ex tended link-
age map for w atermelon based on SRAP , AFLP , SSR , ISSR ,
and RAPD markers[ J] .J Amer S oc H ort S ci , 2006 , 131:393-
402.
[ 15] M EHDI R , BABAK B , MOJTABA K , et al.Genetic variabilit y
and geograp hic diff eren tiation in Th ymus daenensis su bsp.
daenen sis , an en dangered medicinal plant , as revealed by inter
simple sequ ence repeat (ISSR)markers[ J] .Biochem Genet ,
2009 , 47:831-842.
[ 16] XIAO L Q , GE X J , GONG X , et al.ISSR Variat ion in the en-
demic and endangered plan t Cycas gu izhouensis(C ycadaceae).
[ J] .Annals of Botany , 2004 , 94:133-138.
[ 17] LU Z ,WANG Y , PENG Y , et al.Genet ic diversity of P opu lus
cathayana Rehd populations in southw es tern China revealed by
ISSR markers[ J] .Plant S ci , 2006 , 170:407-412.
[ 18] PYE M G , HENWOOD M J , GADEK P A.Dif ferential levels
of genet ic diversity and divergence am ong popu lation s of an
ancient Aust ralian rainforest conifer , Araucaria cunn ing hamia
[ J] .Plan t Sys t Evol , 2009 , 277:173-185.
[ 19] 杨琴军 ,徐辉 ,严志国 ,等.湖北原生台湾杉(T wan ia cryp tome-
rioides Hayata)资源及其保护[ J] .广西植物 , 2006 , 26(5):551-
556.
[ 20] 陈光富 ,杨琴军 , 陈龙清.濒危孑遗树种台湾杉 DN A 提取及
RAPD反应体系的建立[ J] .湖北农业科学 , 2008 , 47(10):
1108-1110.
[ 21] HOELZEL A R.Molecu lar genet ic analysi s of populat ion[ M] .
London:IRL Press , 1992.
[ 22] KING L M , SCHAA L B A.Ribosomal DNA variat ion and dis-
t ribu tion in Rudbeckia missour iersi s[ J] .Evolu tion , 1989 , 43:
1117-1119.
[ 23] PRADEEP R M , SARLA N , SIDDIQ E A.Inter sim ple se-
quence repeat (IS SR)and i ts application in plant b reeding[ J] .
Euphit ica , 2002 , 128:9-17.
[ 24] NAGAOKA T , OGIHARA Y.Applicabi lity of inter-simple se-
quence repeat polymorphisms in w heat for u se as DNA mark-
ers in com pari son to RF LP and RAPD markers[ J] .Theor Appl
Genet , 1997 , 94:597-602.
[ 25] M CG REGOR C E , LAM BERT C A , GREYLING M M , et al.
A comparative as ses sment of DNA f ingerprint ing techniques
(RAPD , ISSR , AFLP and SSR)in tet raploid potato (So lanum
tuberosum L.)germplasm[ J] .Euphyt ica , 2000 , 113:135-144.
[ 26] BLAI R M W , PANAUD O , MCCOUCH S R.Inter-simp le se-
436
　第 4 期 杨琴军 等:台湾杉 ISSR反应体系的建立及检测 　
quence repeat (ISSR)amplif ication for analysis of microsatel-
li te mot if f requ ency and fingerprin ting in rice (Oryza sat iva
L.)[ J] .Th eor Appl Genet , 1999 , 98:780-792.
[ 27] FANG D Q , ROOSE M L , K RUEGER R R , et al.Fingerprint-
ing t rif oliate orange germ plasm accession s w ith i sozymes ,
RFLPs and in ter-simple sequence repeat markers[ J] .Th eor
Appl Genet , 1997 , 95:211-219.
[ 28] 张瑞麟.台湾杉遗传多样性之研究[ D] .台湾:国立中山大学园
艺学院 , 2005.
[ 29] LIN T P , LU C S ,CHUNG Y L , et al.Allozyme variation in 4
popu lation s of Taiwania cry ptomer ioides in Taiw an[ J] .S ilvae
Genetica , 1993 , 42(4/5):278-284.
Establishment of ISSR system for the relict plant
Taiwania cryptomerioides Hayata
YANG Qin-jun1 　YUAN Ji-lin2 　FU Qiang1 　CHEN Long-qing1
1.K ey Laboratory o f Horticultural Plant B iology ,Ministry of Education ,
Huazhong Agricul tural Univ ersity ,Wuhan 430070 , China;
2.Administrat ion Bureau o f Leigongshan National Natural Reserve ,Leishan 557100 ,China
Abstract　An optimal ISSR reaction sy stem for Taiwania cryptomerioides was established w ith
25.0 μL reaction mixture made up of 40 ng genomic DNA , 0.4 μmol/L prime r , 1.8 mmol/ L Mg 2+ ,
1.0 U Taq ,0.2 mmol/L dNTP , and 2.5 μL 10×buf fer.The PCR were performed as follow s:4 min at
94 ℃,40 cycles of 45 s at 94 ℃, 45 s at 51 ℃ to 56 ℃, and 2 min at 72 ℃,with a f inal ex tension of 7 m in
at 72 ℃.Ten po lymo rphic primers w ere screened using this reaction sy stem.Tw enty DNA samples f rom
the w ild population of T .cryptomerioides dist ributed in Lichuan City of Hubei Pro vince w ere amplified
by the 10 selected prime rs.The percentage of po lymo rphic bands w as 61.97 %,Nei s gene diversity and
S hannon s info rmation measure w ere 0.136 9 and 0.216 0 , respectively .
Key words　Taiwania cryptomerioides;ISSR;PCR condi tions;react ion sy stem;primer screening
(责任编辑:杨锦莲)
437