全 文 ：　第 37卷第 2期 郑州 大 学 学 报 (理 学 版 ) Vol. 37 No. 2
　 2005年 6月 J. o f Zheng zhou Univ. ( Nat. Sci. Ed. ) Jun. 2005
　　收稿日期: 2004 11 20
基金项目:国家“十五”科技攻关项目 ,编号 2001BA302B;福建省教育厅科研项目 ,编号 JA02268.
作者简介:李国平 ( 1966— ) ,男 ,副教授 ,博士研究生 ,主要从事离子束植物生物技术研究 ; E-mail: p tlg p@ sina. com.
用整体染色透明法观察油杉花粉粒的结构
李国平 1, 2 ,　黄群策1
( 1.郑州大学离子束生物工程省重点实验室　郑州 450052;
2.莆田学院环境与生命科学系　福建 莆田 351100)
摘要: 采用整体染色透明法对油杉花粉的个体发育过程进行了详细观察 ,以更清楚地显示油杉单核小孢子有丝分
裂过程及其成熟花粉粒结构的特点 .结果表明 ,单核小孢子经过连续 4次有丝分裂后形成 5-细胞型的成熟花粉粒 ;
成熟花粉由两个原叶细胞、一个不育细胞、一个精原细胞和一个管细胞组成 ,其中的两个原叶细胞在花粉成熟时已
退化 .整体染色透明法制片过程简单快速 ,效果较佳 ,适用于裸子植物花粉个体发育过程的观察 ,是值得推广的一
种观察技术 ;主要关键技术在于染色、脱水和透明时间的长短 .
关键词: 油杉 ; 花粉粒 ; 整体染色透明法 ; 植物制片
中图分类号: Q 945; S 718　　　　　　　　　　　　　　 文章编号: 1671- 6841( 2005) 02- 0044- 04
0　引言
在被子植物中 ,花粉粒分 2-细胞型和 3-细胞型 ;在裸子植物中 ,花粉粒所含细胞的数目却变化比较大 ,
具 3至几十个 [1 ] ,可分松型、油杉型和银杉型 [2 ] .观察花粉个体发育过程大多采用石蜡切片法和醋酸洋红染
色压片法 .常规石蜡切片法使用药剂多 ,操作繁琐 ,实验周期长 ,工作量大 ,而且仅能观察到一个切面 .用醋酸
洋红染色压片法可快速鉴定花粉的发育时期 ,但较适用于观察小孢子母细胞减数分裂过程 .油杉 (Keteleeria
fortunei )成熟花粉具 5个细胞 ,属于油杉型花粉 [2 ] .为了更清楚地观察其有丝分裂过程及主要结构特点 ,应
用整体染色透明法可以清晰地显示花粉粒的内部结构 ,简便易做 ,效果较好 .
整体染色透明不需要切片 ,只经过染色、透明剂透明后便可在显微镜下观察 ,是一种较石蜡制片简便的
方法 .杨弘远曾首次用此法观察了烟草的胚珠和水稻子房中的胚囊结构 [3 ] .本文用整体染色透明法进行裸子
植物花粉发育的观察 ,是一种新的尝试 .
1　实验部分
1. 1　实验材料
取自福建省莆田市市郊广化寺旁树龄约为 20年的油杉 (Keteleeria fortunei )野生植株雄球花 .采样时
间: 2004年 2月 5日至 2004年 3月 10日 .
1. 2　实验器材与试剂
显微镜、解剖镜、恒温水浴锅、解剖针、镊子、吸管、凹玻片、盖玻片、烧杯和青霉素瓶等 .
FAA固定液 [50%酒精∶冰醋酸∶ 36%甲醛溶液配成 89∶ 6∶ 5的溶液 ]、爱氏苏木精染色液 [原染液配
方∶苏木精 5 g、 95%酒精 250 m l、冰醋酸 25 m l、甘油 250 ml、硫酸铝钾 25 g、蒸馏水 250 ml;稀释染液配方:
原染液 2份、冰醋酸 1份、 50%酒精 1份 ]、水杨酸甲酯、丁香油和中性树胶 .
1. 3　实验方法
( 1)取材与固定:仔细剥去雄球花外部包裹的鳞片 ,迅速固定于 FAA固定液中 , 24 h后换至 70%酒精
　第 2期 李国平等:用整体染色透明法观察油杉花粉粒的结构 45
中并贮存于 4℃冰箱中 .
( 2)冲洗:材料经 50%酒精→ 30%酒精→蒸馏水中 ,每级 30 min.
( 3)水解:在 1 mol盐酸 60℃下水解 12 min,蒸馏水彻底洗净 .
( 4) 染色:加入上述经稀释的苏木精染液染色 2～ 3天 ;倾去染色液 ,加入蒸馏水浸洗 ,换液数次至水中
无浮色 ;换入自来水使材料还蓝 ;最后经过蒸馏水换入 30%酒精中 .
( 5)脱水:材料由 30%酒精中依次转入 50%、 70% 、 90% 、 95%、 100%浓度梯度的酒精中各脱水 30 min,
在 100%酒精中脱水 3次 ,每次 1 h ,最后 1次过夜 .
( 6)透明处理:材料由 100%酒精转入水杨酸甲酯和 100%酒精的等量混合液中 ,约 1 h后转入 1∶ 3的
100%酒精与水杨酸甲酯混合液中 1 h,最后在水杨酸甲酯中换洗 3次 ,每次 1至数小时 ,最后 1次 24 h以
上 .经过透明处理的材料仍可保存于水杨酸甲酯中 .
( 7)制片观察:将透明材料置于滴有丁香油的载玻片上 ,用镊子刺破小孢子囊使花粉散出 ,除去杂质 ,盖
上盖玻片 ,用中性树胶封片 .制片均用 OlympusBX 51型显微镜进行观察并摄像 .
实验以醋酸洋红染色压片法作为对照 .
2　结果与讨论
油杉于 2月上旬形成四分体 ,小孢子从四分体中释放出后经 4次连续有丝分裂形成具五细胞结构的成
熟花粉 ,属于油杉型花粉 [2 ] .从四分体中分散出来的小孢子是雄配子体的第一个细胞 .刚释放出来的小孢子
具单个核并居中 ,见图 1( a)所示 .随着发育的进行 ,小孢子体积增大 ,细胞核明显变大 ,逐渐移向近极面 (图 1
( b) ) .建立起由近极面到远极面的轴向极性并很快进入第一次有丝分裂 ,形成第一原叶细胞和胚性细胞 (图
1( c) ) .胚性细胞进行一次不等的分裂形成第二个原叶细胞和精子器原始细胞 (图 1(d) ) .第一和第二原叶细
胞最终呈细胞程序性死亡 ,退化成线状结构 (图 1( e)、 ( f ) ) .精子器原始细胞位于中央 ,较大 .精子器原始细胞
再进行一次分裂 ,形成生殖细胞和管细胞 (图 1( e) ) .最后 ,生殖细胞进行一次分裂 ,形成精原细胞 (体细胞 )
和不育细胞 (柄细胞 ) .这样 ,油杉成熟花粉具有两个退后的原叶细胞、一个不育细胞、一个精原细胞和一个管
细胞 ,形成了 5-细胞花粉 (图 1( f ) ) .在成熟花粉中 ,管细胞占据大部分面积 ,呈厚底浅口的杯状体 ,细胞核呈
梭状或月牙形 ,长约 28. 2μm,精原细胞 (体细胞 )和不育细胞 (柄细胞 )位于管细胞的杯口之中 .精原细胞比
管细胞小得多 ,圆形 ,处于与管细胞贴近的位置 ,直径约 40. 1μm.不育细胞较精原细胞小 ,呈椭圆形至透镜
形 ,长 12. 8μm,高 7. 0μm,紧贴着精原细胞 ,靠近花粉的近极端 .油杉花粉于 3月初成熟并传粉 .成熟花粉
具有两个气囊 ,气囊呈肾形 ,外部有不规则网状饰纹 .花粉全长 112. 7～ 126. 8μm,体长 81. 1～ 88. 2μm,体
高 70. 4～ 77. 5μm.
油杉花粉发育过程中形成的胚性细胞、精子器原始细胞和管细胞中都具有淀粉粒 ,淀粉粒的存在影响对
其有丝分裂中核相变化的观察 .所以 ,在制片过程中 ,须先用盐酸水解 ,尔后运用整体染色透明法制片观察 ,
收到良好效果 .整体染色透明法一般用于快速鉴定胚襄、胚乳和胚状体的发育和结构 [4 ] .用此方法观察了油
杉花粉发育 .从结果来看 ,整体染色透明法也是观察花粉个体发育的有效制片方法 ,特别适用于裸子植物花
粉粒的观察 .用整体染色透明法显示花粉粒结构的实验方法是一种新的尝试 .结果表明 ,此方法是值得推广
的一种观察技术 .
整体染色透明法均不需要切片 ,只经过透明剂透明处理或染色后再透明处理便可在显微镜下观察 ,免去
常规石蜡切片后一片片单独染色和分色的繁重工作 ,可以节省时间、人力和药品 .操作过程简单快速 ,且可在
不破坏花粉粒整体结构的情况下多角度观察 ,尤其是在真实性、整体性、立体感观察效果等方面有其独到的
优点 .整体染色透明法克服了醋酸洋红染色压片法制片容易受细胞内容物干扰和反差太小的缺点 .但因整体
染色透明法需要经过染色和透明处理过程 ,故要注意掌握好染色和透明这两个主要技术环节 .染色时间是关
键 ,染色时间过短 ,染料不能深入组织细胞内部 ;染色时间过长 ,又不易脱色 .最佳染色时间因材料种类及物
料大小而异 .为了取得较佳的染色效果 ,要做大量的预备实验 ,以掌握最佳染色时间 .透明处理过程最后一次
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图 1　油杉花粉分实验照片
( a)小孢子单核居中期 ; ( b)小孢子单核靠边期 ; ( c)具 2个细胞花粉 ;
(d )具 3个细胞花粉 ; ( e)具 4个细胞花粉 ; ( f )成熟花粉粒 ,具 5个细胞
应放置 1天以上为好 .时间太短会造成材料结构、层次不清晰 ,影响观察结果 .另外 ,如果材料脱水不彻底 ,透
明处理时会出现混浊 ,将直接影响透明效果 .脱水时间过长 ,将会导致材料收缩和变脆 .因此处理染色、脱水
和透明时间的长短是本实验的关键技术 .
用整体染色透明技术观察花粉发育也有其不足之处 ,如在观察花粉粒内部的细微结构方面不如传统石
蜡切片的效果好 .所以 ,要观察花粉发育过程中结构细节的变化 ,应将整体染色透明技术与石蜡切片技术结
合起来为好 .另外 ,利用花粉粒发育中细胞壁和细胞核具有较强的自发荧光这一特点 ,可结合激光共聚焦扫
描显微镜技术对花粉发育过程进行快速的观察分析 .激光共聚焦扫描显微镜与传统荧光显微镜相比 ,除了有
较高的分辨率外 ,一个主要的不同是激光共聚焦扫描显微镜可以利用激光点扫描成像 ,形成连续的光学切片
图像 ,进而可以应用相关图像处理软件对连续光学切片进行三维重建 ,构成三维立体图像 .整体染色透明法
与激光共聚焦扫描显微镜技术的结合 ,将为花粉生物学的研究提供有价值的资料 ,推动植物生殖生物学的
发展 .
参考文献:
[ 1]　陈祖铿 .花粉的个体发育 . 植物杂志 , 1989, ( 6): 2～ 3.
[ 2]　曹玉芳 ,许方 ,姚敦义 . 松杉类植物雌雄配子体的发育与胚胎发生 . 莱阳农学院学报 , 1995, 12( 3): 206～ 212.
[ 3]　杨弘远 . 用整体染色及透明技术观察胚囊、胚、胚乳和胚状体 . 植物学报 , 1986, ( 6): 575～ 581.
[ 4]　杨鹭生 ,李国平 . 被子植物胚囊结构的观察方法 . 实验室研究与探索 , 2004, 23( 2): 9～ 11.
　第 2期 李国平等:用整体染色透明法观察油杉花粉粒的结构 47
Whole Stain-clearing Technique for Observation of Pollen Grain
Structure of Keteleeria fortunei
Li Guoping
1, 2
,　 Huang Qunce1
( 1. Provincial Key Laboratory of Ion Beam B io-engineering , Zhengzhou University , Zhengzhou 450052,
China; 2. Department of Environment and Lif e Science, Putian College, Put ian ,Fujian 351100,China )
Abstract: In order to exhibi t mo re clearly four times continuous mito sis of the uninuclea te mi-
crospo re and the st ructure of mature pollen g rain, the who le stain-clearing technique is used to in-
vestiga te the ontogeny of po llen of Keteleeria fortunei . The results show that the mature pollen
g rain contains fiv e cells w hich are made up of tw o degenerated prothallial cell, a steri le cells, a
sperma togenous cell and a tube cell. By the w ho le stain-clea ring tech nique, the st ructure of pollen
a t di fferent stag es could be seen clearly. The whole stain-clearing tech nique is a simple and conve-
nient method for studying plant embryogenesis and observing the development of male gameto-
phy te in Gymnosperm . The sticking point of the technique is th e time leng th of staining , dehydra-
tion and clearing.
Key words: Keteleeria fortunei ( Murr. ) Carr; pollen g rain; whole stain-clearing tech nique; plant
sections
(上接第 43页 )
Effect of Scandium on Recrystallization of
Aluminium-l ithium Alloy
Wang Mingxing
1
, Cen Kun
2
, Song Tianfu
1
, Liu Zhongx ia
1
, Liu Zhiy ong
1
,
Weng Yonggang
1
, Zuo Xiurong
1
( 1. Key Laboratory of Material Physics , Education Ministry of China , School
of Physics& Engineering , Zhengzhou University , Zhengzhou 450001,China;
2. X inyang College of Vocational Technology , X inyang , Henan 464000,China )
Abstract: The ef fects of scandium on the recrystalli za tion of aluminium-li thium allo y are investi-
ga ted by measuring the vickers hardness o f the testing alloy s and by observing their microst ruc-
tures. The resul ts show that a la rg e number o f fine Al3 Sc and Al3 ( Scx , Zr1- x ) phases w ill form
dispersiv ely in the alloy w hen trace scandium is added to aluminium-li thium allo y. Such phase pa r-
ticles can st rongly pin and impede the movement and coalescence of dislocations and subg rain
boundaries, and stabili ze subst ructures o f the aluminium-li thium alloy containing scandium. As a
resul t, the nucleation and g row th of recry stalli zing g rain are restrained, and the recrystalli zing
tempera ture of aluminium-li thium allo y is raised.
Key words: scandium; aluminium-li thium allo y; recrystalli zation