全 文 ：草麻黄补体抑制成分对大鼠急性脊髓损伤后补体表达的影响*
中国医科大学附属第一医院骨科 (沈阳 110001)　李良满　李静波△　朱　悦#
　　摘　要　目的:探讨草麻黄补体抑制成分对大鼠急性脊髓损伤后补体表达的影响。 方法:应
用多步沉淀及薄层层析方法进行草麻黄补体抑制成分的提纯并进行活性鉴定。 参照改良的
Allen’ s重物打击法制备大鼠脊髓损伤模型 ,设伤后 12h、 1d、 3d、 7d、 14d 5个时间点 ,应用 CH50
法测定血清总补体溶血活性 ;应用免疫组化染色方法检测脊髓损伤组织中补体 C3、 C9的表达并
进行图像分析。结果:从伤后 12h至 14d,实验组 CH50比值均明显低于对照组 ;在伤后各个时间
点 ,实验组脊髓损伤组织中 C3及 C9表达弱于对照组。结论:草麻黄补体抑制成分能够显著抑制
大鼠脊髓损伤后补体系统的激活 ,对脊髓损伤后的神经功能可能发挥重要保护作用。
　　主题词　脊髓损伤　补体系统蛋白质类　麻黄
　　【中图分类号】　 R651. 2　【文献标识码】　 A　【文章编号】　 1000-7377( 2011) 06-0671-03
　　脊髓损伤 ( Spinal co rd injury, SCI)继发性损伤机
制复杂 ,目前临床上还缺乏更多有效的治疗药物。我们
在前期的研究中发现 ,补体系统在 SCI中起到了重要
作用 ,抑制补体系统激活可以减轻继发性 SCI[ 1]。近几
年来 , SCI的抗补体治疗越来越引起人们的关注。 而
开发寻找高效、安全、低成本的补体抑制剂亦成为相关
研究热点和方向 [ 2 ]。草麻黄 ( Ephedra sinica, ES)较早
地被应用于急性肾炎、支气管哮喘等与免疫炎症反应
相关疾病的治疗中 ,获得了显著的疗效 ,其作用机制被
认为与抑制补体活化有关 [3 ]。随着生物化学技术的不
断发展 ,其抗补体成分已被成功的分离提取 ,并被证明
具有强力的补体抑制作用 [4 ]。本研究首次将草麻黄补
体抑制成分应用于实验性的 SCI治疗中 ,探讨其对
SCI后补体系统激活的影响 ,为 SCI的抗补体治疗提
供更多的理论依据。
材料和方法
1　草麻黄补体抑制成分的提纯及活性鉴定　参
照 Ling等的方法应用多步沉淀及薄层层析方法进行
草麻黄补体抑制成分的提纯并进行活性鉴定 , 1kg草
麻黄加入 pH4. 0的蒸馏水 10L,煮沸 1h ,过滤除渣 ,加
入 1mo l /L NaOH调整 pH至 9. 0室温搅拌孵育 1h,
离心 ,洗涤沉淀 3次 ,室温烘干得到棕褐色粗品共 18.
5g。取 3g粗品溶于 pH4. 0的蒸馏水 50ml中 ,煮沸 1h,
离心弃上清 ,溶于 pH 9. 0的蒸馏水中 ,调整 pH值至
4. 0,进行薄层层析 ,微量法进行补体溶血实验测定 ,结
果证明最快速移动层析带具有显著的抗补体活性。 重
复以上步骤进行提取收集备用。
　　 2　实验动物分组及脊髓损伤模型制备　健康 SD
* 辽宁省科技厅科学技术计划项目 ( 2010225034)
△中国医科大学附属第一医院感染科
# 通讯作者
大鼠 50只 , SPF级 ,雌雄不拘 ,体重 250～ 300g,随机
分组:①实验组 ( ES组 ): 分脊髓损伤后 12h、 1d、 3d、
7d、 14d五个时间点 ,每个时间点 n= 5, 伤后 1h给予
ES补体抑制成分提取物 ( 15mg /kg)溶于 5ml生理盐
水强制灌胃 , 1次 /d。 ② 对照组 ( Control组 ):分脊髓
损伤后 12h、 1d、 3d、 7d、 14d五个时间点 ,每个时间点 n
= 5 ,以同样方法给予等量生理盐水。 采用改良的
Allen’ s重物打击法 [5 ]方法制备大鼠脊髓急性损伤模
型:损失部位为 T10节段。
3　血清总补体溶血活性测定　应用 CH50法进
行血清总补体溶血活性测定。在大鼠 SCI前 1h、伤后
12h及伤后每天尾静脉抽血 0. 3m l,离心 ,取上清 , -
20℃保存备用。制备 2%绵羊红细胞悬液 ,溶血素效价
测定 ,制备 50%溶血标准管 ,然后将各浓度梯度反应
体系置于微量板孔中 ,反应完毕后 ,在 541nm波长处
测吸光度 ,计算出待测血清的 CH50值 ,并与损伤前血
清样品的基础值比较 ,计算出百分比值。
4　组织病理学观察　各组动物于伤后每个时间
点各取 3只再次麻醉 ,以伤处为中心取 1cm脊髓组
织 ,制作片厚为 12μm的冰冻切片 ,分别行 HE染色及
免疫组织化学染色。采用 SABC法进行 C3、 C9免疫组
化染色。试剂盒购自美国 Sigma公司。光学显微镜下 ,
C3及 C9阳性反应物为突出背景的棕黄色颗粒。应用
Meta M orph全自动真彩色图像分析仪测定 C3、 C9阳
性反应物平均灰度值 ( Average g ray value, AG)。 AG
与阳性反应物的免疫反应强度呈反比关系。
5　统计学分析　所有数据均用平均值±标准差
(x-± s )表示 ,应用 SPSS10. 0统计分析软件 ,各时间点
组间首先行方差齐性检验 ,然后行 t检验 ,P < 0. 05为
有显著性差异。
结　果
1　血清 CH50测定结果　在实验组和对照组 ,伤
671陕西医学杂志 2011年 6月第 40卷第 6期
后早期血清 CH50比值迅速下降 ,约在伤后 1d达到最
低值 ,分别 29. 05% ± 2. 08% , 24. 08% ± 2. 31% ;
伤后 3d至 7d快速上升 ,以后缓慢回升 ,在伤后 14d,
对照组 CH50接近伤前水平 ( 98. 21% ± 1. 12% ) ,而
在实验组仅达到伤前的 75%左右。在伤后 12h实验组
的 CH50比值均低于对照组 ,具有显著性差异 ( P < 0.
05) ,而在此后的几个时间点 ,实验组的 CH50比值均
明显低于对照组 ( P < 0. 01)。
2　组织病理学检查结果　伤后 12h,实验组及对
照组脊髓前角部分神经元细胞膜上有散在的 C3及 C9
阳性颗粒沉积 ;伤后 3d: 两组整个灰质及白质内有大
量 C3及 C9阳性颗粒沉积 ,其中残存阳性神经元的胞
膜及胞浆内均可见 C3及 C9阳性颗粒沉积 ;伤后 7d,
两组灰质内仍有一定数量 C3及 C9阳性神经元 ,部分
神经元已基本恢复了多角形态 ;损伤后 14d两组灰质
内仍可见 C3及 C9阳性表达。
3　图像分析结果　在伤后各个时间点 ,实验组脊
髓损伤组织中 C3及 C9 AG值均高于对照组 ,且有非
常显著性差异 ( P < 0. 01) ,表明实验组 C3及 C9阳性
表达明显弱于对照组 ;伤后 3d约是补体免疫反应的高
峰 ,见附表。
附表　伤后不同时间点 ES组及 Contro l组 C3、 C9表达图像分析结果 ( AG ,x-±s )
伤后时间 　 C3
Contr ol组 ES组 　
C9
Contro l组 ES组
12h 　 80. 68± 4. 45 110. 46± 8. 55* 　 81. 15± 4. 17 89. 12± 4. 25*
1 d 　 77. 09± 5. 98 98. 33± 8. 51* 　 72. 45± 3. 41 82. 56± 3. 11*
3 d 　 51. 33± 4. 22 74. 05± 5. 39* 　 60. 33± 2. 42 70. 94± 3. 85*
7 d 　 85. 33± 5. 67 99. 67± 6. 55* 　 69. 96± 5. 27 82. 05± 5. 71*
14d 　 113. 85± 6. 93 138. 62± 9. 23* 　 86. 67± 5. 84 103. 43± 6. 22*
　　注: 与 Contr ol组比较 ,* P < 0. 01
讨　论
补体系统是构成机体免疫防护机制的重要组成部
分 ,也是造成病理性损伤的重要因素。中枢神经系统损
伤时存在补体系统激活的必要条件。 补体系统重要固
有成分 C3处于经典途径、旁路途径及 MBL途径的汇
合点 ,在补体系统激活过程中起着枢纽作用。 C9是形
成膜攻击复合体 ( M embrane at tack complex , MAC)的
最后一个分子 ,也是补体系统激活并攻击破坏靶细胞
的主要成分 [6 ]。
补体系统激活后 ,会通过多种机制导致组织细胞
的病理性损伤。其中 MAC所介导的神经元死亡包括
坏死和凋亡两个方面。当 M AC攻击靶细胞膜时 ,在靶
细胞膜上可形成小的双向的跨膜通道 ,引起 Ca2+不可
抑制性地大量内流以及细胞内 K+ 外流、Na+通透性增
加等变化 ,导致膜磷脂的过氧化 ,加重血管痉挛、组织
缺血 ,神经元细胞传导冲动的能力减弱或丧失。 MAC
还可以通过激活和裂解 caspase途径而诱导细胞调亡 ,
从而加重继发性 SCI[7 ]。
近年来大量研究表明 ,抑制补体系统激活可以减
轻 SCI后的继发性损伤 ,抗补体治疗有望成为 SCI新
的治疗策略。 Reynolds[8 ]等研究发现痘病毒补体调控
蛋白能够显著抑制大鼠 SCI后的补体表达 ,减轻 SCI。
Qiao等研究表明 ,补体经典途径与旁路途径在脊髓损
伤中起到重要作用 ,补体抑制剂 CR2-Crry能够显著地
减轻小鼠 SCI后的神经功能损害 ,抑制补体激活可减
轻继发性 SCI[ 9, 10]。 Tei等 [ 11 ]研究发现 ,补体 C1酯酶抑
制剂能够显著抑制补体系统激活 ,保护神经功能。 Guo
等 [12 ]研究发现 , C3缺失小鼠伤后神经元再生功能要显
著优于 C3未缺失小鼠 ,抑制补体激活可减轻继发性
SCI。 我们研究发现 ,重组补体抑制剂 sCR1可显著抑
制大鼠脊髓损伤后的补体激活 ,对神经功能发挥显著
的保护作用。
本研究首次将 ES补体抑制成分提纯后应用于大
鼠的 SCI模型研究中。结果表明 ,在实验组及对照组的
SCI组织中均有重要补体固有成分 C3及 C9的表达 ,
并且实验组的血清 CH50比值、损伤组织中的 C3及
C9表达均明显低于对照组 ,表明 ES补体抑制成分能
够显著抑制补体系统的激活 ,对脊髓损伤后的神经功
能可能发挥重要的作用 ,在今后的研究中我们将进一
步深入探讨。 本研究为 SCI的抗补体治疗提供了新的
实验数据及理论基础。
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(收稿: 2010-12-09)
(上接第 667页 )
NO对肿瘤的影响 , Jenkins等 [5 ]采用基因工程技术 ,把
iNO S基因转染入人结肠癌细胞株 ,成为 iNO S-19细
胞克隆 ,使其能持续分泌 NO,并与不产生 NO的亲代
野生型瘤株进行体外和体内生长特性比较。在体外培
养中 , iNO S-19细胞克隆增殖速率较野生型亲代对照
组和转染对照组慢。这种作用可使被 NO S抑制剂 L-
N IO逆转 ,说明在体外培养中 NO能抑制肿瘤细胞增
殖。 Xie等 [6 ]研究发现 ,给高度转移的小鼠恶性黑色素
瘤细胞转染 iNO S基因 ,使其表达 iNO S活性。当产生
高水平 NO时 ,则使肿瘤失去转移性。 Jansson等在研
究卡介苗 ( BCG)治疗膀胱癌的实验中 ,证实 BCG是通
过增加膀胱上皮细胞的细胞因子产量 ,诱导 iNOS活
性增加 ,进一步使 NO产生增加而发挥作用的。本实
验发现 ,补充 L-Arg后大肠癌组织、腺瘤组织 iNO S表
达明显升高 ( P < 0. 05) ,提示 L-精氨酸具有促进大肠
肿瘤 iNOS表达的作用。 本实验也发现补充 L-Arg后
大肠癌患者血清中的 NO的浓度明显升高 ( P < 0.
05)。 NO是由 NO S催化 L-Arg生成的。 NO含量的动
态变化是由 NO S的活性决定的 ,即 NOS活性越强 ,
NO浓度越高。L-Arg可能通过促进大肠肿瘤 iNO S表
达来升高血清 NO的浓度。腺瘤患者血清 NO含量干
预前后没有明显变化 ,但腺瘤组织 iNOS表达活性升
高 ,有可能使肿瘤组织局部产生高浓度的 NO。由此看
来 , L-精氨酸—一氧化氮途径是 L-精氨酸抑制肿瘤生
长的一种作用机制 , L-精氨酸对 iNO S表达的调节机
制有待于进一步研究。
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(收稿: 2010-12-17)
673陕西医学杂志 2011年 6月第 40卷第 6期