全 文 ：书第39卷 第4期 林 业 科 技 Vol. 39 No. 4
2 0 1 4 年 7 月 FOＲESTＲY SCIENCE ＆ TECHNOLOGY July 2 0 1 4
文章编号:1001 － 9499 (2014)04 － 0001 － 04
林芝云杉同工酶系统及其位点的选择
王福德1 贾子瑞2 翁海龙1 王军辉2*
(1. 黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨 150081;2. 中国林业科学研究院林业研究所，北京 100091)
摘要:以西藏地区 12 个群体的林芝云杉的混合种子为试材，取其胚乳进行同工酶试验的结果表明:经过对 3 种
提取缓冲液的 3 次重复对照，筛选出 Tris － glycine提取缓冲液做为本试验的提取缓冲液。经过对 5 种电泳 －凝胶
缓冲液的 3 次重复对照，最后用经过改良的#3 和#4 缓冲液进行电泳，从 17 个酶系统中筛选出 11 个谱带清晰、
分离良好的酶系统;#3 缓冲液电泳 AAT、ADH、ACO、GDH共 4 个酶系统，#4 缓冲液电泳 AMP、CAT、MDH、
6PGD、PGI、PGM、SKD 共 6 个酶系统。最终从 AAT、ADH、ACO、AMP、GDH、MDH、6PGD、PGI、PGM、
MDH、SKD中检测到 26 个酶位点，47 个等位基因，清晰的位点 21 个。
关键词:林芝云杉，同工酶系统，酶位点筛选
中图分类号:S 791. 18，S 722. 3 + 1 文献标识码:A
林芝云杉(Picea likiangensis var． linzhiensis)是
西藏重要的乡土树种和用材树种。为获得林芝云
杉同工酶分析的最佳酶系统和实验方法，本研究
以其种子的胚乳为材料，利用同工酶实验常用的
17 个酶系统(AAT、ADH、ACO、AMP、ACP、
CAT、 EST、 FDH、 GDH、 6PGD、 MDH、 ME、
MNＲ、6PGD、PGI、PGM、SKD)，通过对多种提
取液和电泳 －凝胶缓冲系统进行组合搭配，筛选
出分离良好、谱带清晰的酶系统，以期为进一步
开展林芝云杉群体间遗传变异和种内遗传分化规
律研究提供理论和技术支持。
1 试验材料与方法
1. 1 试验材料
2013年从西藏林芝地区、山南地区的 12 个区
域的林芝云杉天然林中采种，以 12 个群体的混合
种子为试验材料进行随机取样，取样后将种子在室
温下水浸 24h，放在 22 ～ 28℃的培养箱中光照培
养。7天左右，当胚芽伸出胚轴 3 mm 以上，剥取
胚乳，用提取液进行研磨，离心提取蛋白。试验用
淀粉为 Sigma 公司的 S － 5651;凝胶浓度为 12%，
加入 2% ～5%的白砂糖可提高凝胶的分辨率。
1. 2 试验方法
等位酶分离采用水平切片淀粉凝胶电泳方
法［1］。即在试验的前一天制胶，在室温下过夜，
第 2 天上午跑胶。每块胶加 30 个样品，电泳在
4℃冰箱中进行，电泳结束后，凝胶可切割成 4 ～
5 片，染色方法为胶染。
1. 3 酶谱的记录与命名
酶谱带的命名采用基因构成法，按国际通用
的方法记录酶谱上的基因位点和等位基因，由酶
的缩写字母代表该酶系统，连字符后的数字代表
不同位点，把最近阳极的位点标为 － 1，次近阳极
的位点标为 － 2，依次类推;每个基因位点，如果
有多个等位基因，则把最近阳极的标为 a，次近
阳极的标为 b，依次类推。对不代表基因的杂聚
体带，则不予记录。
2 结果与分析
2. 1 提取缓冲液和电泳 －凝胶缓冲液的筛选
提取缓冲液是将各种酶从样品中提取出来，
保持其活性，防止氧化和分解，并避免一些酚类
物质的干扰。植物材料不同，提取缓冲液的效果
不同，因此，选择适当的提取缓冲液和电泳 －凝
胶缓冲系统是提取成败的关键。本试验参考王中
仁［1］的研究结果，选择 3 种提取植物种子同工酶
常用的提取缓冲液(表 1)和 5 种电泳 －凝胶缓冲
液(表 2)，组成系统进行对比试验。
林 业 科 技 第 39 卷
表 1 提取缓冲液及成分
代码 提取缓冲液 成 分
A
Tris － glycine 提
取缓 冲 液 (pH
8. 0)
0. 05mol / l Tris，0. 03mol / l 甘氨酸，
1% PVP，研磨前加入 0. 1% 2 －巯基
乙醇。
B
Tris － HCl 提取
缓冲液(pH 7. 5)
0. 1mol / l Tris，0. 001 mol / l 乙二胺四
乙酸二钠盐(EDTA)，0. 01mol / l KCl，
0. 01mol / l MgCl2 ·6H2O，4% PVP，
研磨前加入 0. 1% 2 －巯基乙醇。
C
简单磷酸提取缓
冲液(pH 7. 5)
0. 1mol / l 磷酸钾缓冲液，5% 蔗糖，
4% PVP，研磨前加入 0. 1% 2 －巯基
乙醇。
表 2 电泳 －凝胶缓冲液及成分
代码
电泳 －凝胶
缓冲液
成 分
a
电泳缓冲液 柠檬酸三钠缓冲液(0. 4mol /L，pH 7. 0)
凝胶缓冲液 L －盐酸组氨酸缓冲液(0. 02mol /L，pH 7. 0)
b
电泳缓冲液
Tris － 柠 檬 酸 缓 冲 液 (0. 223mol /L Tris，
0. 086mol /L柠檬酸，pH 7. 5)
凝胶缓冲液
Tris － 柠 檬 酸 缓 冲 液 (0. 008mol /L Tris，
0. 003mol /L柠檬酸，pH 7. 5)
c
电泳缓冲液
Tris － 柠 檬 酸 缓 冲 液 (0. 223mol /L Tris，
0. 069mol /L柠檬酸，pH 7. 2)
凝胶缓冲液
Tris － 柠 檬 酸 缓 冲 液 (0. 008mol /L Tris，
0. 002mol /L柠檬酸，pH 7. 2)
d
电泳缓冲液
L －组氨酸 －柠檬酸缓冲液(0. 065mol /L 组氨
酸，0. 015mol /L柠檬酸，pH 6. 5)
凝胶缓冲液
Tris － 柠 檬 酸 缓 冲 液 (0. 009mol /L Tris，
0. 002mol /L柠檬酸，pH 7. 0)
e
电泳缓冲液 柠檬酸三钠缓冲液(0. 4mol /L，pH 7. 0)
凝胶缓冲液
L － 盐酸组氨酸缓冲液(0. 005mol /L，pH
7. 0)
2. 1. 1 提取缓冲液的确定
将 3 种提取缓冲液提取的样品，每种取 10 个
放在同一板胶上，再分别用 5 种电泳 －凝胶缓冲
液进行电泳，每种电泳 － 凝胶缓冲液重复 3 次。
经过割胶染色对比研究(表 3)发现:A 提取液对
多数酶效果都较好;C 提取液只能提出 MDH，
AAT，但效果较差;B 提取液可提出 AAT、CAT、
ME、GDH、MDH、PGI、GDH、ME，效果较好。
由于 A提取液适用于多数酶，并且效果较好，所
以采用 A提取液作为林芝云杉同工酶的提取液。
表 3 对比试验提取缓冲液与酶系统
提取缓冲液 酶系统
A
AAT、 ADH、 AMP、 ACO、 CAT、 GDH、 MDH、
ME、G6PD、PGI、PGM、SKD
B AAT、CAT、MDH、ME、G6PD、PGI、PGM、SKD
C AAT、MDH
2. 1. 2 电泳 －凝胶缓冲液的确定
用 5 种电泳 －凝胶缓冲液进行电泳，经过 3
次对比试验发现:用 a 电泳 －凝胶缓冲液电泳的
同工酶，在点样端有一浅带，谱带没有迁移;d
电泳 － 凝胶缓冲液电泳的同工酶，只有 AAT、
MDH有谱带，其他酶都没有谱带;a、c、e 对大
多数酶都有谱带，e 缓冲液电泳的谱带虽最清晰，
但谱带迁移率过快，分辨率不高。
根据上述情况，对 a 和 e 进行改良，其中凝
胶离子浓度在 a和 e 之间设定 0. 01、0. 015 mol /L
两个梯度，电泳缓冲液和凝胶缓冲液的 pH 的值
设为 7. 0、7. 5 两个梯度，共组合成 4 种缓冲系
统，每种重复电泳 3 次，用 60mA稳流电流电泳 5
～ 6 个 h。结果(表 4)发现，当凝胶缓冲液的离子
浓度为 0. 015mol /L、 pH 7. 0 时，AAT、ADH、
AMP、ACO、CAT、GDH这 6 种酶的谱带较清晰，
分辨率也较好;凝胶缓冲液的离子浓度为
0. 015mol /L、 pH 7. 5 时， ADH、 AMP、 CAT、
MDH、6PGD、PGI、6PGM、SKD这 8 种酶谱带的
清晰度和分辨率都较好。
表 4 改良电泳 －凝胶缓冲系统及同工酶系统染色状况
电泳 －凝胶
缓冲液编号
电泳 －凝胶缓冲液 酶系统染色状况
#1
电泳缓冲液:柠檬酸三钠缓冲液(0. 4mol /L，pH 7. 0);
凝胶缓冲液:L －盐酸组氨酸缓冲液(0. 01mol /L，pH 7. 0)
AAT、ADH、AMP、ACO、CAT、GDH 谱带较清晰，分
辨率较高
#2
电泳缓冲液:柠檬酸三钠缓冲液(0. 4mol /L，pH 7. 5);
凝胶缓冲液:L －盐酸组氨酸缓冲液(0. 01mol /L，pH 7. 5)
ADH、AMP、CAT、MDH、G6PD、PGI、PGM、SKD 谱
带较清晰，除了 CAT、ME以外，分辨率较高
#3
电泳缓冲液:柠檬酸三钠缓冲液(0. 4mol /L，pH 7. 0);
凝胶缓冲液:L －盐酸组氨酸缓冲液(0. 015mol /L，pH 7. 0)
AAT、ADH、AMP、ACO、CAT、GDH虽显带，但模糊，
迁移率很小，AAT、CAT几乎没发生迁移
#4
电泳缓冲液:柠檬酸三钠缓冲液(0. 4mol /L，pH 7. 5);
凝胶缓冲液:L －盐酸组氨酸缓冲液(0. 015mol /L，pH 7. 5)
ADH、AMP、CAT、MDH、6PGD、PGI、PGM、SKD 虽
显带，但模糊，CAT、MDH、SKD几乎未发生迁移
2
第 4 期 王福德等:林芝云杉同工酶系统及其位点的选择
2. 2 酶系统及其位点的筛选
经过大量试验，从 17 种酶系统中选出 AAT、
ADH、ACO、AMP、CAT、GDH、MDH、6PGD、
PGI、PGM、SKD共 11 种清晰谱带，其中 10 种分
离良好，CAT的分辨率较差(图 1)。
图 1 筛选出的林芝云杉 11 个酶系统
从上述 11 种酶系统中检测到 26 个酶位点，
其中分离良好、位点清晰的谱带有 21 个(表 5)，
分别为:
AAT有 4 个位点，两个染色区，AAT － 1 有 2
个等位基因，AAT － 2、AAT － 3、AAT － 4 都是
单态。
ADH有 3 个位点，ADH －1 有 4 个等位基因，
ADH －2 有 2 个等位基因，但不稳定，ADH － 3 有
3 个等位基因。
ACO有 1 个位点，2 个等位基因。
AMP有 2 个位点，AMP － 1 有 2 个等位基因，
AMP －2 有 1 个等位基因。
CAT发现一个染色区，迁移率很小，等位基
因数不清楚。
GDH有 2 个位点，GDH －1 有 3 个等位基因，
但谱带不稳定，GDH －2 为单态。
MDH有 3 个位点，MDH － 1 为单态，MDH －
2 有 3 个等位基因，MDH －3 有 3 个等位基因。
6PGD有 2 个位点，6PGD － 1 有 3 个等位基
因，6PGD －2 有 2 个等位基因。
PGI有 2 个位点，PGI － 1 有 2 个等位基因，
不稳定，PGI － 2 有 3 个等位基因。
PGM有 3 个位点，PGM － 1 有 2 个等位基因，
PGM －2 有 2 个等位基因，带不稳定，PGM － 3 为
单态。
SKD有的个体有 3 个位点，有的个体为 2 个
位点，不稳定，SKD － 1、SKD － 2 为单态，SKD
－3 有 2 个等位基因。
表 5 酶系统的名称、编号、缩写、亚基组成、
检测到的位点数和搭配的电泳系统
酶名称与编号 缩写 亚基组成 位点数 电泳系统
天冬氨酸转氨酶 AAT 二聚体 4 个 #3
乙醇脱氢酶 ADH 二聚体 3 个 #3
乌头酸酶水合酶 ACO 单体 1 个 #3
氨基肽酶(E. C. 3. 4. 11. 1) AMP 单体 2 个 #4
CAT －过氧化氢酶(触酶) CAT 四聚体 1 个 #4
谷氨酸脱氢酶 GDH
四或六
聚体
2 个 #3
苹果酸脱氢酶 MDH 二聚体 3 个 #4
6 －磷酸葡萄糖脱氢酶 6PGD 二聚体 2 个 #4
PGl －磷酸葡萄糖异构酶 PGI 二聚体 2 个 #4
磷酸葡萄糖变位酶 PGM 单体 3 个 #4
莽草酸脱氢酶 SKD 单体
2 个
或 3 个
#4
3 讨 论
3. 1 由于 Tris － glycine 提取缓冲液适用于多数酶
系统，效果较好，所以本试验用 A Tris － glycine
提取缓冲液提取林芝云杉种子胚乳中的同工酶。
凝胶 －电泳缓冲液用改良的#3 和#4 缓冲液较为理
想，# 3 凝胶 － 电泳缓冲液电泳 AAT、ADH、
ACO、GDH，#4 凝胶 － 电泳缓冲液电泳 AMP、
CAT、MDH、ME、6PGD、PGI、PGM、SKD。最
后筛选出 11 个谱带清晰、分离良好酶系统，检测
出 26 个位点，检测到 47 个等位基因，其中多态
位点有 16 个，条带稳定可供分析的有 11 个;
SKD －1 为单态，但不稳定，有的个体没有，个体
间存在分化。
3. 2 检测到的等位酶位点数与有关报道的针叶树
种不尽相同，其原因一方面与缓冲系统不同有关;
另一方面与林芝云杉树种本身的特殊性也有关，
即同一个树种生长在不同的生境条件下，经过长
期的进化和选择，为了适应某种环境也会有特异
性的位点存在，与此同时有些无效的位点经过长
3
林 业 科 技 第 39 卷
期的选择也会被淘汰。
参 考 文 献
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［4］ 张含国，杨大海，王凤君，徐桂生，罗玉亮． 红皮云杉同
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第 1 作者简介:王福德 (1979 －)，男，助理研究员，
主要从事林木遗传育种研究工作。
通讯作者:王军辉 (1972 －)，男，研究员，主要从
事楸树与云杉遗传改良。
收稿日期:2014 － 03 － 06
(责任编辑:王 岳)
Isozyme System and Loci Selection of Picea likiangensis var． linzhiensis
WANG Fude
(Forestry Science Ｒesearch Institute of Heilongjiang Province，Harbin 150081)
Abstract Isozymes were exracted from endosperms of the seeds of 12 Picea likiangensis var． linzhiensis
populations to be studied by electrophoresis． The results showed:Tris-glycine was selected for extraction
buffer by the comparison 3 kinds of extraction buffer;3 # and 4 # improving buffer were selected for
electrophoresis gel buffers by the comparison 5 kinds of electrophoresis gel buffers;11 isozymes were
selected by having screened 17 isozymes，because their bands were clear and better separating，they
were AAT，ADH，ACO and GDH with 3 # buffer and AMP，CAT，MDH，6PGD，PGI，PGM and
SKD with 4 # buffer， respectively． Finally，21 loci of 47 alleles were detected clearly from AAT，
ADH，ACO，AMP，GDH，MDH，6PGD，PGI，PGM and SKD．
Key words Picea likiangensis var． linzhiensis;Isozyme systems;Enzyme site selecting
4