全 文 ：第 31卷第 4期 江 西 农 业 大 学 学 报 Vol.31, No.4
2009年 8月 ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis Aug., 2009
文章编号:1000-2286(2009)04-0685-05
江西三清山华东黄杉种群遗传多样性研究
李　艳1 ,鲁顺保1 ,刘晓燕 1, 2 ,江玉梅 1 ,李思光 2 ,朱　笃 1＊
　　(1.江西师范大学 生命科学学院 /江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室 , 江西 南昌 330022;2.南昌大学
生命科学学院 , 江西 南昌 330031)
摘要:采用 ISSR分子标记技术分析江西三清山 5个华东黄杉居群的遗传多样性水平和居群遗传结构。 用 10
个引物对 5个居群共 45个样品进行扩增 , 共得到 76条清晰的扩增带 , 其中 68个位点为多态性位点。在物种
水平上 ,多态性百分率(PPB)为 89.47%, Nei s基因多样性指数(H)为 0.282 7, Shannon s信息多样性指数
(I)为 0.432 2。在居群水平上 , 多态性位点百分率在 56.58% ～ 85.53%, Nei s基因多样性指数为 0.191 3 ～
0.282 7, Shannon s信息多样性指数为 0.290 5 ～ 0.432 2。物种和居群遗传多样性水平都较高 , 居群间产生了
一定的遗传分化(Gst=0.209 0, Υst=14.05%)。由 UPGMA聚类分析可知 , 1 (SGTH)和 2 (LQJ)两个居群优
先聚类 , 4 (LM)和 5 (YJF)聚为一支 ,居群的亲缘关系与地理距离及海拔高度有一定的相关性。
关键词:华东黄杉;ISSR;遗传多样性;江西三清山
中图分类号:S791.16;Q819　　文献标识码:A
ISSRAnalysisoftheGeneticDiversityofPseudotsuga
gausseniFlousofSanqingMountaininJiangxiProvince
LIYan1 , LUShun-bao1 , LIUXiao-yan1, 2 ,
JIANGYu-mei1 , LISi-guang2 , ZHUDu1＊
　　(1.ColegeofLifeSciencesJiangxiNormalUniversity/JiangxiProvincalKeyLabofProtectionandUtili-
zationofSubtropicalPlantResources, Nanchang330022, China;2.SchoolofLifeSciencesNanchangUniver-
sity, Nanchang330031, China)
　　Abstract:PseudotsugagauseniFlouswerecolectedfromSanqingMountaininJiangxiProvince, and
theirgeneticdiversityandgeneticdiferentiationwereanalyzedbyusinginter-simplesequencerepeat(IS-
SR)moleculartechnique.ISSRamplificationwasconductedwith10 primersfor45individualsfrom5popula-
tions, and68 polymorphiclociweredetectedfrom76 loci, indicatinghighgeneticvariationatspecieslevel
(PPB=89.47%, H=0.2827, I=0.4322)andatpopulationlevel(PPB=56.58% ～ 85.53%, H=0.191 3 ～
0.282 7 , I=0.290 5 ～ 0.432 2).Acertainlevelofgeneticdiferentiationoccurredamongpopulations(Gst=
0.209 0, Υst=14.05%).Thedendrogramsofgeneticrelationshipsamongpopulationswereconstructedbased
onNei sgeneticdistance.The1 (SGTH)and2(LQJ)populationsclusteredinaclade, the4(LM)and5
(YJF)populationsclusteredinanothercladetoo.Theresultshowsthatgeneticdistanceisrelatedwithgeo-
graphicdistanceandaltitude.
Keywords:PseudotsugagausseniFlous;ISSR;geneticdiversity;SanqingMountaininJiangxiProvince
收稿日期:2009-01-08　　修回日期:2009-05-20
基金项目:江西省自然科学基金资助项目(0430014)
作者简介:李艳(1983-), 女 ,硕士 , 主要从事植物生态学研究;＊通讯作者:朱笃 , E-mail:zhudu12@163.com。
DOI :10.13836/j.j jau.2009133
　江 西 农 业 大 学 学 报 第 31卷
图 1　华东黄杉 DNA的电泳
Fig.1　TheelectrophoretogramofPseudotsugagausseniFlousgenomic
表 1　三清山华东黄杉居群的来源 、海拔及采样数
Tab.1　Populationslocation, altitudeandsamplenumberof
PseudotsugagausseniFlousfromSanqingMountaininJiangxiProvince
居群 来源 海拔 /km 采样数
1神龟探海(SGTH) 上饶市三清山景区 1 150 13
2泸泉井(LQJ) 上饶市三清山景区 1 250 16
3葫芦湾(HLW) 上饶市三清山景区 1 350 7
4龙门第二关(LM) 上饶市三清山景区 1 450 5
5玉京峰山腰(YJF) 上饶市三清山景区 1 550 4
　　华东黄杉(PseudotsugagauseniFlous)属杉科植物 ,为我国华东地区特有珍稀罕见种 ,列为国家二
级保护濒危植物 ,对研究我国南方植物区系的发生 、演化有重要的意义 。华东黄杉由于硬度适中 ,不翘
不裂且耐久用 ,可作为上等的用材树种 ,具有较高的应用价值而受到学者的广泛重视 [ 1, 2] 。但由于地质
变迁 、生态恶劣 、数量不多 、天然更新能力弱等原因 ,致使此树种成为濒危植物种 。
迄今为止 ,关于华东黄杉的研究不多 ,一些学者仅围绕华东黄杉的大痣小蜂生物学特性进行了初步
的研究 [ 9] ,积累了部分资料 ,但对于华东黄杉的遗传多样性和保护生物学方面的研究未见任何报道。
因此 ,本文通过采用 ISSR分子标记技术[ 3 ～ 8] ,对江西三清山按地理隔离及海拔高度采取的 5个华东黄
杉居群的遗传变异进行分析 ,以期阐明其遗传多样性水平及其动态变化 ,为华东黄杉的保护措施提供科
学依据 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
根据地理位置及海拔高度的自然隔离 ,将江西三清山的分布区分为 5个自然居群 ,即居群 1(神鬼
探海 , SGTH)、居群 2(泸泉井 , LQJ)、居群 3
(葫芦湾 , HLW),居群 4(龙门第二关 , LM),
居群 5(玉京峰山腰 , YJF)。按其分布均匀采
样 ,株数少的居群全部采样。采取当年萌发
的新叶 ,放在保鲜袋中 ,用硅胶干燥 ,带回实
验室后置于 -70 ℃超低温冰箱中保存备用。
各群体所在地及其生境状况见表 1。
1.2　基因组 DNA提取与检测
华东黄杉叶片基因组 DNA采用改良
CTAB法 [ 10]提取 , DNA纯度和含量采用紫外
可见分光光度计测定 。以 8 g/L琼脂糖凝胶
电泳检测所提取 DNA的质量 ,电泳结果 DNA带清晰(图 1)表明 DNA质量较好 。
1.3　PCR扩增与引物筛选
ISSR扩增条件经过优化后确定为 [ 10] :20 μLPCR反应体系中 , 2 μL10×PCR缓冲液 , 1.5 UTaq聚
合酶 , 1.5 ～ 2.5 mmol/LMgCl2 , 0.2 μmol/L引物 , 0.2mmol/LdNTPs, 10 ng/L模板 DNA。最佳扩增反
应程序:94 ℃变性 5 min, 1个循
环;94 ℃变性 30 s, 52 ℃退火
45 s, 72 ℃延伸 2 min, 40个循
环;最后在 72 ℃延伸 5 min, 1个
循环 ,扩增产物在 4 ℃保存 。在
此条件下 ,每个居群选取 1个模
板 ,对由哥伦比亚大学 (UBC)
提供序列 ,上海生工公司合成的
100条 ISSR引物进行筛选。从
中筛选出扩增条带较多 、信号强 、
背景清晰的 10条引物 (表 2)用其中一条引物 U811于 5个居群 24个 DNA样本扩增(图 2)。 PCR产
物在含有 EB的 12 g/L琼脂糖凝胶中电泳 ,以 100 bpDNALadderPlusMarker作为标准分子量对照 ,凝
胶成像系统观察照相 。
1.4　统计分析
1.4.1　居群遗传多样性分析　在琼脂糖凝胶电泳图谱中 ,根据分子量标准对照反应产物在凝胶上的位
置 ,估计扩增产物的分子量大小 。同一 ISSR位点上有电泳带记为 1,无电泳带的记为 0,作 0, 1矩阵输
入计算机。假定种群在这些 ISSR标记位点处于 Hardy-Weinberg平衡状态 ,采用 POPGENE1.31程序[ 11] ,
·686·
第 4期 李　艳等:江西三清山华东黄杉种群遗传多样性研究
图 2　引物 811对华东黄杉部分样品的扩增结果
Fig.2　BandsofPseudotsugagausseniiFlouswithISSRprimer81
表 2　ISSR分析用的 10个引物序列
Tab.2　Sequenceof10 primersusedforISSRanalysis
引物 序列 引物 序列
U808 (AG)8 C U868 (GAA)6
U811 (GA)8 C U873 G(ACAG)3 ACA
U815 (CT)8 G U879 (CTTCA)3
U835 (AG)8 YC U880 (GGAGA)3
U836 (AG)8 YA U881 GGGT(GGGGT)2G
统计下列参数:①多态性位点百分比 (PPB);②各个居群的 Nei s基因多样性指数(H)和 Shannon s
多态性信息指数(I);③基因分
化系数(Gst)和基因流(Nm);④
遗传距离(D)和遗传一致度(I)。
1.4.2　居群内和居群间遗传变
异分析 　分子方差分析 (AMO-
VA)方法可直接对 ISSR等显性
标记的数据进行分析 。计算居群
的表形变异时 ,不依赖各种假设
条件。因此本研究进一步采用
WINAMOVA1.55软件[ 12]对华东
黄杉居群内和居群间的分子变异进行了分析。
1.4.3　聚类分析　用 NTSYS-pc2.10e[ 13]中的 SHAN和 TREE程序对 POPGENE得到的遗传距离矩
阵进行 UPGMA聚类分析 ,建立聚类分支图 。
2　结果与分析
2.1　华东黄杉的 ISSR遗传多样性
从 100条引物中筛选出 10条 ISSR引物 ,对 5个江西三清山的华东黄杉居群的 45个样品进行 ISSR
分析 ,共检测到 76个位点 ,每个引物产生 6 ～ 11个位点不等 ,位点分子量范围均在 300 ～ 3 000 bp,其中 68
个为多态性位点 ,占 89.47%。Nei s基因多样性(H)=0.282 7, Shannon s多态性信息指数 I=0.432 2,各个
居群的 Nei s基因多样性指数在 0.191 3 ～ 0.282 7, Shannon s信息多样性指数为 0.290 5 ～ 0.432 2,
两者与多态性位点百分率变化趋势一致 ,从表 3可以看出三清山华东黄杉居群的遗传多样性较高。
表 3　三清山华东黄杉居群的遗传多样性分析
Tab.3　StatisticalanalysisofgeneticdiversityofPseudotsugagausseniFlousPopulationsinSanqingMountain
亚居群 样品数 多态性位点数 多态性位点比 /% Nei, s基因多样性(H) Shannon指数(I)
1神龟探海 13 60 78.95 0.218 4 0.342 6
2泸泉井 16 65 85.53 0.267 5 0.407 6
3葫芦湾 7 52 68.42 0.2288 0.346 7
4龙门第二关 5 43 56.58 0.191 3 0.290 5
5玉京峰山腰 4 43 56.58 0.220 1 0.323 5
总计 45 68 89.47 0.282 7 0.432 2
2.2　华东黄杉居群间遗传变异的分析
三清山华东黄杉 5个居群间的遗传分化指数 Gst=0.209 0,表明总的遗传变异中有 20.9%的变异
存在于居群间 ,居群内的遗传变异为 79.01%。对 5个居群进行 AMOVA分析 ,结果显示在总的遗传变
异中有 14.05%的变异发生在居群间 , 85.95%的变异发生在居群内(表 4),居群间和居群内变异均为极
显著(P<0.001), 此结果与 popgene中 Nei s分析所得的结果(Gst=0.209 0)大体一致。居群的遗传
分化表明华东黄杉居群间出现了一定的遗传分化。
·687·
　江 西 农 业 大 学 学 报 第 31卷
图 3　三清山华东黄杉居群间遗传距离的 UPGMA聚类图
Fig.3　UPGMAprogramforSanqingmountain5 populationsof
PseudotsuggausseniiFlousbasedonNei sgeneticdistance
表 4　华东黄杉居群内和居群间的 AMOVA遗传多样性分析
Tab.4　Analysisofmolecularvariance(AMOVA)within/amongPseudotsuggausseniFlouspopulations(45 individual)
变异来源 自由度(df.) 均方差(MSD) 变异组分(Gst)/% P
居群间 4 27.216 14.05 <0.001
居群内 40 11.478 85.95 <0.001
2.3　遗传距离与聚类分析
ISSR分析所得的 I值和 D值见表 5。 5个居群中两两间的 I值变化范围为 0.859 9 ～ 0.960 9 , D值
的变化范围为 0.039 9 ～ 0.151 0。 1和 5居群间的遗传距离最大(D=0.151 0), 1和 2居群之间的遗传
距离最小(D=0.039 9)。遗传
一致度与遗传距离相互对应。经
软件 IBD检验表明 ,三清山华东
黄杉群间的遗传距离和地理距离
之间呈现出一定的相关性 ,即地
理距离越近遗传距离越小 ,地理
距离越远遗传距离越大。这可能
是由于地理位置近 ,基因交流频
率高 ,而地理位置远或有大山等
的屏障使基因流在一定程度上受
到阻碍造成的。根据聚类图(图
3),在 5个居群中 ,居群 1与居群
2先为一支 ,再与居群 3聚为一
支 ,最后与居群 4、居群 5聚合支再聚合 。
表 5　华东黄杉 5个居群间遗传一致度 I(右上角)和遗传距离 D(左下角)
Tab.5　Geneticidentityandgeneticdistanceamong5 PseudotsuggausseniiFlouspopulations
PopID 1 2 3 4 5
1 ＊＊＊＊ 0.960 9 0.885 4 0.882 8 0.859 9
2 0.039 9 ＊＊＊＊ 0.924 7 0.915 1 0.910 2
3 0.121 7 0.078 2 ＊＊＊＊ 0.887 3 0.903 2
4 0.124 6 0.088 7 0.119 6 ＊＊＊＊ 0.916 6
5 0.151 0 0.09 4 0.101 8 0.087 1 ＊＊＊＊
3　讨　论
遗传多样性是生物所携带的遗传信息总和 ,是长期进化的产物。一个种群遗传多样性越高或越丰
富 ,适应环境的能力就越强 ,越容易扩展其分布范围和开拓新的环境。物种或种群进化潜力和适应环境
的能力取决于遗传多样性的大小[ 14] 。本研究利用 ISSR技术对江西三清山 5个华东黄杉种群的遗传多
样性进行分析 ,其物种水平的多态位点百分率(P)高达 89.47%、Shannon信息指数(I)为 0.432 2、Nei s
指数(H)为 0.282 7 ,反映出华东黄杉总的遗传多样性丰富 ,处于较高水平 。华东黄杉具有较高的遗传
多样性说明其濒危的原因可能并不是遗传基础的内部因素造成的 ,而是由于地质历史变迁 、生态环境的
恶化和人类破坏性地砍伐导致其分布范围逐渐缩小 、个体数量急剧减小而处于濒危状态。
AMOVA分子变异分析显示 ,在总遗传变异中 14.05%的变异存在于种群间 , 85.95%的变异存在于
种群内 ,种群间的基因分化系数(Gst)为 0.209。表明 5个华东黄杉居群的主要变异存在于种群内 ,但种
群间已出现了一定程度的遗传分化。引起种群遗传分化的原因有两种:一是内因 ,即种群本身的遗传特
性所引起的 [ 15] ,如花粉 、种子的传播方式;另一种是外因 ,即由于环境变化 、人为干扰所引起的隔离 、遗
传变异等[ 16] 。后者包括大的环境变化和由于微环境不同造成的种群遗传分化 。华东黄杉一般 15 a开
花结果 ,可孕种子极少 ,有的甚至全部不孕 ,或胚干瘪被虫害 ,繁殖极其困难 ,再加上华东黄杉的天然更
新能力很弱 ,导致树种株数逐渐减少 。华东黄杉是良好的用材树种和珍贵的观赏物种 ,成年树经常被砍
·688·
第 4期 李　艳等:江西三清山华东黄杉种群遗传多样性研究
伐 ,而幼年树被挖 。由于人为的干扰 ,植被破坏严重 ,引起生境的破碎化 ,各种群之间分布不连续 ,形成
一定程度的隔离 。此外 ,本研究的 5个居群虽然同处在三清山 ,但它们的海拔高度不同 ,相隔距离较远 ,
由此造成不同种群所处位置的温度 、水分 、光照 、土壤等生态因子发生一定的变化 ,不同种群所承受的生
境选择压力有一定的差异 ,最终导致种群间的遗传分化 。
江西三清山 5个华东黄杉种群的 PPB以居群 2 (LQJ)最高 ,居群 1(SGTH)次之 ,居群 4(LM)和居
群 5(YJF)偏低 ,由 I和 H计算的 5个种群遗传多样性高低顺序与 PPB一致 ,基本以高海拔相对较低。
根据华东黄杉种群间的遗传距离 ,采用 UPGMA法对 5个种群进行聚类 ,结果是低海拔的居群 1和居群
2的两个居群先聚在一起 ,再与居群 3相聚 ,高海拔的居群 4和居群 5另外聚为一支。三清山华东黄杉
遗传多样性随着海拔的升高而降低 ,其原因一方面可能是由于取样数少有关;另一方面可能是海拔高度
变化导致的 。因为海拔高度是一种环境梯度 ,海拔升高会导致温度的下降和降雨量的增加 ,温度的下降
可引起植物生活期的缩短和开花 、传粉物候期的延迟 ,从而影响基因交流 ,导致遗传多样性水平的降低。
另外 ,居群 1海拔高度比居群 2低 ,其遗传多样性水平也比居群 2低 ,这是因为居群 1离村庄较近 ,受人
为干扰严重 。人为干扰可能造成很大程度的近亲繁殖 ,增加了整个遗传上的同源性 [ 17] ,使得遗传多样
性丢失 ,遗传多样性一旦损失 ,恢复的速度极慢 ,从而形成目前居群 1遗传多样性较低的格局 。而居群
2海拔相对较高 ,受人为干扰相对较小 ,保持了较高的遗传多样性。
因此 ,需要加强对三清山资源的管理 ,创造优越的森林环境 ,恢复植被 ,建立生物多样性的保护体
系 ,使华东黄杉在群落中逐渐形成优势种 ,开展华东黄杉的引种栽培研究 ,建立华东黄杉的树木园或植
物园 ,为华东黄杉创造适宜条件 ,广泛孕种繁殖 ,持续利用。鉴于居群间存在一定的遗传分化 ,造成一定
的基因流失 ,因此有必要在居群间进行植株和幼苗相互移栽 ,以提高居群间的基因交流 ,最大限度地保
护华东黄杉的遗传多样性 。
参考文献:
[ 1]中国科学院植物研究所.中国珍稀濒危植物 [ M] .第 1版.上海:上海教育出版社 , 1989.
[ 2]宋朝枢.中国珍稀濒危保护植物 [ M] .第 1版.北京:中国林业出版社 , 1989.
[ 3] ZietiewiczE, RafalskiA, LabudaD.Genomefingerprintingbysimplesequencerepeat(SSR)-anhoredpolymerasechainre-
actionamplification[ J] .Genomics, 1994, 20:176-183.
[ 4] TsumuraY, OhbaK, StraussSH.Diversityandinheritanceofinter-simplesequencerepeatpolymorphisminDouglas-fir
(Pseudotsugamenziesii)andsugi(Cryptomeriajaponica)[ J] .TheoreticalandAPPBiedGenetics, 1996, 92:40-45.
[ 5]邹喻苹 , 葛颂 ,王晓东.系统与进化植物学中的分子标记 [ M] .北京:科学出版社 , 2001.
[ 6] KristianH, SigurdMS, UrbanG.Geneticvariationandstructureintheexpandingmosspogonatumdentatum(Polytrichace-
ae)initsareaoforiginandinarecentlycoloniedarea[ J] .AmericanJournalofBotany, 2005, 92:1 684-1 690.
[ 7] ChenL, XuLM, HuangHW.GeneticdiversityandpopulationstructureinValisneriaspinulosa(Hydrocharitaceae)[ J] .A-
quaticBotany, 2007, 86:46-52.
[ 8] HanYC, TengCZ, ZhongS, etal.GeneticvariationandclonaldiversityinpopulationsofNelumbonucifera(Nelumbonace-
ae)incentralChinadetectedbyISSRmarkers[ J] .AquaticBotany, 2007, 86:69-75.
[ 9]章今方 , 胡国良.华东黄杉的大痣小蜂生物学特性初步观察 [ J] .森林病虫通讯 , 1994, 2:8-9.
[ 10]刘晓燕 ,朱笃 , 鲁顺保.华东黄杉 ISSR引物反应体系的优化与筛选[ J].江西农业大学学报 , 2007, 29(6):1 021-1 025.
[ 11] YehFC, YangRC, BoyleTBJ, etal.Theuser-friendlysharewareforpopulationgeneticanalysis.MolecularBiology
andBiotechnologyCentre[ M] .UniversityofAlberta, Canada, 1997.
[ 12] ExcofierL.AnalysisofMolecularvariance.Version1.55.GeneticsandBiometryLaboratory[ M] .UniversityofGeneva,
Switzerland, 1993.
[ 13] RohlfFJ.NTSYS-pc.NumericalTaxonomyandMultivariateAnalysisSystem.Version2.1.ExeterSoftware[ M] .
Setauket, NewYork, 2000.
[ 14]葛颂 ,洪德元.遗传多样性及其检测方法 //钱迎倩 ,马克平.生物多样性研究的原理和方法 [ M] .北京:中国科学技
术出版社 , 1994:123-140.
[ 15] RoweG, BeebeeJJC, BurkeT.PhylogeographyofthenaterjacktoadBufocalamitainBritan:Geneticdiferentiationofn-
ativeandtranslocatedpopulations[ J] .MolecularEcology, 1998(7):1 371-1 381.
[ 16] PearsonLC.TheDiversityandEvolutionofPlants[ M] .NewYork:CRC/Taylor＆FrancisPress, 1995.
[ 17]李进 ,陈可咏 , 李渤生.不同海拔高度川滇高山栎群体遗传多样性的变化 [ J] .植物学报 , 1998, 40(8):761-767.
·689·