全 文 ：第 20 期
收稿日期：2014－05－29
基金项目：国家自然科学基金项目（31060265；31260488）；热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室（海南大学）开放基金项目
（2011hckled－16）
作者简介：尚 啸（1988－），男，河南驻马店人，在读硕士研究生，研究方向为遗传育种，（电话）13698969659（电子信箱）shangx＿09＠163．com；
通讯作者，王 健（1977－），男，副教授，博士。
第 53 卷第 20期
2014 年 10月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 53 No.20
Oct．，2014
三色堇（Viola tricolor L．）属堇菜科（Violaceae）
堇菜属（Viola），又称猫脸花、猫儿脸、鬼脸花，原产
于欧洲，为一二年生花卉，性喜温凉，我国各地均有
栽培。 三色堇品种繁多，色彩鲜艳，花期长且耐寒，
有“花坛皇后”的美誉，深受人们喜爱［1］。三色堇的花
色丰富多彩，有白色、黄色、粉红色、红色、淡紫色、
紫色、杏黄色和橙色等；单朵花有纯色花和复色花
两类，花瓣还常带有条纹、花斑、花边等。 三色堇是
我国重要的花坛和盆栽花卉， 且市场需求量大，国
内外关于三色堇的研究主要集中于其引种栽培研
究和杂交育种工作上［2］。 自 18 世纪 40 年代培育出
具色斑的类型以来，三色堇的育种工作也得到了发
展，但是关于其分子生物学方面的研究还较少。
高质量的 DNA 是进行分子生物学研究的必要
前提，SDS、CTAB 法及其改良方法等是常用的植物
DNA 提取方法 ［3］。 三色堇叶片 DNA 提取方法已有
报道 ［4］，但是总体来看，提取过程比较繁琐，提取效
率比较低， 需时较长， 尚不能满足快速大量提取
DNA用于分子生物学研究的要求。本研究根据前期
试验研究，以三色堇叶片为试验材料，研究了不同
方法提取三色堇总 DNA 的提取效果， 为三色堇分
子水平研究提供技术支持。
1 材料与方法
1．1 试验材料
三色堇种植于自海南大学园艺园林基地，选用
三色堇叶片 DNA不同提取方法比较
尚 啸，王 健，龚 胜，张 珂，孙海燕
（热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室 ／海南大学园艺园林学院，海口 570228）
摘要：以三色堇（Viola tricolor L．）叶片为材料，采用 SDS 法、CTAB 法及改良 CTAB 法分别对三色堇叶片
DNA 进行了提取，并用琼脂糖凝胶电泳和紫外光谱对 DNA 提取质量和浓度进行检测。 结果表明，改良
CTAB 法提取的 DNA 纯度最高， 提取效率较高；SDS 法提取的 DNA 含有较多的蛋白质或糖类杂质；
CTAB 法虽然能够除去蛋白质等杂质，但是 DNA 浓度低于改良 CTAB 法。
关键词：三色堇（Viola tricolor L．）；叶片；产率；纯度
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2014）20－4999-03
DOI：10．14088 ／ j．cnki．issn0439－8114．2014．20．063
DNA Extracting from Viola tricolor L． Leaves
SHANG Xiao， WANG Jian，GONG Sheng，ZHANG Ke，SUN Hai－yan
（Key Laboratory of Protection， Development and Μtilization of Tropical Crop Germplasm Resources of Ministry of Education ／ College of
Horticulture and Landscape， Hainan Μniversity， Haikou 570228，China）
Abstract： High－quality DNA sample is important for plant molecular study． DNA was extracted from Viola tricolor L． leaves
with SDS， CTAB and modified CTAB． The quality and concentration of extracted DNA was detected by agarose gel electrophoresis and
ultraviolet spectrum． The results showed that the purity of DNA extracted with modified CTAB method was the best. DNA extracted with
SDS method contained more impurities including protein or carbohydrate． Although CTAB method removed proteins， DNA concentration
was lower than that with the modified CTAB method． The modified CTAB method was an appropriate， rapid and practical way for
extracting DNA from Viola tricolor L． leaves．
Key words： Viola tricolor L．； leaves； productivity；purity
湖 北 农 业 科 学 2014 年
茎顶端新鲜嫩叶，立即投入液氮冷冻处理，然后放
入－70 ℃冰箱待用。
1．2 方法
1．2．1 不同方法三色堇提取 DNA 取备用的三色
堇嫩叶，用液氮充分研磨后分别称取 0．2 g 粉末于 2
mL离心管中， 分别采用 CTAB 法、 改良 CTAB 法、
SDS 法对样品进行抽提，提取的 DNA 均溶解于 100
μL TE中，每个方法取 3个样品做重复。
1）CTAB法：操作参考文献［5］。
2）改良 CTAB法：将液氮研磨好的嫩叶 0．2 g 转
移至 2 mL离心管中，并加入 1 mL STE缓冲液，混匀
静置 5 min后 5 000 r ／ min 离心 5min。弃上清后加入
预热的 1 mL 2％ CTAB 缓冲液裂解释放 DNA，并加
入 15 μL的 β－巯基乙醇，65 ℃水浴 1 h，每隔 10 min
振荡以便充分裂解， 然后 8 000 r ／ min 离心 10 min；
取上清，加等体积氯仿 ／异戊醇（24∶1）进行抽提，轻
微振荡、 混匀；10 ℃下 10 000 r ／ min 离心 10 min，吸
取上清液，重复 1～3 次。 加入 1 ／ 10 体积的 3 mol ／ L
NaAc 和两倍体积无水乙醇，晾干，用无水乙醇洗涤
后吹干，溶于 100 μL TE中。
3）SDS法：见参考文献［6］。
1．2．2 DNA 质量检测 取 5 μL DNA 样品以 1％
的琼脂糖凝胶进行电泳，同时紫外分光光度计测定
A230 nm、A260 nm、A280 nm。
1．2．3 PCR 扩增检测 根据文献［1］设计了三色堇
actin 基因特异性引物 （正向 5′－CAGTGGTCGTA-
CAACTGGTAT－3′；反向 5′－ATCCTCCAATCCAGA-
CACTGT－3′）。以改良 CTAB 法提取的DNA 作为模
板，PCR 检测提取 DNA 质量。 PCR 反应体系为：
DNA 模板 3 μL，10 ×PCR Buffer 5 μL，25 mmol ／ L
MgCl2 4 μL，2．5 mmol ／ L dNTPs 4 μL，上、下游引物各
4 μL，Taq DNA聚合酶（5 U ／μL） 0．8 μL，无菌水补足
至 50 μL。 PCR 反应程序为：95 ℃预变性5 min；95
℃变性 30 s，56 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，36 个
循环；最后 72 ℃延伸 10 min。
2 结果与分析
2．1 不同提取方法提取 DNA的电泳检测
由图 1 可知，CTAB 法和改良 CTAB 法提取的
DNA 上样孔中几乎无残留物， 杂质少， 条带清晰。
CTAB 法能够将蛋白质、 多糖及一些带正电荷的杂
质去除，提取到较纯的 DNA。 改良 CTAB 法提取的
DNA条带更清晰，提取的 DNA质量更高。而 SDS法
上样孔中残留杂质较多， 而且有轻微的拖尾现象，
表明提取的 DNA 中含有糖类和蛋白质，杂质较多，
且有轻微的降解。从提取时间上来看，改良 CTAB法
提取时间约 3 h， 且在沉淀 DNA 过程中不需要置
于－20 ℃，操作比较简单，而 SDS 法和 CTAB 法均需
约 5～7 h，提取步骤比较繁琐，效率较低。
2．2 产率及纯度检测
由表 1 可以看出， 改良 CTAB 法提取 DNA 的
A260 nm/A280 nm在 1．8～2．0 之间， 表明 DNA 无蛋白质和
RNA污染，DNA纯度高，提取效果较好。SDS法提取
DNA 的 A260 nm/A280 nm在 1．2～1．5 之间，表明 DNA 中有
杂质的影响， 这与 DNA凝胶电泳结果一致。 CTAB
法提取 DNA 的 A260 nm ／A280 nm大于 2．0， 表明有 RNA
残留。 同时，改良 CTAB法提取 DNA的 A260 nm ／A230 nm
大于 2．0，说明该法所得 DNA 糖类、盐类或有机溶
剂少，纯度较高。 同时，从表 1 还可以看出，改良
CTAB 法提取的 DNA 浓度明显大于另外两种方法，
DNA 产率较高。 因此，改良 CTAB 法更适合于三色
堇叶片 DNA的提取。
2．3 PCR检测结果
通过 PCR 扩增得到一条约 1 kb 明亮清晰的
PCR 产物（图 2），表明改良 CTAB 法提取的 DNA 能
用于后期的 PCR分子生物学试验。
3 结论与讨论
植物基因组 DNA 的提取方法很多， 最常见的
提取方法是 CTAB法和 SDS法［7，8］。 SDS和 CTAB都
是一类去污剂，其作用是破坏细胞膜释放 DNA。 这
两种方法对多数植物基因组 DNA 的提取均比较
有效［9－11］。 但对某些特定植物，或不同的器官部位，
提取效果有明显差异，有的适宜用 SDS 法，有的适
宜用 CTAB法。不同植物因其特点不同，所提取效果
表 1 改良 CTAB 法、CTAB 法和 SDS 法提
取 DNA 的浓度和纯度
方法
改良 CTAB 法
CTAB 法
SDS 法
DNA 质量浓度//μg/μL
0.802±0.019
0.428±0.078
0.571±0.087
A260 nm/A280 nm
1.883±0.040
2.158±0.062
1.394±0.089
A260 nm/A230 nm
2.027±0.061
1.806±0.022
1.617±0.028
M：DNA Marker；1~3.改良 CTAB 法提取的 DNA；4~6.CTAB 法
提取的 DNA；7~9.SDS 法提取的 DNA
图 1 不同方法提取三色堇叶片 DNA 的琼脂糖凝胶电泳
1 2 3 M M 4 5 6 7 8 9
5000
第 20 期
图 2 PCR 检测结果
M 1 2 3
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
也有差异。 余晓丽等［12］以黄刺玫的嫩叶为材料，比
较了改良 SDS 法、CTAB 法等对其基因组 DNA 的提
取效果。 结果表明，改良 SDS 法可有效控制材料的
褐变及 DNA 污染， 提取的 DNA 纯度和产率均较
高。 赵喜华等 ［13］用 SDS 法提取杜鹃属基因组 DNA
时，DNA沉淀为淡黄色，纯度过低。 SDS法可能是对
多糖及次生代谢物含量较高植物的 DNA 提取效果
不理想［14］。 而本试验中可能是三色堇含有较多的多
糖及次生代谢物，用 SDS 法提取的 DNA 浓度不高，
并且带有颜色，DNA 凝胶电泳后，点样孔很亮，可能
是 DNA 中残留有较多的蛋白质及多糖等杂质，SDS
法提取步骤相对繁琐且耗时长。
CTAB 法通过改变盐浓度选择性地沉淀 DNA，
可早期去除色素、多糖类杂质，避免 DNA 与其共沉
淀后再难分离而得到较纯的 DNA［15］。但由于使用盐
浓度改变沉淀 DNA 会使 DNA 沉淀不完全，收率会
较低。 一般而言，CTAB法比较适用于草本植物和不
含酚类或含酚类较少的植物 DNA 提取 ［16］，但在进
行 DNA提取时，应当确定植物材料和 CTAB 提取液
的最佳比例， 提高 CTAB浓度不一定能提到高质量
的 DNA， 加入 CTAB 过多或过少都会影响 DNA 的
提取效果，可能不能彻底去除蛋白质，点样孔杂质
较多［17，18］。三色堇叶片的酚类物质含量较高，在磨样
过程中，叶片中的酚类物质会释放出来，易褐变 ［19］，
在提取中加入 β－巯基乙醇和 PVP 可以抑制叶片中
酚类物质的氧化［20］。使用 CTAB法提取 DNA时，水浴
时间至少需要 30 min， 过短的水浴时间会造成DNA
得率的下降，而过长的水浴时间，如超过 90 min，则
可能会引起 DNA 的降解， 或者最终产物中增加其
他杂质，因此，适宜的水浴时间为 45～60 min［21］。
本试验中改良 CTAB 法加入了 STE 缓冲液，使
DNA中混入杂质的几率大大减低，所得的 DNA纯度
较高。且此法在沉淀 DNA过程中不需要置于－20 ℃，
在加入 NaAc 和无水乙醇后，絮状物的 DNA 沉淀清
晰可见。改良 CTAB法步骤简单，且能有效地去除多
糖、酚类和蛋白质等物质，在短时间内获得纯度高、
完整性好的 DNA，节省了时间，整个提取过程大约
3 h， 比 SDS法和 CTAB 法的时间都有较大缩短，极
大地提高了提取效率，且能够进一步满足分子生物
学的试验要求， 是快速大量提取三色堇叶片 DNA
的理想方法。 同时，该方法也对其他植物叶片 DNA
的提取提供了一定的借鉴。
在 DNA 提取过程中， 影响提取效果的因素很
多，如叶片研磨时间的长短，吸取上清液时是否吸出
下层蛋白质以及混匀振荡程度高低等［22］。 本试验中
三色堇 DNA 提取结果在尽量使各种因素影响程度
最小的情况下进行， 因此想要获得高质量的 DNA，
除了注意选择提取方法外， 还应进行严格的技术操
作。
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［22］ 卢东柏，李晓方，刘志霞．改良 SDS 法提取棉花基因组 DNA 研
究［J］．广东农业科学，2008（5）：14－16．
（责任编辑 屠 晶）
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
收稿日期：2014－02－19
基金项目：国家自然科学基金项目（41175077）；黔科合重大专项［字（2011）6003 号］
作者简介：张 眉（1983－），女，浙江湖州人，硕士，主要从事气候灾害风险及损失评估研究，（电话）18351811695（电子信箱）zm96121＠163．com。
第 53 卷第 20期
2014年 10月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 53 No.20
Oct．，2014
基于模糊综合评价法的浙江省台风灾害农田
损失评估分析
张 眉1，金有杰 2，王 倩 3
（1．浙江省气象服务中心，杭州 310017；2．水利部南京水利水文自动化研究所，南京 210012；
3．南京信息工程大学经济与管理学院，南京 210044）
摘要：引入模糊综合评价模型计算浙江省 1983~2007 年共 53 个台风案例的影响评价指数，运用均值－标
准差分级法对浙江省历史台风灾害影响强度进行等级划分， 并将该指数与实际农田损失面积进行了回
归分析，拟合农田损失面积预评估模型，相关系数达到 0．642。 该模型通过实际验证表明能较好地预估农
田受灾面积，为农业防灾减灾提供参考。
关键词：模糊综合评价法；台风灾害；农田损失评估；浙江省
中图分类号：X43；P429 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2014）20－5002－05
DOI：10．14088 ／ j．cnki．issn0439－8114．2014．20．064
Loss Assessment of Farmland from Typhoon Disasters Based on Fuzzy
Comprehensive Evaluation in Zhejiang Province
ZHANG Mei1， JIN You－jie2，WANG Qian3
（1． Meteorological Service Center of Zhejiang， Hangzhou 310017，China；
2． Nanjing automation institute of water conservancy and hydrology，ministry of water resources， Nanjing 210012，China；
3． School of Economics ＆ Management， Nanjing University of Information Science and Technology， Nanjing 210044，China）
Abstract： The fuzzy comprehensive evaluation model was used to calculate assessment indexes of 53 typhoon cases occurred
in Zhejiang province from 1983 to 2007． The mean－standard deviation classification method was used to make classification
for historical influence intensity of typhoon disasters in Zhejiang province and the indexes and the actual loss area of
farmland were used for regression analysis． Pre－assessment model of the loss area of farmland was fitted and the correlation
coefficient was 0．642． The model through actual examination showed that the affected area of farmland could be better pre－
assessed to provide reference for prevention and mitigation of agricultural disaster．
Key words： fuzzy comprehensive evaluation；typhoon disaster；loss assessment of Farmland；Zhejiang province